瘢痕疙瘩组织p53基因突变的实验研究

目的：分析瘢痕疙瘩中p53基因第4—8外显子的突变及其意义。方法：取手术切除的瘢痕疙瘩和正常瘢痕各12例，并分别取同一患者正常皮肤对照，采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析方法(PCR-SSCP)和基因测序，检测各组织p53基因的突变情况。结果：12例瘢痕疙瘩标本中有9例p53基因外显子4、5、6、7出现点突变和移码突变，正常瘢痕标本、正常皮肤标本均未检出突变。结论：p53基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。     

多重PCR-SSCP检测人瘢痕疙瘩Fas基因突变

目的 建立多重PCR-SSCP反应体系，以筛选瘢痕疙瘩Fas基因突变。方法 按照多重PCR引物设计原则设计相应引物，经分析、实验得到理想的多重PCR扩增条件，以此条件扩增目的基因；将所得PCR反应产物在单基因对照下进行银染多重SSCP分析，进而筛选基因突变。结果外显子6，8，9的单一PCR反应产物及多重PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳，各条带清晰，无非特异性扩增，且产量较高，产物的长度与理论值相符；经银染多重SSCP分析．正常皮肤组织和增生性瘢痕中均未检出突变，在23例瘢痕疙瘩标本中，18例出现异常电泳带。结论 本实验建立了用以分析瘢痕疙瘩Fas基因突变的多重PCR-SSCP方法。分析结果提示：瘢痕疙瘩组织中Fas基因的突变可能与该病的发生有密切关系；多重PCR-SSCP是检测基因点交变的一种快速、敏感、有效的方法．     

瘢痕疙瘩家系Fas基因死亡域突变的实验研究

目的 探讨瘢痕疙瘩家系标本中Fas基因（外显子7～9）有无突变以及Fas基因突变在瘢痕疙瘩形成中的意义。方法 实验标本来自南方医科大学南方医院整形外科2005年收集的A、B两个瘢痕疙瘩家系。采用PCR及基因测序技术，分别以A家系2例男性患者的瘢痕疙瘩组织为研究对象，以其周围正常皮肤及外周静脉血作为自身对照，其配偶的外周静脉血作为正常对照，并以B家系2例患者（母亲与儿子）的外周静脉血作为不同家系之间的对照，共检测10份标本中Fas基因外显子7～9基因序列。结果 10份瘢痕疙瘩家系标本Fas基因的7、8外显子均未发生突变，2例瘢痕疙瘩组织标本均在外显子9编码区的11bp和53bp两个位点上存在单个碱基基因突变或多态性改变。结论 瘢痕疙瘩Fas基因死亡域外显子9区段的基因结构异常，极有可能与Fas蛋白的功能改变有关，从而导致局部瘢痕疙瘩形成。     

瘢痕疙瘩p53基因突变高发区基因结构的研究

目的 探讨p53抑癌基因在病理性瘢痕组织中的结构异常与临床病理的关系。方法 采用PCR-SSCP及基因测序技术，以增生性瘢痕及正常皮肤为对照，检测瘢痕疙瘩组织标本p53基因突变高发区外显子4～6的基因结构。结果 瘢痕疙瘩p53基因外显子4、5、6均存在突变，对照组未发现突变。结论 提示瘢痕疙瘩p53基因抑制细胞进程及介导细胞凋亡等功能丧失。     

多重PCR-SSCP检测人瘢痕疙瘩Fas基因突变

目的建立多重PCR-SSCP反应体系,以筛选瘢痕疙瘩Fas基因突变.方法按照多重PCR引物设计原则设计相应引物,经分析、实验得到理想的多重PCR扩增条件,以此条件扩增目的基因;将所得PCR反应产物在单基因对照下进行银染多重SSCP分析,进而筛选基因突变.结果外显子6,8,9的单一PCR反应产物及多重PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳,各条带清晰,无非特异性扩增,且产量较高,产物的长度与理论值相符;经银染多重SSCP分析,正常皮肤组织和增生性瘢痕中均未检出突变,在23例瘢痕疙瘩标本中,18例出现异常电泳带.结论本实验建立了用以分析瘢痕疙瘩Fas基因突变的多重PCR-SSCP方法,分析结果提示瘢痕疙瘩组织中Fas基因的突变可能与该病的发生有密切关系;多重PCR-SSCP是检测基因点突变的一种快速、敏感、有效的方法.     

瘢痕疙瘩Fas基因外显子8突变序列分析

目的探讨Fas基因缺失在瘢痕疙瘩形成中的意义.方法采用PCR-SSCP银染技术及基因序列分析,检测15个瘢痕疙瘩标本Fas基因外显子8的基因结构.结果所检测的15个瘢痕疙瘩标本100%有Fas基因外显子8的杂合丢失,基因测序发现11个标本共4个位点存在基因突变.结论瘢痕疙瘩Fas基因外显子8的基因结构异常与其编码的蛋白无功能关系密切.     

瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变的研究

目的　探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞中 p5 3基因第 4～ 8外显子的突变规律及其意义。　方法　取瘢痕患者手术切除的瘢痕疙瘩和增生性瘢痕标本各 12例 ,并设患者自身正常皮肤标本及血标本为对照。体外分离、培养上述组织标本的成纤维细胞。采用聚合酶链式反应 单链构象多态性(PCR SSCP)分析方法和基因测序法 ,检测各种组织成纤维细胞中p5 3基因的突变情况。　 结果　 12例瘢痕疙瘩标本中有 9例p5 3基因外显子 4、5、6、7出现点突变和移码突变 ,增生性瘢痕标本、正常皮肤标本及血标本中均未检出突变。　结论　p5 3基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。     

Fas介导瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞凋亡及其基因检测研究

目的　探讨瘢痕疙瘩周围皮肤中是否有生物学活性异常成纤维细胞 ,以期进一步了解瘢痕疙瘩的发展机制。方法　所取新鲜组织标本进行细胞培养 ,通过碘化丙啶 (PI)染色、激光流式细胞仪比较不同浓度Fas单克隆抗体 (FasMcAb ,0～ 10 0 0 μg/L)作用后各组成纤维细胞凋亡率。采用聚合酶链反应 (PCR)技术对Fas基因外显子 8进行DNA扩增并测序。结果　FasMcAb作用2 4h后 ,瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度段均不能凋亡 ,瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞随FasMcAb作用浓度的增加凋亡率虽有所增加 ,但总体比较与瘢痕疙瘩差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,而与正常皮肤差异有显著性 (P <0 .0 1)。瘢痕疙瘩周围皮肤 6例标本中有 4例 (4 /6)Fas基因外显子 8及其下游序列存在点突变及移码突变 ,均与同患者瘢痕疙瘩细胞基因序列分析结果一致 ,而两组正常皮肤成纤维细胞则未发现有任何形式的基因突变。结论　瘢痕疙瘩周围 0 .5cm皮肤内存在生物学活性异常细胞 ,这可能为瘢痕疙瘩浸润性生长的结果及其治疗后易复发的原因之一。     

瘢痕疙瘩家系p53基因高发突变区基因突变检测的实验研究

目的探讨瘢痕疙瘩家系样本中有无p53基因高发突变区的基因（外显子4—8）突变以及与瘢痕疙瘩发病的关系。方法采用PCR及基因测序技术，以家系患者的瘢痕疙瘩组织及其周围正常皮肤、外周静脉血为研究对象。以家系中外来正常成员外周静脉血为正常对照，检测p53基因外显子4—8的基因序列。结果所有被检测样本的p53基因外显子4—8均未发现突变。结论瘢痕疙瘩家系样本中。p53基因突变与散发性瘢痕疙瘩患者的p53基因突变有很大的区别。提示p53基因可能与瘢痕疙瘩家系的发病无关。     

瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞周期分析及P53基因突变检测

目的：探讨瘢痕疙瘩周围皮肤中是否有生物学活性异常的成纤维细胞， 以期进一步了解瘢痕疙瘩的发展机制。方法：对所取新鲜组织标本进行细胞培养，通过碘化丙啶（PI）染色，激光流式细胞仪分析细胞周期，比较各组成纤维细胞处于增殖期细胞的百分比。采用PCR技术对P53基因外显子4、5、6进行扩增并测序。结果：瘢痕疙瘩周围皮肤增殖期成纤维细胞百分比与瘢痕疙瘩中央部相似（P＞0．05），介于瘢痕疙瘩边缘部与正常皮肤之间，与两者的差异均有显著性意义（P＜0．05）。所有体外培养瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞（6／6）均存在P53外显子4的点突变，3例（2／6）P53外显子5存在移码突变，均与同病人瘢痕疙瘩成纤维细胞基因突变一致，而两组正常皮肤成纤维细胞则未发现有任何形式的基因突变，结论：瘢痕疙瘩周围0.5cm皮肤内存在生物学活性异常成纤维细胞，这可能为瘢痕疙瘩浸润性生长的结果及其治疗后易复发的原因之一。     

瘢痕疙瘩Fas基因外显子8突变序列分析

目的 探讨Fas基因缺失在瘢痕疙瘩形成中的意义。方法 采用PCR—SSCP银染技术及基因序列分析，检测15个瘢痕疙瘩标本Fas基因外显子8的基因结构。结果 所检测的15个瘢痕疙瘩标本100％有Fas基因外显子8的杂合丢失，基因测序发现11个标本共4个位点存在基因突变。结论 瘢痕疙瘩Fas基因外显子8的基因结构异常与其编码的蛋白无功能关系密切。     

多重PCR-SSCP检测人瘢痕疙瘩Fas基因突变

目的　建立多重PCR -SSCP反应体系 ,以筛选瘢痕疙瘩Fas基因突变。方法　按照多重PCR引物设计原则设计相应引物 ,经分析、实验得到理想的多重PCR扩增条件 ,以此条件扩增目的基因 ;将所得PCR反应产物在单基因对照下进行银染多重SSCP分析 ,进而筛选基因突变。结果　外显子 6 ,8,9的单一PCR反应产物及多重PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳 ,各条带清晰 ,无非特异性扩增 ,且产量较高 ,产物的长度与理论值相符 ;经银染多重SSCP分析 ,正常皮肤组织和增生性瘢痕中均未检出突变 ,在 2 3例瘢痕疙瘩标本中 ,18例出现异常电泳带。结论　本实验建立了用以分析瘢痕疙瘩Fas基因突变的多重PCR -SSCP方法 ,分析结果提示 :瘢痕疙瘩组织中Fas基因的突变可能与该病的发生有密切关系 ;多重PCR -SSCP是检测基因点突变的一种快速、敏感、有效的方法     

散发性乳腺癌中BRCA1和BRCA2基因突变的研究

目的检测BRCA1和BRCA2基因在散发性乳腺癌中的突变情况,探讨BRCA1和BRCA2基因突变与乳腺癌的关系。方法选取2000年12月至2005年9月收治的144例乳腺癌患者标本作实验组,另取非癌乳腺组织标本30例作对照组。用酚-氯仿抽提法提取DNA。针对各个外显子的碱基序列特征,设计有助于筛查基因碱基突变的聚合酶链反应（PCR）引物。每例DNA标本均用PCR扩增BRCA1基因的全部22个外显子和BRCA2基因的exon10和exon14两个外显子。分别将每例外显子的PCR扩增产物进行单链构象多态性分析,对泳动变位或出现异常区带的PCR扩增产物进行DNA测序。结果对照组未检测出BRCA1和BRCA2基因突变,实验组中检测出20例BRCA1基因碱基改变,总突变率为13．9％,其中错义突变率为11．1％。BRCA2基因exon10和exon14未检测出突变。结论BBCA1突变与乳腺癌密切相关,筛查BRCA1基因突变对于中国人群乳腺癌患病风险评估、早期诊断及基因治疗具有重要意义。     

非小细胞肺癌中上皮生长因子受体基因19位点和第21位点突变的发生与临床因素的关系

目的 探讨非小细胞肺癌中上皮生长因子受体(EGFR)19及21位点的基因突变的发生率和突变类型及其与临床因素的相关性.方法 收集115例患者的临床资料;收集该115例患者的肺癌组织(鳞癌61例,腺癌54例),对组织DNA中EGFR外显子19和21基因突变检测;分析与临床因素的相关性.结果 19和21位点突变腺癌患者突变率(45.8%)高于鳞癌患者(22.4%),非吸烟者、支气管肺泡癌的患者高.21位点突变中女性高于男性(17.3%＞9.5%,P＜0.05).结论 EGFR突变发生率约占肺癌总数的1/3,其中19位点及21位点突变分别为19.1%和13.0%,EGFR突变于非吸烟、肺腺癌和细支气管肺泡癌中突变多见,与性别无明显相关性,21位点突变于女性多见.     

Src蛋白在伊马替尼继发耐药的胃肠道间质瘤中的表达及意义

目的 分析Src蛋白在伊马替尼继发性耐药的胃肠道间质瘤组织中的表达,探讨GIST中除c-kit基因二次突变外伊马替尼耐药的可能机制.方法 收集2009年1月至2013年9月手术切除留存标本,术后伊马替尼辅助治疗过程中出现继发性耐药,但因肠梗阻及消化道出血接受二次手术的GIST患者19例,继发性耐药GIST二次手术切除的肿瘤组织行kit基因常见突变位点检测,Western blot和免疫组织化学检测组织中Src及p-Src蛋白的表达,以20例术前伊马替尼新辅助治疗的GIST及25例未治疗直接手术GIST分别设为阳性及阴性对照,并分析其基因与蛋白差异.结果 耐药组c-kit基因外显子11突变者17例,（其中4例同时合并外显子13突变,1例外显子17突变,2例外显子14突变,2例外显子18突变,此9例患者第一次手术标本均为单独的c-kit基因外显子11突变）,外显子9突变2例.阳性对照组中c-kit基因原发突变者20例,其中17例外显子11,3例外显子9突变.阴性对照组中c-kit基因原发突变者25例,其中18例外显子11突变,7例外显子9突变.Western blot发现Src蛋白相对表达水平在阴性对照组、阳性对照组及耐药组中分别为0.50±0.05、0.54±0.04及0.59±0.05,差异无统计学意义.p-Src蛋白的表达在阴性对照组、阳性对照组及耐药组中的表达分别为0.23±0.02,0.31±0.01及0.61±0.02,耐药组中p-Src蛋白表达较阳性及阴性对照组明显增加（P〈0.05）,与此同时阳性对照组p-Src的表达较阴性对照组升高（P〈0.05）.免疫组织化学检测Src蛋白表达的平均A值在阴性对照组、阳性对照组及耐药组分别为0.45±0.03、0.71±0.02及0.73±0.02,差异无统计学意义（P〉0.05）;p-Src蛋白表达的平均A值在阴性对照组、阳性对照组及耐药组分别为0.21±0.01、0.40＋0.02及0.72±0.01,耐药组中p-Src蛋白表达明显增加,差异具有统计学意义（P〈0.05）.两种检测方法亚组分析显示无基因二次突变的患者Src蛋白和p-Src表达与二次突变组的表达水平无明显区别.结论 Src蛋白磷酸化可能在c-kit基因二次突变以外的GIST耐药机制中发挥作用,p-Src蛋白检测能为GIST的继发性耐药提供新的研究靶点.