神经干细胞定向分化调控的研究进展

神经干细胞的发现不仅改变了中枢神经系统神经组织不能再生的传统观点，还为中枢神经系统损伤和疾病的研究提供了新的思路和途径。中枢神经系统内神经组织细胞包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多种细胞，其功能主要依赖神经元及其之间的神经信息传递，不同的神经元在形态结构上基本一致，但功能却各不相同。仅仅通过神经干细胞移植以期代替各种神经元的方法并不理想，较为理想的方法是在应用前根据靶组织类型对神经干细胞进行准确的定向分化诱导。     

Wnt-1在全反式维甲酸促鼠胚神经干细胞向神经元分化中的作用

目的 探讨全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)体外促神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为神经元过程中Wnt-1表达的变化,及Wnt-1对NSCs分化的作用.方法 取孕12～16 d SD大鼠,分离和培养鼠胚NSCs.取第3代NSCs调整密度为1×106个/mL,分别用0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L浓度的ATRA干预,通过荧光双标染色技术和流式细胞仪检测各组细胞神经元分化率,确定1.0μmol/L浓度为ATRA促NSCs分化的最佳浓度.实验组用1.0μmol/LATRA诱导体外培养第3代NSCs,培养3、5、7、9 d后用免疫细胞化学染色、实时荧光定量PCR、Western blot检测Wnt-1表达的变化:对照组不加ATRA培养.结果 免疫细胞化学染色示对照组Wnt-1蛋白表达极少;实验组3 d时表达最强,阳性细胞多;培养5 d仍可见Wnt-1阳性表达;3、5 d时积分吸光度(IA)值与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);7、9 d Wnt-1阳性表达明显减少,IA值与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).实时荧光定量PCR检测示对照组Wnt-1 mRNA相对表达量为0.021 7±0.072 1;实验组相对表达量随时间增加逐渐降低,3、5 d时分别为0.512 2±0.280 0、0.216 4±0.887 0,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);7、9 d分别为0.038 5±0.299 4、0.035 5±0.309 5,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).Western blot印迹检测可见特异染色条带,对照组Wnt-1蛋白表达量为0.005 1±0.558 3;实验组表达量随时间增加逐渐降低,3、5 d时分别为0.451 7±0.071 3、0.311 7±0.080 5,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);7、9 d分别为0.007 3±0.052 7、0.004 7±0.931 4,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在浓度为1.0μmol/L的ATRA诱导下,Wnt-1与NSCs的分化早期成正调控,可能与激活包括经典的Wnt信号途径等信号有关,表明Wnt-1与NSCs向神经元的分化有关.     

表达胶质细胞源性神经生长因子的骨髓基质干细胞的神经分化潜能

有研究表明，骨髓基质干细胞(BMSC)可以向神经细胞分化，且易于获取，因此被认为是治疗中枢神经系统疾病理想的细胞载体。我们以胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)为目的基因，采用阳离子脂质体转染方法，对BMSC的基因工程化和神经分化潜能进行了初步研究。     

神经干细胞转染胶质细胞源性神经营养因子基因后的分化表现

目的观察转基因神经干细胞(NSC)体外外源基因的表达及转基因后的分化。方法体外转基因筛选得到稳定表达胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的脊髓源神经干细胞系(SP-NSC),通过流式分选(FACS),比较转基因前、后及血清对NSC分化为神经元及神经胶质细胞比例的变化;并采用Westernblot法检测传代后目的基因的表达。结果转基因后GDNF表达至少能稳定到转基因后6周;转基因后NSC分化为神经元的比例由转基因前(53.9±3.5)%提高到转基因后的(67.5±1.2)%,而血清组胶质细胞分化明显。结论SP-NSC转染GDNF后能稳定表达目的基因,转基因能显著增加后裔细胞中神经元比例,为转基因治疗中枢神经系统疾病研究奠定了基础。     

miR-126信号在神经干细胞向胆碱能神经元分化过程中的作用

目的探讨miR-126信号在脊髓源性神经干细胞定向分化为胆碱能神经元过程中的作用。方法采用神经干细胞球形成方法培养获得纯化的脊髓源性神经干细胞,添加诱导因子,诱导分化为胆碱能神经元,定量检测分化前后miR-126的表达变化。采用生物信息学方法,分析miR-126的靶基因和转录因子结合位点。结果 miR-126的表达在分化后的胆碱能神经元较未分化的神经干细胞明显增高。MiR-126作用的靶基因的作用包括蛋白结合、磷酸化修饰、神经发育、突触发育、细胞迁移、粘附等。miR-126含有3个潜在的转录因子结合位点。结论本文提示miR-126信号在神经干细胞向胆碱能神经元分化过程中具有调节作用。     

神经干细胞向神经元和胶质细胞分化调控机制的研究进展

自1992年Reynolds体外成功培养出成年哺乳动物的干细胞、提出成年人体内存在神经干细胞以来,有关神经干细胞分化及调控机制的研究已成为国内外学者关注的热点。由于成年神经干细胞的使用不存在伦理道德问题,具有多分化潜能,能够携带外源性治疗基因,且可通过导入原癌基因获得永生细胞系等优点,神经干细胞移植为中枢与外周神经损伤修复及神经退行性疾病的治疗提供了一个新的途径,其应用前景十分广阔。神经干细胞的分化方向主要取决于其在神经管中的最初定位以及从神经管迁移后在大脑中的最终定位,但同时也受细胞外的环境因素影响。神经干细胞…     

全反式维甲酸促大鼠胚胎神经干细胞向神经元分化中β连环蛋白的表达及意义

目的:观察全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)在体外促进大鼠胚胎神经干细胞(neural stemcells,NSCs)分化为神经元过程中β连环蛋白(β-catenin)的表达情况,探讨其在NSCs分化中的意义。方法:取第3代大鼠胚胎NSCs体外培养,实验组加入1.0μmol/L ATRA诱导,分别于干预后3、5、7、9d采用免疫细胞化学染色、实时荧光定量RT-PCR、Western blot检测β-catenin的表达及变化情况,对照组不加ATRA培养,于相应时间点进行相同检测。比较两组各时间点β-catenin的表达量。结果:免疫细胞化学染色示实验组在培养3～7d时β-catenin表达逐渐增强(P0.05),7d与9d差异无统计学意义(P0.05),实验组各时间点与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);实时荧光定量RT-PCR检测示3～7d时β-catenin mRNA相对表达量逐渐增加(P0.05),7d与9d差异无统计学意义(P0.05),实验组各时间点与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);Western blot印迹检测实验组细胞内β-catenin总蛋白、胞浆内β-catenin蛋白、胞核内β-catenin蛋白3～7d时表达量逐渐增加(P0.05),7d与9d差异无统计学意义(P0.05)。细胞内β-catenin的总蛋白变化趋势与RT-PCR结果相似,且胞浆内β-catenin和胞核内β-catenin的蛋白表达量随时间增加而增加。结论:NSCs分化为神经元的过程中,Wnt/β-catenin信号途径被激活,且β-catenin在细胞浆及细胞核内表达量均增多,与NSCs的分化成正调控,在细胞分化达到平衡状态时(7d～9d)表达量不再增加,表明ATRA促NSCs向神经元的分化与经典的Wnt/β-catenin信号途径有关。     

转酪氨酸激酶C基因神经干细胞在损伤脊髓内的分化和迁移

在缺乏外源性营养支持的情况下神经干细胞（NSCs）移植治疗脊髓损伤的效果很差。神经营养索（NT）-3能促进NSCs生存、迁移和分化，而酪氨酸激酶C（TrkC）是NT-3的高亲合力受体。本研究先将TrkC基因转染到NSCs内，然后观察转TrkC基因NSCs在损伤脊髓内的生存、分化和迁移等情况。     

脊髓神经干细胞定向分化为神经元过程中生长相关蛋白-43和钙调蛋白的表达

我们通过本实验在分离培养大鼠脊髓神经干细胞（NSCs）的基础上，研究其在定向分化为神经元过程中生长相关蛋白-43（GAP-43）和钙调蛋白（CaM）的表达及两者相关性，为神经干细胞的研究和应用奠定理论基础。     

胚胎源脊髓组织诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

目的体外诱导大鼠骨髓基质干细胞（BMSC）分化为神经元样细胞。方法采用Percoll（密度：1．073g／ml）梯度分离液，离心分离鼠BMSC，体外培养，提取大鼠胚胎脊髓组织匀浆诱导BMSC分化为神经元样细胞。形态学观察及免疫组织化学鉴定神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF-200）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果大鼠骨髓基质干细胞在诱导后细胞形态变化，突起交织；免疫组织化学发现分化细胞NSE、NF-200表达阳性率分别为（68．0±1．7）％，（76．2±2．9）％，少数GFAP阳性。结论胚胎脊髓组织匀浆可诱导骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞。     

大鼠神经干细胞体外培养及分化

神经干细胞（neural stem ceils,NSCs）是一种能产生神经元和胶质细胞的前体细胞。它的发现是神经科学领域的重大进展,为神经发育研究与神经组织移植开辟了广阔的前景,在将来治疗诸如帕金森氏病等神经退行性疾病和神经损伤性疾病上有较为广泛的应用。源于人脑能不断增殖的神经干细胞对基础与临床神经科学尤其具有巨大的诱惑力,神经干细胞的长期分离培养与建系成为进一步中枢神经系统疾病治疗研究的首要任务。     

基因重组BDNF感染脊髓神经干细胞及其表达

[目的]探讨脊髓神经干细胞（NSC）被重组逆转录病毒感染后目的基因的表达。[方法]用人脑源性神经生长因子（hBDNF）基冈重组逆转录病毒上清液感染脊髓NSCs，取感染后的NSCs培养液（BDNF条件培养液）培养背根神经结（DRG）和小鼠嗜铬瘤细胞（PC12细胞）检测培养液中BDNF活性；酶联免疫吸附反应（ELISA）检测培养液中BDNF浓度；逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测BDNF mRNA。[结果]感染hBDNF基因重组逆转录病毒的NSCs上清中有BDNF、的表达，经hBDNF条件培养液培养的PC12细胞．数量增多，突起明显变长。经hBDNF条件培养液培养背根神经结，神经元突起伸出，逐渐增多，长度大于神经节直径。[结论]脊髓NSC可直接作为基因靶细胞，被BDNF基因重组逆转录病毒有效感染而表达和分泌有生物学活性的BDNF、     

脑损伤时神经干细胞的修复与神经干细胞移植的研究进展

随着近几年对神经干细胞研究的深入，已有明确证据表明神经干细胞能促进神经元的再生及脑组织的修复。而且通过神经干细胞移植治疗，基因治疗载体的研究对于一些迄今为止仍无有效治疗方法中的中枢神经疾病，有望开发一些新的有针对性的治疗方法。     

骨形成蛋白-2诱导脊髓神经干细胞分化的实验研究

目的：研究不同浓度的骨形成蛋白-2(bone norphogenetic protein-2，BMP-2)对脊髓源性神经干细胞(neural stem cells，NSCs)诱导分化成为神经细胞(神经元和神经胶质细胞)的影响。方法：取孕14d的胚胎小鼠脊髓，原代培养出脊髓NSCs。培养四代后，分别在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)存在与否的不同条件下，加入不同浓度的BMP-2．观察细胞的增殖、分化情况，用免疫组织化学的方法进行鉴定，并进行统计学分析：结果：低浓度的BMP-2(1～10ng／ml)与bFGF(20ng／ml)联合作用，可促进脊髓NSCs向神经元和星形胶质细胞分化，抑制其向少突胶质细胞分化。较高浓度BMP-2(100ng／ml)可抑制脊髓NSCs的增殖甚至导致细胞死亡。结论：脊髓NSCs在低浓度BMP和bFGF联合作用下能有效地分化成具有多种特性的神经样细胞，并与脊髓具有良好的同源性，可为脊髓损伤的修复研究提供良好的细胞学基础。     

巢蛋白在已分化的神经干细胞中表达时程的研究

目的 探讨神经干细胞分化过程中巢蛋白(nestin)表达的时程变化。方法 在细胞分化的不同时间进行免疫荧光染色。结果 在神经干细胞分化早期，巢蛋白表达仍呈阳性。随着分化的神经细胞、星形胶质细胞或少突胶质细胞逐渐发育成熟，巢蛋白表达渐渐减弱，到第7周时巢蛋白表达完全消失。结论 巢蛋白表达不仅是神经干细胞的重要标志，同时也出现在神经干细胞分化的早期，而且随着细胞逐渐分化成熟，其表达显著下降。体外培养情况下至分化的第7周即完全消失。     

神经干细胞基因转导治疗中枢神经系统损伤的研究进展

近10多年来,在神经干细胞方面的研究进展十分迅速,已经建立了从啮齿类动物到人等多个动物种系的神经干细胞系.现阶段神经干细胞的应用已深入到转基因治疗阶段,为中枢神经系统损伤的修复、神经退行性疾病、颅内肿瘤、中枢神经系统自体免疫性疾病、脑血管疾病的治疗提供了新的途径.本文就神经干细胞基因转导治疗中枢神经系统损伤的研究进展作简要综述,并对神经干细胞基因转导治疗现阶段存在的问题做一些概括.     

神经营养因子-3诱导大鼠脊髓神经干细胞分化为胆碱能神经元的实验研究

目的 观察神经营养因子-3（NT-3）在体内外能否诱导脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元。方法 从孕龄15d的胚胎sD大鼠脊髓组织中分离获得脊髓源性神经干细胞。体外诱导分化研究：实验组在培养脊髓源性神经干细胞时，去除表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子加入NT-3进行诱导；对照组则单纯培养脊髓源性神经干细胞。体内诱导分化研究：实验组将去除表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子加入NT-3的脊髓源性神经干细胞混合悬液移植于成年SD大鼠切断胫神经远端，对照组则移植未加NT-3脊髓源性神经干细胞悬液。细胞免疫荧光化学法鉴定分化结果。结果 经NT-3诱导的脊髓源性神经干细胞用细胞免疫荧光化学法鉴定，体内外培养均可检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞，而对照组则未检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞。结论 NT-3在体内外均可诱导脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元。     

嗅鞘细胞体外诱导神经干细胞分化的实验研究

目的:研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)体外诱导神经干细胞(neuron stell cells,NSCs)分化的作用.方法:分别从3月龄SD大鼠的嗅球和新牛SD大鼠的海马中分离OECs及NSCs.进行体外分离、培养及免疫荧光鉴定.构建OECs与NSCs共培养体系,分为3组,纯化培养的OECs+NSCs组,末纯化培养的OECs+NSCs组,单纯NSCs组.共培养后4、8、12d行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率.结果:经P75和S100双重免疫荧光鉴定所培养的细胞为OECs,经巢蛋白抗体(Nestin)免疫荧光鉴定所培养的细胞为NSCs.荧光显微镜观察可见被特异件烯醇化酶一异硫氰酸荧光素(NSE-FITC)荧光标记的神经元大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突.在各时时间点,共培养组中可见到多个神经元聚集生长,神经元数目明显多于单纯NSCs培养组,而共培养组之间无明显差别.共培养后12d,共培养组中NSCs分化为神经元的百分率大约为23%,而单纯NSCs培养组约为4%.在各时间点,共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异(P<0.001),而共培养组之间的差异无统计学意义(P>0.05).结论:OECs在体外能够有效诱导NSCs向神经元转化.     

脑损伤的修复与神经干细胞移植

概述大鼠中枢神经系统在脑损伤时的自我修复过程，包括其增殖、迁移、分化的时程；神经干细胞移植治疗脑损伤的效果；神经干细胞移植目前存在的问题。     

人雪旺细胞促进人脐带间充质干细胞向神经方向分化的研究

目的 观察人雪旺细胞(hSCs)对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)在脊髓损伤(SCI)体内存活、分化的影响,通过分子生物学技术检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)与高分子量神经丝蛋白(NF-H)的表达,描述其变化的时间特征.方法 分离、培养及纯化hUC-MSCs和hSCs.取8周龄雌性Wistar大鼠60只,以Impactor Model-Ⅱ型打击器制作脊髓胸10(T10)损伤模型.大鼠随机均分为4组:DMEM对照组(A)、hSCs移植组(B)、hUC-MSCs移植组(C)、hUC-MSCs与hSCs联合移植组(D),各组分别于移植后1、2、3、4周取材.结果 D组可见MBP与核因子(NF)-H染色阳性细胞,其他各组为阴性.A组3种神经标志物在蛋白与mRNA水平的表达量随时间延长均逐渐增高,且GFAP在移植后2周明显增高,MBP与NF-H在移植后3周明显增高[2周与1周GFAP条带灰度比值为1.34,而聚合酶链反应(PCR)所测比值为2.86;3周与1周MBP和NF-H条带灰度比值分别为3.43、4.12,而PCR所测比值分别为6.47、6.78].与对照组相应时间点比较,移植组MBP、NF-H的表达量较高而GFAP的表达量较低,其中D组的MBP、NF-H的表达量最高(D组与A组MBP3周条带灰度比值为2.11,而NF-H3周条带比值为2.11),差异有统计学意义(P＜0.05),但D组GFAP各时间点的表达量差异(各周所测条带灰度比值依次为1.00:1.12:1.13:1.14)无统计学意义(P＞0.05).结论 hSCs可促进hUC-MSCs向神经元与少突胶质细胞方向分化并增强其对胶质瘢痕的抑制作用.