FSHR部分基因的真核表达质粒构建和生物信息学分析

目的克隆FSHR基因部分片段(145～330bp)(FSHRn),构建真核表达重组质粒,预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性。方法提取小鼠睾丸组织的总RNA,利用RT-PCR技术反转录成cDNA,按照GenBank中小鼠FSHRN-端序列设计引物,扩增基因片段并插入pcDNA3.1/myc-His(-)B载体,重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定后用VectorNTI9.0软件作生物信息学分析。结果扩增片段长度为186bp,测序结果与已知序列吻合,重组真核表达质粒经PCR和双酶切鉴定获得正确重组子,生物信息学分析其编码蛋白抗原性肽段主要集中在15～20aa、22～27aa、32～36aa、42～48aa、58～67aa,与人的基因同源性为90%。结论成功克隆了FSHRn基因片段并构建了pcDNA3.1/FHSRn真核表达重组质粒;FSHRn具有良好的抗原性,FSHRn蛋白可作为良好的动物候选疫苗,为此段蛋白的深入研究和人类男性避孕疫苗的研制打下基础。     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统F和E基因序列测定

目的克隆并测定嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统部分编码基因GspF和Gsp E的完整基因序列。方法分别根据已获得的嗜麦芽寡养单胞菌D2株部分序列,以及GenBank收录的K279a和R551株的序列依次设计3组引物,移步法PCR扩增GspF和E基因,产物纯化后连接pMD18T载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后进行测序分析,将获得各PCR片段进行拼接,最终获得GspF和E基因的完整编码基因,并在GenBank中进行对比分析。结果 PCR先后扩增获得的3段序列,测序并拼接后发现其含有两个完整开放读码框架,分别为长1200 bp的GspF基因(GenBank收录号为GU377212.1)和长1434 bp的GspE基因(GenBank收录号为HM151387)。在GenBank中BLAST分析发现,D2株与嗜麦芽寡养单胞菌R551-3菌株的GspF基因及氨基酸序列同源性分别为93%和98%;GspE基因及氨基酸序列同源性与同菌种菌分别为92%和99%。结论成功克隆出嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统基因簇中的GspF和GspE完整编码序列;嗜麦芽寡养单胞菌GspF和GspE种内高度保守,而其他细菌差异显著,提示其Ⅱ型分泌机制可能与其他革兰阴性菌有一定差异。     

伤寒杆菌耐药质粒pRST98毒力基因spv的序列测定

目的 对伤寒杆菌多重耐药质粒pRST98的毒力基因spv进行克隆及核酸序列测定。方法 为区分毒力基因存在于细菌染色体还是位于耐药质粒pRST98，先分离提取耐药质粒pRST98，再以该质粒为模板，将自行设计的引物经多聚酶链式反应(PCR)扩增目的基因，装入克隆载体pGEM-T EASY进行核酸序列测定。结果 PCR反应得到spv，基因的spvR和spvB片段，其ORF大小分别为894bp和1776bp，核酸序列测定后进行生物信息学分析。结论 伤寒杆菌多重耐药质粒pRST98除编码细菌抗药性外，还具有与细菌毒力相关的基因，该质粒是一种具有双重功能的“嵌合型”质粒。     

肺炎嗜衣原体Pmp21蛋白原核表达载体的构建

目的 PCR扩增肺炎嗜衣原体多形态膜蛋白Pmp21基因,构建pGEX-6p-2/Pmp21原核表达载体。方法筛选Pmp21优势抗原表位,PCR法扩增Pmp21目的基因;并亚克隆至pGEX6p-2原核表达载体;经PCR与测序鉴定。结果软件分析选择Pmp21优势抗原表位编码基因的154bp～885bp位碱基序列,设计引物PCR法扩增得到目的片段;构建重组质粒经测序鉴定,BLAST比对与Genbank上登录序列完全一致。结论成功构建pGEX-6p-2/Pmp21载体,为研究Pmp21在Cpn感染中的作用奠定基础。     

细粒棘球绦虫AgB8/1重组抗原表达系统的构建

目的 构建pET32a-AgB8/1原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达.方法 从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板用基因特异性引物扩增EgAgB8/1基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此基因片段为依据,人工合成合成EgAgB8/1抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性.通过对pUCm-T/AgB8/1重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确性后,转化至E.coli BL21 (DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1重组蛋白.用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平.结果 测序表明,AgB8/1抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒.SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约28 kDa处有表达条带.结论 本研究成功构建了pET32a-AgB8/1原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.     

伤寒沙门菌fljB∷lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制，建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物，用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

伤寒沙门菌fljB::lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制，建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物，用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段，获得其序列，并进行序列分析。方法：利用简并引物，进行RT-PCR，扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm-T载体，进行鉴定、测序；利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列，并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果：RT-PCR扩增出了-500bp左右的cDNA片段，对阳性克隆测序后获得其核酸序列，长498bp。推导出的氨基酸序列长166；氨基酸序列的同源性分析显示，该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性，组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。结论：本实验克隆获得了斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱近酸蛋白酶cDNA片段。     

人类疱疹病毒8型病毒干扰素调节因子编码基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)编码的病毒干扰素调节因子(virusinterferonregulatoryfactor,vIRF)基因K9,并将其导入真核细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的K9基因核苷酸序列设计一对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增K9基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒pK9。为了便于蛋白检测,再设计第二对引物,上游引物不变,在下游引物5′端引入了Flag序列。以质粒pK9为模板再次PCR,扩增K9-Flag基因,并把K9-Flag序列克隆入pcDNA3.1( )中,得到重组质粒pK9F。重组质粒经酶切鉴定,核酸序列测定和分析后瞬时转染NIH3T3细胞,用RT-PCR、Westernblot分别从核酸和蛋白水平检测K9基因的表达情况。结果:PCR分离、克隆的K9-Flag序列全长1380bp,核酸序列分析显示克隆的K9基因与GenBank中己经登记的K9基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Westernblot都在K9预期位置检测到特异性条带。结论:HHV-8K9基因在NIH3T3细胞中获得了正确表达。     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

小鼠PGRP-L分子PGRP结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆小鼠长型肽聚糖识别蛋白（PGRP—L）的PGRP结构域基因并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术。从Balb／C小鼠肝组织总RNA中扩增PGRP—L的PGRP结构域基因片段,将其克隆人pUCm-T载体,以PCR、酶切和测序进行鉴定。以PCR从含PGRP结构域基因的重组质粒中扩增目的基因片段,插入表达质粒pQE-30构建重组表达质粒,转化大肠杆菌M15,诱导表达并纯化目的蛋白。结果RT—PCR扩增得到约500bp的基因片段,将其与pUCm-T载体连接构建成重组质粒prnPGRPd,其酶切图谱与计算机分析结果一致,该基因片段长518bp,序列与Genbank中相应基因序列相同。构建成重组表达载体pQE-PGRPd,在大肠杆菌M15中表达,表达产物主要存在于菌体裂解液上清中,为一相对分子质量约29000的可溶性蛋白。结论成功克隆并原核表达了小鼠PGRP—L分子PGRP结构域基因,为PGRP—L分子的研究奠定了一定基础。     

具有野生起点的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶表达质粒的构建

目的 构建具有野生起点的丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶表达载体。方法 根据疏水性分析选定待表达的丙型肝炎病毒非结构基因５ｂ区大部分基因。以聚合酶链反应扩增泛素基因,逆转录－聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶基因。限制性酶切长度多态性分析重组克隆,并以ＤＮＡ序列分析方法最终确认。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A(SEA)基因,亚克隆入表达载体pET-28a(+),诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a(+)-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a(+)-SEA/BL21在相应分子量(约30000Mr)条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。     

干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因的扩增、克隆及蛋白表达

目的 研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1(interferon-inducible transmembrane protein-1,IFITMP-1)基因的扩增、克隆及蛋白表达。方法 以含IFITMP-1基因的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将目的基因克隆到pUCm-T质粒测序。进一步克隆到pET-Trx蛋白表达载体质粒,优化蛋白表达条件。结果 含有IFITMP-1基因的PCR产物约1000bp。重组pUCm-T质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,有相应大小的cDNA片段插入,测序结果显示其序列正确,证实目的基因的扩增、克隆成功,并成功克隆进pET-Trx蛋白表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)plysS中有融合蛋白表达。结论 成功扩增克隆IFITMP-1基因,并成功表达该基因编码的蛋白,为进一步研究IFITMP-1基因在大肠癌中的作用奠定了基础。     

干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因的扩增、克隆及蛋白表达

目的研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1（interferon-inducible transmembrane protein-1,IFITMP-1）基因的扩增、克隆及蛋白表达.方法以含IFITMP-1基因的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切,将目的基因克隆到pUCm-T质粒测序.进一步克隆到pET-Trx蛋白表达载体质粒,优化蛋白表达条件.结果含有IFITMP-1基因的PCR产物约1000 bp.重组pUCm-T质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,有相应大小的cDNA片段插入,测序结果显示其序列正确,证实目的基因的扩增、克隆成功,并成功克隆进pET-Trx蛋白表达载体,经IPTG诱导,在BL21（DE3）plysS中有融合蛋白表达.结论成功扩增克隆IFITMP-1基因,并成功表达该基因编码的蛋白,为进一步研究IFITMP-1基因在大肠癌中的作用奠定了基础.     

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的　构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果　酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论　成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法　根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR　I、Not　I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果　ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论　在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫GRA1基因变异及真核表达载体的构建

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原1（ GRA1）基因真核表达质粒。方法：根据GRA1基因已知序列,设计一对引物。用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段,插入pcDNA3质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切及PCR鉴定、测序。结果：从弓形虫RH株基因组中扩增出775 bp的GRA1基因,测序显示该基因存在一135 bp的插入序列,使得所得PCR产物分子量大于预期值（628 bp）。该插入序列造成GRA1基因移码突变。结论：首次报道了变异的弓形虫RH株GRA1基因并构建了该变异基因的重组表达质粒。     

表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒的构建

目的构建1个含有luxS基因上、下游片段、抗卡那霉素基因的重组克隆质粒,用以敲除表皮葡萄球菌luxS基因。方法检索GenBank获得luxS基因序列以设计引物,以生物膜阳性表皮葡萄球菌基因组DNA为模板,采用高保真PCR扩增得到包含luxS基因上游片段、完整的luxS基因和luxS基因下游片段的长片段DNA;以pEASYT4质粒为模板扩增得到抗卡那霉素基因,再用内侧引物分别扩增luxS基因上、下游序列,按luxS基因上游片段＋抗卡那霉素基因＋luxS基因下游片段的顺序重组连接,转化JMl09感受态细胞,通过卡那霉素筛选、酶切分析和PCR一测序验证luxS基因敲除的重组克隆载体。结果经酶切后电泳验证重组质粒中各目的片段插入无误,PCR检测结果证明重组质粒luxS基因缺失,测序结果显示碱基无错配,含目的基因的重组质粒菌株在含卡那霉素培养平板内正常生长,证明插入的抗卡那霉素基因表达良好。结论表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒构建成功,为后续luxS基因缺陷株的构建奠定了基础。