牙本质及成牙本质细胞体外培养的研究现状

龋病是造成牙体缺损与缺失的主要原因 ,是口腔科常见的多发病 ,也是严重危害人类身体健康的三大疾病之一。世界卫生组织已将龋病列为危害人类健康的三大疾病之一。根据我国各地调查资料的统计结果 ,我国总平均患龋率为37 3%。患龋者龋均为 2 4 7颗牙 ,因龋病拔除者约占5 6 6 %〔1〕。另一严重危害口腔健康的疾病是牙周病 ,因牙周病拔除者约占 31 1%。事实上牙周病患牙很多是自行脱落的 ,故事实上由牙周病而丧失的牙齿大于以上数字。由此看来 ,龋病和牙齿缺失是关系到我国广大人们身体健康的重要因素之一。人们对龋病的治疗主要沿袭传…     

成牙本质细胞的分化指标

成牙本质细胞源于神经嵴 ,牙乳头细胞在来自上皮源性的生物分子作用下 ,依照特定的时空式于钟状期晚期开始分化 ,其主要功能是合成和分泌牙本质细胞外基质 ,并促进矿化[1] 。成牙本质细胞在成熟过程中表现出特定的形态 ,与其发挥的分泌功能相适应。细胞形态学特征和成牙本质细胞分泌的特异性基质蛋白是成牙本质细胞最为重要的表型[2 ] 。但是两者均有一定的复杂性 ,首先 ,成牙本质细胞形态经过一系列变化过程 ,最终才极化为成熟细胞。而随着分子生物学技术的进展 ,人们对牙本质特异蛋白的认识不断深入 ,业已进入分子水平 ,但仍有许多问题尚…     

ACVR1对成牙本质细胞极性及牙本质形成的作用

目的 研究Ⅰ型骨形态发生蛋白(BMP)受体活化素A受体1(ACVR1)调节小鼠成牙本质细胞极性及促进牙本质形成的作用机制.方法 通过Cre-loxP系统,以Osterix为启动子激活Cre重组酶,敲除小鼠牙源性间充质细胞的Acvr1基因.于小鼠出生后21 d收集标本,观察成牙本质细胞形态、排列及牙本质的形态;免疫荧光染...     

新生大鼠成牙本质细胞及牙本质形成的光、电镜观察

目的:探讨成牙本质细胞的发育变化以及牙本质的结构发育特点.方法:取不同日龄新生大鼠的下颌切牙牙胚进行光、电镜观察.结果:成牙本质细胞由低柱状变为高柱状,并发生极化,细胞器渐增多,有分泌颗粒出现,细胞突起逐渐形成;形成的前期牙本质和牙本质在6～9 d达最厚,且胶原纤维较丰富而密集,牙本质小管多;成牙本质细胞突起贯穿前期牙本质和牙本质,并进入牙釉质中.结论:0～9 d日龄大鼠的下颌切牙牙胚正处于牙体组织的分泌形成期,是研究牙齿发育过程的很好的动物模型.     

成牙本质细胞的分化指标

成牙本质细胞源于神经嵴 ,牙乳头细胞在来自上皮源性的生物分子作用下 ,依照特定的时空式于钟状期晚期开始分化 ,其主要功能是合成和分泌牙本质细胞外基质 ,并促进矿化[1] 。成牙本质细胞在成熟过程中表现出特定的形态 ,与其发挥的分泌功能相适应。细胞形态学特征和成牙本质细     

人牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化中细胞周期变化

目的 建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系,观察体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中细胞周期的变化.方法 利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定,使用矿化诱导液诱导其向成牙本质细胞样细胞分化.对细胞增殖情况使用流式细胞仪进行细胞周期测定.结果 ①获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明为中胚层来源的细胞.②诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期;3周左右开始有细胞结节形成,周围细胞呈放射状排列,部分细胞出现细长突起并呈极性排列;4周左右细胞团中央Von Kossa染色为阳性.③在诱导开始后1周,细胞处于活跃的增殖期,以后细胞增殖变慢,3周后多数细胞处于G0G1期.结论 实验成功建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系,所获得的成牙本质细胞样细胞具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能,诱导分化后细胞增殖变慢,是研究成牙本质细胞的较好模型.     

过量氟对大鼠牙髓成牙本质细胞显微和亚显微结构的影响

目的:观察过量氟作用下大鼠牙髓成牙本质细胞显微、亚显微结构的改变。方法:选择30只Wister大鼠,随机分为两组,每组15只。Ⅰ组为对照组,蒸馏水灌胃。Ⅱ组为实验组,20 mg/(kg.d)氟化钠水灌胃。8周后处死动物,利用磨片、HE染色、透射电镜技术观察过量氟对大鼠切牙形态、成牙本质细胞显微和亚显微结构的影响。结果:实验组切牙牙釉质牙本质厚度明显变薄,髓腔内侧前期牙本质宽于对照组,球间牙本质增多。釉质生长线、釉柱横纹明显,牙本质生长线明显。透射电镜观察实验组大鼠牙髓成牙本质细胞体积较小,细胞器减少,一些细胞呈现凋亡迹象。结论:过量的氟作用下大鼠牙髓成牙本质细胞分化和分泌基质都受一定程度的阻遏,成牙本质细胞细胞器减少,细胞凋亡。     

生物活性玻璃45S5体外对根尖牙乳头细胞成牙本质方向分化的影响

目的 明确生物活性玻璃(45S5)对人根尖牙乳头细胞体外成牙本质方向分化的作用。方法 浓度为0.1 mg/mL的45S5浸提培养液与人根尖牙乳头细胞共培养,离子体发射光谱检测45S5浸提培养液硅、钙、磷离子浓度,细胞活性噻唑蓝比色法检测细胞增殖,Realtime-PCR检测细胞成牙本质方向分化相关基因牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白(DMP-1)的表达,茜素红矿化结节染色及氯化十六烷基吡啶钙结节半定量分析矿化结节形成。结果 与对照组相比,45S5浸提培养液中硅离子浓度显著升高(P<0.05);45S5浸提培养液连续诱导培养根尖牙乳头细胞3、5、7 d后,与对照组相比显著促进细胞增殖(P<0.05);45S5浸提培养液连续诱导培养根尖牙乳头细胞7 d,细胞DSPP、DMP-1的表达量显著高于对照组(P<0.05);45S5生物活性玻璃体浸提培养液连续诱导培养根尖牙乳头细胞14和21 d,茜素红染色后观察45S5组和矿化诱导培养液(OM)组均见明显红染矿化结节,对照组未见明显红染矿化结节;氯化十六烷基吡啶钙结节半定量分析各组钙离子浓,45S5和OM组OD值高于对照组(P<0.05),45S5组OD值高于OM组(P<0.05)。结论 0.1 mg/mL生物活性玻璃45S5体外促进根尖牙乳头细胞增殖、成牙本质方向分化相关基因高表达和矿化结节形成,45S5体外促进根尖牙乳头细胞成牙本质方向分化。     

颅神经嵴干细胞成牙本质样细胞分化诱导的体内实验研究

目的观察诱导颅神经嵴干细胞(cranial neural crest stem cell,CNCSC)后的裸鼠体内成牙本质样细胞表型分化,探讨CNCSC用于牙再生研究的可行性。方法颅神经管组织块无血清条件培养法获取CNCSC,体外经成纤维生长因子8(FGF8)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质基质非胶原蛋白等因子诱导后,与胶原-壳聚糖三维凝胶支架复合植入裸鼠背部皮下,免疫组织化学方法检测型胶原表达、牙本质涎磷蛋白(DSPP)表达,鉴定其成牙本质样细胞表型分化特征。结果诱导后CNCSC植入体内后1月表现为型胶原及DSPP阳性表达,2月后DSPP表达增强,局部区域可见极性栅栏状排列的细胞分布,并可见明显的细胞外基质形成。结论CNCSC在体内可向成牙本质样细胞表型分化,为进一步开展牙再生研究奠定了基础。     

颅神经嵴干细胞成牙本质样细胞分化诱导的体内实验研究

目的观察诱导颅神经嵴干细胞（cranial neural crest stem cell，CNCSC）后的裸鼠体内成牙本质样细胞表型分化，探讨CNCSC用于牙再生研究的可行性。方法颅神经管组织块无血清条件培养法获取CNCSC，体外经成纤维生长因子8（FGF8）、骨形态发生蛋白2（BMP2）、转化生长因子β1（TGFβ1）、牙本质基质非胶原蛋白等因子诱导后，与胶原-壳聚糖三维凝胶支架复合植入裸鼠背部皮下，免疫组织化学方法检测Ⅰ型胶原表达、牙本质涎磷蛋白（DSPP）表达，鉴定其成牙本质样细胞表型分化特征。结果诱导后CNCSC植入体内后1月表现为Ⅰ型胶原及DSPP阳性表达，2月后DSPP表达增强，局部区域可见极性栅栏状排列的细胞分布，并可见明显的细胞外基质形成。结论CNCSC在体内可向成牙本质样细胞表型分化，为进一步开展牙再生研究奠定了基础。     

DNCP诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的浓度优化

目的 探讨牙本质非胶原蛋白(DNCP)诱导大鼠面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的最适浓度.方法 取妊娠12.5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,DNCP诱导浓度分别为10、50、100、200、500、1 000μg/mL,观察细胞形态变化,诱导6d后采用定量RT-PCR检测牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP1)的表达.结果 6d后除10μg/mL组和1 000μg/mL组外,其他诱导组细胞出现极性改变,部分细胞出现平行排列趋势;细胞表达DSPP和DMP1,以200μg/mL组最强,500μg/mL组和200μg/mL组表达量相当,而1 000μg/mL组细胞死亡.结论 在DNCP诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中过低浓度不利于成牙本质细胞的分化,而过高浓度则引起细胞死亡.200μg/mL是较为合适的有效诱导浓度.     

生物活性玻璃和牙本质浸提蛋白对人牙髓细胞的作用

目的：明确生物活性玻璃（bioactive glass, BG）和牙本质浸提蛋白（extracted dentin proteins, EDP）对人牙髓细胞增殖、成牙本质向分化、矿化的作用。方法： 采用酶消化法培养牙髓细胞,传代至第4代用于实验。分别用含BG-EDP浸提液、BG浸提液、EDP浸提液的达尔伯克必需基本培养基（Dulbecco’s minimum essential medium,DMEM）培养牙髓细胞,对照组为DMEM培养组;通过细胞活性噻唑蓝比色法检测细胞增殖能力,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测及real-time PCR检测细胞成牙本质向分化能力,茜素红钙化结节染色及氯化十六烷基吡啶半定量分析检测细胞矿化能力。结果： BG-EDP组3、7、9 d时（光密度值1.36±0.06、2.52±0.20 、2.72±0.29）能够增强人牙髓细胞增殖活性,同BG组（光密度值1.20±0.26、2.33±0.26、2.50±0.30）、EDP组（光密度值1.13±0.15、2.10±0.13、2.38±0.22）和对照组（光密度值0.84±0.17、1.84±0.18、1.95±0.19）比较差异具有统计学意义（P<0.05）。7 d时,BG-EDP组ALP活性与EDP组、对照组差异无统计学意义,分化相关基因（DSPP、DMP-1）表达无明显升高。14 d时,BG-EDP组ALP活性升高（56.67±1.83）, 显著高于EDP组（41.98±9.71）及对照组（30.82±6.70）,P<0.05,但同BG组（56.29±6.20）相比差异无统计学意义（P>0.05）;BG EDP组DSPP表达量明显升高(5.79±1.94),显著高于BG组(2.62±0.46)、EDP组(2.66±1.06)及对照组(1.84±0.76),P<0.05;BG-EDP组DMP-1表达升高(3.87±1.87),略高于BG组(1.89±0.90)、EDP组(2.38±1.04)和对照组 (2.25±0.93),但差异无统计学意义（P>0.05）。诱导2周后,BG-EDP组形成较多矿化结节,氯化十六烷基吡啶半定量分析显示BG-EDP组钙化量最高（0.27±0.01）。结论： 同单纯的BG及EDP相比,BG-EDP复合后具有更强的促进人牙髓细胞的增殖、成牙本质向分化、矿化作用。     

甲强龙对小鼠肾小管间质成纤维细胞间通讯的影响

利用共聚焦激光扫描显微镜的荧光漂白功能，通过荧光漂白后荧光回复现象观察了体外培养的正常小鼠肾小管间质成纤维细胞缝隙连接的通讯功能以及甲强龙的影响。结果发现体外培养的正常小鼠肾小管间质成纤维细胞间存在着缝隙连接，具有胞间通讯的功能。甲强龙对正常小鼠肾小管间质成纤维细胞缝隙连接介质的细胞间通讯具有明显的抑制作用。     

采用三维细胞培养的牙本质屏障细胞毒性试验研究

目的：采用牙本质屏障法对4种常用的牙体充填材料和2种牙本质粘接剂进行细胞毒性试验,并与传统的滤膜扩散法进行比较,从而探讨牙本质屏障法的优势。方法：选取丁香油水门汀、磷酸锌水门汀、粘结用玻璃离子水门汀、复合树脂和两种自酸蚀粘接剂（REMI BOND与Adper Easy One）进行试验。牙本质屏障法中将L929细胞立体培养于聚苯乙烯网状支架上,切取人第三磨牙近髓牙本质片,用液压通透装置测量其通透性,选取试验区域内通透值相近的牙本质片进行试验。将长满细胞的网状支架置于细胞培养分隔灌注小室的“牙髓腔”,牙本质片（“牙髓面”）紧贴网状支架放置其上,试验材料和对照与牙本质片的“面”接触24 h后用MTT法测量细胞的光密度值（D_{540 nm}）,试验材料与阴性对照光密度值的百分比为材料的相对细胞存活率。使用非参数检验对结果进行统计学分析。滤膜扩散法中材料与有单层细胞生长的滤膜接触24 h后进行细胞染色、评级。结果：近髓牙本质片的平均通透值为0.293 μL/(min·cm²·cmH₂O)（1 cmH₂O=0.098 kPa）。牙本质屏障法中,丁香油水门汀降低细胞存活率至82%,REMI BOND与Adper Easy One分别降低细胞存活率至63%和54%,其余材料对细胞无损伤或损伤很低;滤膜扩散法中,光固化复合树脂为中度细胞毒性、牙科粘接用玻璃离子水门汀为轻度细胞毒性,其余材料均为重度细胞毒性;6种材料在牙本质屏障法中表现的细胞毒性明显低于滤膜扩散法的试验结果。结论：使用牙本质屏障法测得材料与三维培养的细胞接触后的细胞毒性比使用滤膜扩散法时的细胞毒性低,结果与临床实际相关性好。     

钠钙交换体1型通道蛋白在人牙髓成牙本质细胞和神经纤维组织中的表达

目的:探讨钠钙交换体1(NCX1)型通道蛋白在人牙髓成牙本质细胞和神经纤维组织中的表达,进一步解释牙髓组织的修复和传感功能。方法:选取就诊患者因正畸减数或阻生拔出的新鲜健康第三磨牙24颗。取牙髓行牙本质涎磷蛋白抗体染色、改良Bielschowsky银染色以分别定位成牙本质细胞层、神经组织;用特异性抗体染色分析NCX1在人牙髓组织成牙本质细胞层、神经组织中的表达情况。结果:免疫组化染色显示,人牙髓成牙本质细胞胞体和神经组织的NCX1型通道蛋白均为阳性表达。Image-Pro Plus 6.0半定量分析显示,牙冠部和牙根部上段成牙本质细胞中的NCX1型通道蛋白表达水平分别为0.152±0.023、0.135±0.020,两者差异无统计学意义(t=1.425,P=0.352)。结论:人牙髓组织成牙本质细胞层及神经组织中均存在明显的NCX1型通道蛋白表达,其在牙冠部及牙根部上段牙本质细胞中的表达差异不明显。     

脉冲CO2激光对人牙本质硬度和超微结构的影响

目的 :通过超微结构的变化来分析脉冲CO2 激光对牙本质硬度影响的原因。方法 :人工制备15颗离体人磨牙的牙本质暴露区。然后 ,使用一定剂量的脉冲CO2 激光(12.5J/cm2)对暴露的牙本质进行照射 ,再分别测定其显微硬度 ,这样在每一颗标本牙内进行自身对照。所得数据由计算机统计学处理 ,配对t检验。同时 ,用扫描电镜观察牙本质表面的熔融变化。结果 :激光处理组的显微硬度值[HV(41.6±7.6)kg/mm2]低于对照组[HV(64.5±7.8)kg/mm2](P<0.01) ,有统计学意义 ;同时 ,激光组的牙本质表面熔融 ,牙本质小管开口也封闭消失。结论 :小剂量的CO2 激光可降低牙本质的硬度 ,并且有其超微结构的变化基础     

肝细胞生长因子在大鼠修复性牙本质形成过程中的表达研究

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)在大鼠修复性牙本质形成过程中的作用.方法 以窝洞预备形成大鼠修复性牙本质模型,免疫组织化学染色法检测HGF在窝洞预备后3 d、15 d、30 d的大鼠牙髓组织中的表达,采用积分光密度值(IOD)定量修复性牙本质形成不同阶段HGF的表达.结论 窝洞预备后3 d,HGF在大鼠牙髓细胞及成牙本质细胞胞浆中呈强阳性表达(IOD为8.995±0.943);窝洞预备后15 d,HGF在两种细胞的表达仍呈阳性(IOD为5.624±0.951), 但弱于3 d组(P＜0.01);30 d组(4.073±0.127)和正常对照组(4.279±0.348)大鼠牙髓细胞及成牙本质细胞胞浆中HGF均呈弱阳性表达,两者间差异无统计学意义.结论 HGF参与了牙髓损伤早期修复及修复性牙本质形成的过程.     

永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立

目的：建立永生化人成牙本质细胞系．方法：采用脂质体转染法，将人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因导入原代人成牙本质细胞样细胞．培养液加G418筛选约1mo后，抗性细胞克隆形成，滤纸片法转移、扩增并连续培养．检测转染细胞内hTERT的基因整和和表达，初步分析细胞系的生物学特征．结果：hTERT稳定转染入目的细胞，表达mRNA及其蛋白．转染后共获得5个细胞克隆，克隆5b来源的细胞在体外长期连续培养下生长良好，具有较高碱性磷酸酶活性，在转录水平表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白，细胞核型正常．该细胞系至今传代56代，约6mo，命名为hTERThOd-L结论：建立起永生化人成牙本质细胞样细胞系．     

体外组织培养模式的构建及转化生长因子促进牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化的研究

目的通过构建体外组织培养模式,观察牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化的潜力及转化生长因子-β1(TGF-β1)的促进作用。方法获取人第三磨牙牙髓组织,剪碎后与牙本质陶瓷粉(CDP)及2μg/mL TGF-β1混合,将混合物以骨基质明胶(BMG)为载体构建牙髓组织培养模型,在培养3、7、14和21 d后,通过HE和组织特异性染色鉴定有无骨-牙本质基质成分形成,免疫组化检测细胞有无牙本质特异性蛋白——牙本质涎蛋白(DSP)的表达。结果牙髓组织经TGF-β1诱导培养后可进一步矿化,甲苯胺蓝和Mallory染色表明在牙髓组织的中心出现骨-牙本质样基质的沉积,免疫组化检测牙髓细胞开始出现DSP的表达。结论成功构建体外牙髓组织培养模型,该模型能维持牙髓细胞的生长和存活,可用于体外对牙髓细胞的诱导分化观察;该模型模式下TGF-β1可明显促进牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导潜能。     

体外组织培养模式的构建及转化生长因子促进牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化的研究

目的通过构建体外组织培养模式，观察牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化的潜力及转化生长因子-β1（TGF-β1）的促进作用。方法获取人第三磨牙牙髓组织，剪碎后与牙本质陶瓷粉（CDP）及2μg／mL TGF-β1混合，将混合物以骨基质明胶（BMG）为载体构建牙髓组织培养模型，在培养3、7、14和21d后，通过HE和组织特异性染色鉴定有无骨-牙本质基质成分形成，免疫组化检测细胞有无牙本质特异性蛋白——牙本质涎蛋白（DSP）的表达。结果牙髓组织经TGF-β1诱导培养后可进一步矿化，甲苯胺蓝和Mallory染色表明在牙髓组织的中心出现骨-牙本质样基质的沉积，免疫组化检测牙髓细胞开始出现DSP的表达。结论成功构建体外牙髓组织培养模型，该模型能维持牙髓细胞的生长和存活，可用于体外对牙髓细胞的诱导分化观察；该模型模式下TGF-β1可明显促进牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导潜能。