不同方法提取血清总RNA的性能评价

目的 评价3种方法提取血清总RNA的性能.方法 分别用Trizol法、磁珠总RNA提取法(磁珠法)、柱式总RNA提取法(柱式法)提取血清总RNA.通过测定样品OD260/OD280值评价提取的总RNA纯度、产量;通过设计引物及TaqMan探针扩增总RNA的管家基因(GAPDH),以观察各方法提取的总RNA用于RT-PCR的效果.结果 3种方法提取总RNA纯度分别为Trizol法(1.83±0.19)、磁珠法(1.94±0.11)、柱式法(1.92±0.12);扩增管家基因GAPDH,其Ct值分别为Trizol法(19.37±3.51)、磁珠法(18.33±1.11)、柱式法(18.85±1.20).结论 磁珠法、柱式法明显优于Trizol法,磁珠法与柱式法结果 差异无统计学意义(P>0.05).     

不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA

背景：目前文献报道的软骨RNA提取有多钟方法,国内文献报道多为经典Trizol法,在实验中发现该方法提取的RNA并不能满足后续实验的需要。目的：探索不同方法提取SD大鼠软骨组织总RNA的区别。方法：选取3月龄SD大鼠9只,分别采用Rneasy Lipid Tissue Kit、RNAout试剂盒和经典Trizol法对软骨组织进行总RNA提取,并通过RNA琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,以探寻软骨总RNA最佳提取方案。结果与结论：Trizol法提取的RNA A260/A280值为1.58,说明纯度不高;RNAout法提取的RNA,由于软骨含有大量的蛋白多糖和胶原,也不能满足后续实验的需要;RNeasyMini Kit法和肝（Trizol）法提取RNA的A260/A280值分别为2.00和1.98,说明提取的总RNA或核酸的纯度高。RNA的完整性电泳结果显示,RNeasyMini Kit法、RNAout法和肝（Trizol）法可见28 s、18 s及5 s条带,而Trizol法未见任何条带,RNAout法28 s和18 s条带不清楚。结果提示Rneasy Lipid Tissue Kit法获得的总RNA纯度高、完整性和稳定性好,并能成功反转录合成双链c DNA,而RNAout试剂盒和经典Trizol法获得的总RNA不能满足后续实验需要。     

长期冻存和新鲜胃癌组织总RNA提取方法的比较

背景:目前两种最可靠、应用最广的高通量RNA分离技术是基于异硫氰酸胍-酚︰氯仿的RNA分离技术和基于硅胶柱的RNA分离技术。在临床应用非常有限的组织材料时,有必要对RNA分离技术的可重复性和可靠性分别进行先期评价。目的:系统比较采用硅胶柱法和Trizol法从冻存、新鲜胃癌组织中分离总RNA的效果。方法:硅胶柱法和Trizol法分别提取长期-80℃冻存的(2年以上)和新鲜胃癌组织总RNA,紫外分光光度法比较RNA纯度,琼脂糖凝胶电泳分析28S和18S吸光度比值,进一步通过实时反转录-聚合酶链反应对扩增距mRNApolyA尾端不同大小片段的Ct值进行比较,间接判断不同大小mRNA的拷贝数及完整性。结果与结论:硅胶柱技术和Trizol方法在总RNA提取的纯度方面都表现很好。然而在RNA完整性方面,基于硅胶柱技术的提取方法要好于Trizol法,因为其核糖体RNA形式完好而且更好地保持了不仅短的及中等大小片段,对于较大的mRNA片段也保持更好。另外,与新鲜组织相比,长时间冻存对胃癌组织总RNA提取的影响很小。     

AIDS患者培养检出白假丝酵母菌的分布特点及其耐药分析

目的探讨白假丝酵母菌在获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者培养标本中的分布特点及其耐药状况,为临床诊断及治疗提供依据。方法采集患者体液标本进行分离培养,并对分离出白假丝酵母菌的菌株进行药敏实验。结果白假丝酵母菌分布比例在粪便中最高,占43.6%,咽拭子次之,占26.2%;白假丝酵母菌对伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的最小抑菌浓度(MIC)范围分别为0.06~8、0.125~4、1~128、0.5~1以及1~32μg/mL,耐药率分别14.5%、19.4%、16.5%、0.0%、1.9%。结论对AIDS患者进行多种标本类型的真菌培养可提高白假丝酵母菌检出率,两性霉素B及氟胞嘧啶可作为白假丝酵母菌感染治疗的首选药物。     

高效快速提取股骨头中总RNA的方法

背景：从骨组织中有效提取总RNA是进行骨科相关实验的基础,目前所知方法的提取效果不理想。目的：探寻一种高效、快速的骨组织总RNA提取方法。方法：取健康大耳白兔股骨头迅速置于用液氮预冷过的研钵中,液氮中反复研磨至粉末状,再将其移至预冷的匀浆器内,加入Trizol,充分匀浆后4℃离心,取上清,加入氯仿离心,使RNA与细胞DNA、蛋白质及其他成分分离从而得到总RNA。另取兔股骨头,按传统方法取材后保存,无匀浆过程,传统Trizol法提取总RNA作为对照。紫外分光光度计测定RNA样品浓度、纯度及产率。甲醛变性胶电泳观察RNA的28S,18S条带是否清晰,有无降解和DNA污染。结果与结论：实验方法提取的总RNA浓度在0.80～0.90g/L,A260/A280在1.90～2.00之间,A260/A230在1.4～1.6之间,明显高于传统方法提取的RNA各指标,说明实验方法提取的总RNA纯度高,无DNA、蛋白质污染。甲醛变性胶电泳可清晰显示28S,18S两条带,大体观察其比例大约为1：1,证实RNA提取完整,没有降解。由此可见,实验方法提取的骨组织总RNA质量高,提取方法方便、快捷,可用于骨组织分子生物学研究。     

高效快速提取股骨头中总RNA的方法

背景:从骨组织中有效提取总RNA是进行骨科相关实验的基础,目前所知方法的提取效果不理想。目的:探寻一种高效、快速的骨组织总RNA提取方法。方法:取健康大耳白兔股骨头迅速置于用液氮预冷过的研钵中,液氮中反复研磨至粉末状,再将其移至预冷的匀浆器内,加入Trizol,充分匀浆后4℃离心,取上清,加入氯仿离心,使RNA与细胞DNA、蛋白质及其他成分分离从而得到总RNA。另取兔股骨头,按传统方法取材后保存,无匀浆过程,传统Trizol法提取总RNA作为对照。紫外分光光度计测定RNA样品浓度、纯度及产率。甲醛变性胶电泳观察RNA的28S,18S条带是否清晰,有无降解和DNA污染。结果与结论:实验方法提取的总RNA浓度在0.80～0.90g/L,A260/A280在1.90～2.00之间,A260/A230在1.4～1.6之间,明显高于传统方法提取的RNA各指标,说明实验方法提取的总RNA纯度高,无DNA、蛋白质污染。甲醛变性胶电泳可清晰显示28S,18S两条带,大体观察其比例大约为1:1,证实RNA提取完整,没有降解。由此可见,实验方法提取的骨组织总RNA质量高,提取方法方便、快捷,可用于骨组织分子生物学研究。     

白假丝酵母菌随机扩增多态DNA分型及其流行趋势分析

目的:探讨采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析临床分离的白假丝酵母菌分型结果及其流行趋势。方法:选用不同的引物、Mg~(2+)、模板浓度、Taq聚合酶用量等,获得一优化的反应体系以对白假丝酵母菌进行RAPD分型。结果:经优化的RAPD方法能将105株白假丝酵母菌菌株分成8个基因型。结论:结果显示该方法的可分型性、灵敏度、重复性及特异度均较良好,可对白假丝酵母菌快速、简便地进行基因分型,可广泛应用于流行病学调查与研究。     

白假丝酵母菌致食物中毒的病原学鉴定及药敏试验结果的报告

目的明确白假丝酵母菌的鉴定过程,探寻治疗白假丝酵母菌致食物中毒的药物。方法收集16例食物中毒者吐、泻物标本及剩余饭菜,酱油。白假丝酵母菌的鉴定用快速微生物鉴定系统(API)20C Aux V3.0;药敏试验用FUNGUS-11药敏最低抑菌浓度(MIC)测定试验条。结果检样呕吐物、水样便、剩菜、酱油中检出白假丝酵母菌,食物中毒主要是白假丝酵母菌引起的,白假丝酵母菌对两性霉素B和制霉菌素敏感。结论综合流行病学调查、临床症状、实验室鉴定结果,确定该次食物中毒由白假丝酵母菌引起;首选治疗药物为两性霉素B和制霉菌素。     

白假丝酵母菌耐吡咯类药物的ERG11基因分析

目的 研究白假丝酵母菌耐吡咯类药物的ERG11的变异情况.方法 将93例诊断为真菌性阴道炎的患者的阴道分泌物标本进行真菌培养,筛选白假丝酵母菌菌株,利用纸片扩散法进行氟康唑、酮康唑、咪康唑药敏试验,用加热裂解法提取菌株DNA,扩增ERG11基因,扩增后的PCR产物进行双向测序,测序结果与GenBank中的标准序列（SC5314）比较分析.结果 93例均培养出假丝酵母菌,包括60株白假丝酵母菌,19株热带假丝酵母菌,9株克柔假丝酵母菌和5株光滑假丝酵母菌;白假丝酵母菌对氟康唑、酮康唑、咪康唑耐药率分别为13.33%,20.00％和51.67％;对白假丝酵母菌的ERG11基因测序发现存在25个碱基突变位点,其中13个同义突变,12个错义突变,其中有6个是新变异：V36F,V51L,T123I,E194K,Y257H和K344N.结论 耐吡咯类药物白假丝酵母菌ERG11基因有多个错义突变位点,其中某些位点突变导致的氨基酸变异可能与其耐药性产生有关.     

外阴阴道假丝酵母菌病致病菌株分布和抗真菌药敏分析

目的 探讨外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)致病菌株分布和药敏情况.方法 对2011年1月至2012年6月,本院门诊阴道分泌物真菌培养阳性的患者进行菌株调查及药敏分析.结果 VVC致病菌株白假丝酵母菌占85.0％(311/366),非白假丝酵母菌占15.0％(55/366);氟康唑和克霉唑敏感率较高.结论 VVC致病菌株仍以白假丝酵母菌占优势.氟康唑和克霉唑两种药物联合使用可在局部和全身具有强力抗真菌活性能力,通过药物协同作用提高疗效.VCC治疗过程中应根据抗真菌药物敏感性试验结果指导临床合理用药,避免药物滥用.     

致外阴阴道假丝酵母菌病白假丝酵母菌对9种抗真菌药物最低抑菌浓度测定

目的检测引起外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)的白假丝酵母菌对9种抗真菌药物的耐药性,为临床治疗VVC提供参考依据。方法常规培养分离真菌,并鉴定到种,采用最低抑菌浓度法对白假丝酵母菌进行体外药物敏感试验。结果培养分离的41株菌中,白假丝酵母菌占87.8%,光滑假丝酵母菌占4.87%,季也蒙假丝酵母菌占2.43%,近平滑假丝酵母菌占2.43%,热带假丝酵母菌占2.43%;36株白假丝酵母菌耐药率由高到低依次是伊曲康唑、氟康唑、咪康唑、酮康唑、益康唑、5-氟胞嘧啶、克霉唑、两性霉素、制霉菌素,其中7种药物耐药率大于50%。结论白假丝酵母菌仍是造成VVC的最常见致病菌,耐药现象较为普遍,应根据临床实验室的体外药敏试验结果 ,指导临床合理用药。     

茶树油对白假丝酵母菌抑菌效果

目的观察茶树油对白假丝酵母菌的抑菌效果及其抗真菌作用机理。方法采用纸片扩散法和生化指标检测方法进行了试验研究。结果以含1-萜品-4醇与桉叶素为主要成分的茶树油对白假丝酵母菌最低抑菌浓度为体积分数1.56%;对该菌最低杀菌浓度为体积分数25%。茶树油处理的白假丝酵母菌的菌体蛋白质含量明显减少,菌体胆固醇及甘油三脂含量也明显低于正常对照菌株。结论茶树油在较低浓度条件下具有明显抑制和杀灭作用,茶树油有干扰菌体蛋白质、胆固醇及甘油三脂的合成作用从而产生抗菌作用。     

纸片法在检测念珠菌药物敏感性中的应用

目的探讨纸片法在临床念珠菌药敏检测中的应用价值。方法采用法国科玛嘉念珠菌显色培养基和生物梅里埃公司Vitec 32进行念珠菌菌种鉴定,用纸片法进行药物敏感性测定。结果临床感染念珠菌菌种分别为白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌和急落假丝酵母菌,对两性霉素B、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶5种抗霉菌药,上述念珠菌的耐药率分别为:白色念珠菌:0、0、0、0、1.8%,光滑念珠菌和热带念珠菌均无耐药菌株,克柔假丝酵母菌:33.3%、33.3%、66.7%、33.3%和66.7%,近平滑假丝酵母菌无耐药菌株,皱落假丝酵母菌:100%、0、0、0、0。结论显色培养基鉴定念珠菌具有快速、准确的优点,纸片法具有操作简单、成本较低、结果可靠的优点,在临床念珠菌的鉴定和药敏试验中具有良好的应用前景。     

白藜芦醇体外抗白假丝酵母菌生物膜作用的初步研究

目的 研究白藜芦醇对体外白假丝酵母菌生物膜的影响.方法 采用XTT减低法评价白藜芦醇对白假丝酵母菌生物膜的影响;通过倒置显微镜、扫描显微镜观察该药对白假丝酵母菌生物膜的形态学影响.结果 白藜芦醇对白假丝酵母菌生物膜的SMIC50,SMIC80分别为128,256 μg/ml;当白藜芦醇浓度为256 μg/ml时对白假丝酵母菌的早期黏附及菌丝生长有抑制作用.结论 白藜芦醇对体外白假丝酵母菌生物膜有显著的抑制作用.     

复发性外阴阴道假丝酵母菌病的病原菌鉴定与药敏分析

目的了解甘肃省民乐地区复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC)致病菌株的构成与常用抗真菌药物敏感情况。方法采集90例RVVC患者阴道分泌物标本接种假丝酵母菌显色培养基完成菌种培养鉴定,采用纸片扩散法进行真菌药敏试验。结果 90份分泌物标本培养阳性83份,阳性率为92.2%,共分离出86株假丝酵母菌,其中白假丝酵母菌62株(72.1%),光滑假丝酵母菌14株(16.3%),热带假丝酵母菌5株(5.8%),克柔假丝酵母菌3株(3.5%),其他假丝酵母菌2株(2.3%)。86株假丝酵母菌对伊曲康唑(95.3%)和制霉菌素(93.0%)的敏感率最高,其次为5-氟胞嘧啶(80.2%)和氟康唑(67.4%),对克霉唑(59.3%)和咪康唑(57.0%)较低。结论 RVVC病原菌以白假丝酵母菌为主,但优势明显下降,非白假丝酵母菌比率上升,尤以光滑假丝酵母菌明显。假丝酵母菌对临床常用抗真菌药物具有一定耐药性,特别是唑类药物。因此,在治疗RVVC前必须进行真菌培养和药敏试验,根据药敏试验结果选择合适的抗真菌药物治疗。     

临床分离白假丝酵母菌对氟康唑的耐药性分析

目的了解镇江地区临床分离的白假丝酵母菌对抗真菌药物氟康唑的体外敏感性。方法微量稀释法测定64株临床分离白假丝酵母菌对氟康唑的敏感性,结果用氟康唑的最低抑菌浓度（MIC）表示。结果氟康唑对64株临床分离白假丝酵母菌的MIC为0．125-0．5μg／mL。结论氟康唑对白假丝酵母菌有较好的体外抗真菌活性。     

白假丝酵母菌伪足现象的鉴定

目的伪足法用于白假丝酵母菌与非白假丝酵母菌鉴别的临床评价。方法将标本接种于巧克力平板,5%CO2、37℃培养48h,观察菌落周围是否出现伪足,并以标准方法确认。结果 181株白假丝酵母菌中,169株出现伪足现象;55株热带假丝酵母菌中4株出现伪足现象;8株克柔假丝酵母菌中,2株出现伪足现象。以"伪足现象"鉴定白假丝酵母菌的灵敏度为93.4%(95%CI:88.8%～96.2%),特异度为95.2%(95%CI:89.9%～97.8%)。结论伪足法鉴定白假丝酵母菌具有简单、经济、快速的特点,有较高的灵敏度和特异度,适宜推广应用。     

机采血小板细菌16s rRNA基因检测的临床研究

目的 探讨快速、可靠的检测机采血小板(PLT)细菌污染的新方法.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增1 308份献血员机采PLT 16s rRNA基因,以乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸(HBV DNA)、白假丝酵母菌和人类基因组DNA为对照,检测该方法的特异性;采用10倍倍比稀释法进行该方法的敏感性检测.结果 检测1308份献血员机采PLT,其中7份16s rRNA基因为阳性,阳性率为0.54%(7/1 308).而与HBV DNA、白假丝酵母菌和人基因组DNA无交叉反应;PCR最低能检测1.5 × 10~4cfu/L大肠埃希菌.结论 献血员机采PLT板细菌污染的阳性率为0.54%;利用PCR检测献血员机采PLT细菌16s rRNA基因的方法具有特异性、快速性和敏感性高等特点.     

69例假丝酵母菌的检测及耐药分析

目的 通过对本院患者假丝酵母菌的检测,以了解该菌属的检出率及耐药特点,为临床合理用药提供依据.方法 用显色培养基及芽管形成试验鉴定真菌;用ATB FUNGUS 2 INT试条对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑及伊曲康唑进行药敏试验.结果 2006年5～11月,共分离出假丝酵母菌69例,其中白假丝酵母菌59例(85.5%),光滑假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌各检出4例(11.6%),热带假丝酵母菌2例(2.9%).该菌属的检出分别是痰标本48例(69.6%),尿标本12例(17.4%),分泌物标本6例(8.7%),血液标本3例(4.3%).结论 69例假丝酵母菌中,白假丝酵母菌检出率最高,痰标本最多.4种假丝酵母菌对氟康唑的耐药率最高,两性霉素B的耐药率最低.     

三种方法检测酵母菌对氟康唑药敏试验一致性的研究

目的:对比研究3种酵母菌体外药敏试验在测定酵母菌对氟康唑药物敏感的可靠性及实用性。方法:以美国实验室标准协会(CLSI)酵母菌纸片扩散法药敏试验(M44-A)为参照,采用丹麦ROSCO纸片扩散法、法国梅里埃ATB FUNGUS3药敏试验,检测82株临床分离的酵母菌对氟康唑的药物敏感度。采用WHONET-5.4和SPSS13.0软件对结果进行分析,比较ROSCO纸片扩散法、ATB FUNGUS3与M44-A结果间的一致性。结果:ROSCO纸片扩散法检测82株临床分离酵母菌对氟康唑的药敏结果与CLSI M44-A检测结果间差异无统计学意义(P>0.05),一致率为80.5%;ATBFUNGUS3检测的药敏结果与CLSIM44-A检测结果间差异有统计学意义(P<0.01),一致率为74.4%,其中光滑假丝酵母菌和白假丝酵母菌的检测结果与参照差异较大。结论:在检测酵母菌对氟康唑体外药物敏感度方面,ROSCO纸片扩散法与M44-A的一致性较好;对部分菌株,则需进一步应用微量肉汤稀释法M27-A2检测,以确定其最低抑菌浓度(MIC)。