构建空肠弯曲菌致兔中枢神经系统病变的动物模型

背景：近年来，吉兰-巴雷综合征和眼肌麻痹-共济失调-无反射综合征屡有发现中枢神经系统受累，受累部位包括视神经、脑干和小脑。眼肌麻痹-共济失调-无反射综合征患者的脑干和脊髓小脑束发现MRI异常信号。因此建立空肠弯曲菌感染后脑炎的动物模型并通过影像学、免疫学及病理学等方法手段探讨其形成机制是实验出发点。 目的：建立空肠弯曲菌penner 4型感染后中枢神经系统病变的动物模型。 设计：随机分组设计、对照动物实验。 单位：河北医科大学第二医院影像科、神经内科。 材料：实验于2003—08／12在河北医科大学第二医院分子影像实验室完成。选择健康大耳白兔15只，随机分为实验组10只，对照组5只。 方法：实验组于第1周将空肠弯曲菌灭活菌液与等体积的完全弗氏佐剂对抽充分乳化后，分别于双腋窝、双腹股沟及背部脊柱旁皮下多点注射免疫，每处1mL，每只总量5mL。以后每2周以单纯空肠弯曲菌灭活菌液腹腔注射加强免疫，每只每次总量5mL，共5次。对照组以相同体积的生理盐水代替空肠弯曲菌菌液，注射方法及时间与实验组完全相同。评价方法：①症状与体征：观察动物精神状态、饮食、尿便及肢体活动状况等。②血清学检查：用酶联免疫吸附法分别检测动物血清中抗空肠弯曲菌抗体、抗IgG型GM1抗体及髓鞘碱性蛋白含量。③影像学观察：使用TOSHIBA 1．5T磁共振成像设备分别于每次免疫前随机抽取两组实验动物行MRI检查。扫描序列包括：自旋回波序列T1加权像，扫描参数为500／15ms（TR／TE）；快速自旋回波序列12加权像，40（30／108ms（TR／IE）；液体衰减反转恢复序列，参数为10000／120ms（TR／TE），翻转角90&;#176;，以上扫描层厚4．0mm，层间距0．8mm。④组织学检查：发病动物于初次免疫后4周经心脏灌注致死，立即开颅取视神经、部分白质、海马、脑干、小脑及颈、胸，腰各段脊髓，固定于40g／L甲醛溶液，分别行苏木精-伊红染色、坚固蓝染色及髓鞘碱性蛋白免疫组化染色。免疫后10周于实验组内随机选取5只及对照组5只以同样方法获得组织学标本。 主要观察指标：症状与体征；动物血清中抗空肠弯曲菌抗体、抗IgG型GM1抗体及髓鞘碱性蛋白含量；影像学观察；组织学观察。 结果：纳入动物15只，14只进入结果分析，实验组中1只动物于免疫后4周时死亡。①实验组1只动物于免疫后2周出现精神症状及肢体活动障碍。②实验组动物血清抗空肠弯曲菌-IgG抗体滴度在2-4周达到高峰，自第2周起，实验组动物血清A值显著大于对照组（实验组、对照组分别为1．923&;#177;0．403，0．973&;#177;0．633，P〈0．05）。IgG型GMI（A值）在第8周时明显升高，但与对照组比较差异无显著性（实验组、对照组分别为0．115&;#177;0．042．0．097&;#177;0．039，P〉0．05）。血清髓鞘碱性蛋白含量（A值）均在第8周时显著上升（0．134&;#177;0．041）。③影像学检查发现实验组动物在免疫后2～4周出现不同程度的颅脑MRI异常信号。④组织学改变见实验组动物脑干，延髓、颈髓、胸髓及腰髓等部位髓鞘肿胀，未见炎细胞浸润及髓鞘脱失。对照组上述部位均未见明显改变。 结论：空肠弯曲菌Penner 4型可诱发中枢神经系统病变。     

吉兰-巴雷综合征源空肠弯曲菌致急性周围神经病Hartley豚鼠模型初步建立

目的初步建立吉兰-巴雷综合征(Guilliain-Barre syndrome,GBS)源空肠弯曲菌感染致急性周围神经病Hartley豚鼠模型。方法以GBS患者分离的空肠弯曲菌经微需氧培养后制备菌悬液灌喂豚鼠。自灌喂当日起每日观察豚鼠的临床症状并分别对出现肢体活动障碍及灌胃后2周、3周、4周、5周的豚鼠进行取材,取脊神经根、坐骨神经及臂丛神经,进行苏木精-伊红染色(HE染色)、锇酸染色、免疫组织化学进行神经病理观察。结果空肠弯曲菌自然感染豚鼠后,豚鼠于5周内出现活动减少,食欲减退,体质量减轻症状;分别于2周、3周、4周出现神经病理改变,表现为HE染色可见神经纤维结构多样,轴索肿胀。免疫组织化学染色:鼠抗人神经细丝蛋白单克隆抗体示神经丝粗细不等,节段性萎缩;兔抗人髓磷脂碱性蛋白:髓鞘厚度均一,未见脱髓鞘样改变。锇酸染色:可见神经皱缩、髓鞘塌陷。结论吉兰-巴雷综合征源空肠弯曲菌口服灌喂感染Hartley豚鼠可导致急性周围神经病;Hartley豚鼠可以作为GBS的研究模型动物。     

抗空肠弯曲菌PEB1-LTB疫苗联合应用增强免疫应答的研究

目的为研制有效的空肠弯曲菌疫苗,构建PEB1与LTB融合基因的空肠弯曲菌疫苗,并初步探讨pcDNA3.1(-)-PEB1-LTB核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫BALB/c小鼠的免疫应答水平。方法通过腿部肌肉注射免疫小鼠的方式,在第0、3、6周采用核酸单独免疫与核酸蛋白联合免疫小鼠的免疫程序,于第5、8周末,测量小鼠体液免疫应答和细胞免疫应答水平。结果 3次免疫后,核酸蛋白免疫组诱导的IgG抗体含量[(14.392±0.579)μg/ml]是核酸疫苗单独免疫的2.43倍(P<0.05),说明核酸蛋白联合免疫诱导了更高的体液免疫应答水平;3次免疫后,核酸疫苗单独免疫组诱导的IFN-γ水平[(1 472.34±73.99)pg/ml]是联合免疫组[(290.323±15.46)pg/ml]的5.07倍,说明PEB1-LTB核酸疫苗单独免疫诱导较高的细胞免疫应答。结论核酸疫苗能诱导较强的细胞免疫应答,与PEB1-LTB蛋白联合免疫呈现出不同的免疫应答特点。该研究为抗空肠弯曲菌疫苗的优化设计与合理应用提供了理论依据。     

冷冻异体神经移植中宿主局部应用转化生长因子β1质粒的研究

背景:异体神经移植修复神经缺损,降低免疫排斥反应是关键问题之一,目前主要手段是降低移植神经段的抗原性和全身使用免疫抑制剂。目的:观察经反复冻融处理的冷藏异体神经移植,局部使用转化生长因子β1质粒处理的效果。设计:随机对照动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科。材料:实验于2003-01/2004-12在华中科技大学同济医学院完成,选择健康成年不同窝的Wistar大鼠40只,随机分为实验组和对照组,每组各20只。方法:制备转化生长因子β1质粒及冷冻的异体坐骨神经。实验组和对照组大鼠将坐骨神经在梨状肌孔下0.5cm处,切除2.0cm,神经缺损用预制冷冻的异体神经2.0cm移植修复,实验组局部肌肉及神经两断端注射转化生长因子β1质粒,对照组注射等量的生理盐水。分别于6,12周各组10只大鼠取材、切片、染色并进行轴索计数和统计学分析。结果:在实验过程中无动物死亡,均进入结果分析。6周时对照组神经移植段轴索间有轻度水肿,实验组轴索间基本无水肿,再生神经数量接近正常;12周时,实验组整个神经移植段基本被再生轴突充满,有髓纤维排列整齐,轴突和髓鞘发育良好,实验组再生轴突数显著高于对照组,差别具有极显著性[(98.6±4.8),(75.8±5.1)个/μm2,t=2.962,P<0.01]。结论:反复冻融冷藏保存可降低异体神经的抗原性,具有修复神经缺损的可能性。局部使用转化生长因子β1质粒,可在局部发挥免疫抑制作用,降低宿主的免疫排斥反应。     

碱性成纤维细胞生长因子复合缓释降解膜对同种异体移植神经的影响：电生理评价

目的:应用电生理检测指标评价碱性成纤维细胞生长因子复合缓释降解膜对周围神经再生的影响。方法:实验于2005-03/11在沈阳医学院奉天医院实验室完成。①实验材料:碱性成纤维细胞生长因子复合缓释降解膜:主要成分为碱性成纤维细胞生长因子、维生素C抑制剂、明胶、壳聚糖。②实验分组:大耳白兔60只,按随机数字表法分为实验组和对照组,每组30只。异体正中神经制备:每组兔分6次取正中神经,每次取5只兔的正中神经,分别切除双侧正中神经各2.5cm,用受体动物血浆浸泡20min、-196℃液氮冷存21d、室温下复温。手术方法:麻醉后暴露双侧上臂正中神经主干,在相应一致神经部位切除2.5cm,用复温后的异体正中神经缝接。实验组神经缝接处包裹碱性成纤维细胞生长因子复合缓释降解膜,对照组不包膜。③实验评估:术后8,13,26周采用Keypoint肌电诱发电位仪测定运动神经传导速度和复合肌肉动作电位波幅。采用Luzex-F图像分析仪测定移植神经近段和远段的锇酸髓鞘染色横断面标本上有髓神经纤维数量。结果:①运动神经传导速度:术后8,13,26周实验组运动神经传导速度明显快于对照组[分别为(21.62±2.81),(13.16±1.81)m/s;(40.83±3.66),(21.71±2.40)m/s;(50.41±4.84),(31.96±3.17)m/s],两组间差异有非常显著性意义(t=3.51,3.69,3.88,P<0.001)。②复合肌肉动作电位波幅:术后8,13,26周实验组复合肌肉动作电位波幅则明显高于对照组[分别为(1.47±0.16),(0.83±0.07)mV;(4.82±1.27),(2.66±0.31)mV;(14.55±4.16),(8.63±3.36)mV],两组间差异有显著性意义(t=2.34,2.48,2.66,P<0.05)。③有髓神经纤维数量:实验组术后13周神经近段和远段有髓神经纤维比例为2.5∶1,术后26周比例为1.2∶1;而对照组相应时间点有髓神经纤维比例分别为7.2∶1和2.2∶1。结论:神经传导速度和复合肌肉动作电位波幅检测结果提示碱性成纤维细胞生长因子复合缓释降解膜有促进周围神经再生的作用。     

原核表达的重组人骨形态发生蛋白7增高牙槽嵴的实验

背景:牙齿缺失后,牙槽骨内成骨与破骨的动态平衡被打破,牙槽嵴呈现出不可逆转的骨吸收,其后果是大量的牙槽骨丢失;骨形态发生蛋白在骨及牙齿的生长发育和创伤修复中发挥重要作用。目的:观察原核表达的重组人骨形态发生蛋白7对增强牙槽嵴的新骨形成、预防牙槽嵴吸收的作用。设计:对照实验。单位:济南市口腔医院正畸科,山东省医学科学院。材料:实验于2003-06/2004-12在山东省医学科学院完成,采用新西兰大白兔28只,雌雄不限,体质量平均2kg。方法:采用大白兔建立动物拔牙创模型,将大白兔分别拔除左、右下门牙,将骨形态发生蛋白7复合载体2块40μg植入右下门牙(为实验组),仅含磷酸盐缓冲液的空载体2块40μg植入左下门牙(为对照组),术后2,4,8及12周处死动物,取标本进行扫描电镜分析、钙含量及碱性磷酸酶活性测定。主要观察指标:①扫描电镜分析结果。②碱性磷酸酶活性及钙含量。结果:①电镜照片结果:实验组的骨创愈合比对照组提前4～6周。②碱性磷酸酶活性:实验组均明显高于对照组[2周:(38.191±5.384),(19.821±2.084)μkat/g;4周:(160.815±9.669),(126.709±1.634)μkat/g;8周:(378.892±13.086),(225.212±1.884)μkat/g,P<0.01]。③钙含量:实验组均明显高于对照组[2周:(5.592±0.110),(0.913±0.064)mg/g;4周:(8.654±0.177),(1.702±0.071)mg/g;8周:(25.326±0.287),(5.980±0.145)mg/g,P<0.01]。结论:原核表达重组人骨形态发生蛋白7具有良好的增高牙槽嵴、促进拔牙创愈合的作用。     

嗅神经鞘细胞移植修复成鼠半横断胸髓损伤

目的:观察嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植对脊髓轴突再生及神经功能恢复的促进作用。方法:将分离、培养3W的SD大鼠OECs,移植于12只成年SD大鼠胸10水平左侧半横断脊髓两断端;12只对照动物只注入等量DMEM;移植后6个月行下肢功能评价、运动诱发电位(MEP)检测、组织学和免疫组化检查。结果:实验组及对照组动物存活率均为83.4％。实验组9只(9/10)动物下肢功能有不同程度的改善,其中3只可以主动攀登;上述9只动物左下肢可记录到MEP;组织学检查见宿主再生轴突长人断端间组织,周围有髓鞘碱性蛋白阳性物质存在。对照组中2只(2/10)下肢功能稍改善,并能记录到MEP;组织学检查见轴突变性,瘢痕形成,无轴突再生。结论:OECs日移植后可在脊髓中产生髓鞘样物质,促进宿主脊髓轴突再生及神经功能部分恢复。     

骨形态发生蛋白4转基因治疗大鼠的胫骨缺损

目的:观察基因工程技术构建人骨形态发生蛋白4复制缺陷腺病毒的成骨效果。方法:实验于2006-03/08在安徽医科大学第一附属医院实验动物中心完成。实验分组:选取普通级雄性SD大鼠30只,体质量(200±10)g,全部动物胫骨上端部分分别造成8mm×5mm长方形缺损。采用自身对照法,右侧骨缺损为实验组,左侧骨缺损为对照组。实验组植入人骨形态发生蛋白4复制缺陷腺病毒复合明胶海绵,对照组植入单纯明胶海绵。实验评估:术后分别于4,6,8周麻醉后处死10只动物,取材行X线、组织病理、免疫组织化学、透视电镜检查,观察成骨情况。结果:纳入30只大鼠,全部进入结果分析。①大鼠胫骨缺损X线、组织病理学检查结果:术后8周实验组和对照组骨缺损均得到修复,但实验组无论从成骨时间、成骨效果、新生骨量等方面都要优于对照组。其中各时间点实验组骨密度明显高于对照组,差异有显著性意义[4周:(95.91±16.33),(87.93±11.52);6周:(128.34±10.64),(102.41±9.81);8周:(138.36±10.49),(121.56±9.63);P<0.01]。各时间点实验组新生骨占骨缺损面积比明显高于对照组,差异有显著性意义[4周:(41.39±5.65)%,(26.58±5.62)%;6周:(80.35±7.25)%,(65.41±6.52)%;8周:(96.45±2.76)%,(82.22±7.30)%;P<0.01]②术后4周免疫组织化学染色结果:实验组软骨及骨痂内呈强阳性反应,而对照组骨痂内骨形态发生蛋白4表达微弱。结论:人骨形态发生蛋白4重组腺病毒具有良好的成骨活性,骨形态发生蛋白4直接转基因治疗能够加快骨缺损的修复。     

髓鞘碱性蛋白主动免疫对大鼠弥漫性轴索损伤的保护作用

目的:探讨应用髓鞘碱性蛋白主动免疫对弥漫性轴索损伤的保护作用。方法:实验于2004-10/2005-06在河北医科大学附属第二医院中心实验室进行。成年雌性SD大鼠60只,随机分为髓鞘碱性蛋白组、全脊髓匀浆组、卵白蛋白组和对照组4组,每组15只。以不完全福氏佐剂为乳化剂进行主动免疫,①髓鞘碱性蛋白组:自身抗原髓鞘碱性蛋白加不完全福氏佐剂,髓鞘碱性蛋白用量100μg/只。②全脊髓匀浆组:自身抗原全脊髓匀浆加不完全福氏佐剂,全脊髓匀浆用量300μg/只。③卵白蛋白组:非自身抗原卵白蛋白加不完全福氏佐剂,卵白蛋白用量200μg/只。④对照组:磷酸盐缓冲液加不完全福氏佐剂。7d后按Marmarou氏方法制备弥漫性轴索损伤模型。在大鼠弥漫性轴索损伤后3h,6h,1d,3d,5d,7d6个时间点,进行标本取材及形态学检查。包括光镜下苏木精-伊红染色、尼氏染色、Bielschowsky改良法轴索染色,神经微丝68蛋白免疫组织细胞化学检测及透射电镜观察。结果:各组实验动物全部完成实验,无脱落。均进入结果分析。①弥漫性轴索损伤后3h,光镜下发现脑干、小脑上脚及胼胝体的中央灰质和白质区大片细胞肿胀。1d后卵白蛋白组出现少许轴突回缩球,3d后达到高峰。而髓鞘碱性蛋白组及全脊髓匀浆组的变化较轻。②神经微丝68蛋白免疫组织化学检测可见弥漫性轴索损伤后3h各组均出现轴突局部肿胀,6h后神经纤维排列紊乱;至1d时出现少许轴突回缩球,3d后出现更多的轴突回缩球,且神经微丝68蛋白染色减低,髓鞘碱性蛋白组、全脊髓匀浆组、卵白蛋白组与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。5d后以卵白蛋白组减少最明显,而髓鞘碱性蛋白组及全脊髓匀浆组阳性细胞数分别与卵白蛋白组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。③透射电镜观察弥漫性轴索损伤后3h神经细胞轴突肿胀,神经丝排列紊乱。至1d时,卵白蛋白组细胞核变形,亚细胞器亦变形或消失,神经髓鞘分层松解甚至断裂,出现较多的轴索回缩球。而髓鞘碱性蛋白组和全脊髓匀浆组的胞质内线粒体等仍较丰富,排列正常,髓鞘分层轻微,神经微丝较规则。结论:髓鞘碱性蛋白或全脊髓匀浆可减轻损伤对神经细胞的破坏,包括减少尼氏小体的溶解,促进神经微丝68蛋白的表达以及对亚细胞器的保护自身抗原免疫后激活自身免疫T细胞。     

外源性碱性成纤维细胞生长因子在周围神经损伤运动终板再生中的效应

目的:观察神经损伤晚期修复时,碱性成纤维细胞生长因子对运动终板再生的影响。方法:实验于2001-09/2003-12在广东省第二人民医院骨科实验室进行。①选用健康同龄雌性SD大白鼠50只,行右侧坐骨神经切断,12周后再吻合。③将大鼠随机分为两组,每组25只。实验组于神经缝合处放入浸有生理盐水溶解的碱性成纤维细胞生长因子1200u明胶海绵(1cm×0.5cm×0.5cm),术后患肢腓肠肌注射0.2mL生理盐水稀释的碱性成纤维细胞生长因子1200u,隔日1次至28d;对照组缝合处放入同样大小浸有生理盐水的明胶海绵,术后患肢腓肠肌注射等量生理盐水,隔日1次至28d。③术后2,4,6,8,12周实验组和对照组各取5只大鼠行神经电生理和组织学检查及超微结果观察。结果:50只大鼠均进入结果分析。①两组大鼠神经电生理检查结果:术后4,6,8周实验组运动神经传导速度比对照组显著加快(31.7±3.12)比(19.30±3.41)m/s(44.50±3.83)比(30.20±4.63)m/s,(48.08±3.45)比(37.10±3.58)m/s,F=7.15～13.65,P<0.05);术后6,8,12周实验组腓肠肌诱发动作电位显著高于对照组(10.12±3.10)比(6.87±3.82)mV,(15.80±3.21)比(10.12±3.23)mV,(28.70±5.61)比(19.98±4.10)mV,F=5.20～6.12,P<0.05)。②两组大鼠腓肠肌光镜及电镜观察结果:实验组和对照组镜下均可见再生运动终板,可见初级突触间隙形成,术后第8周,运动终板进一步形成,且实验组较对照组运动终板染色深,可见次级突触间隙形成。术后12周,实验组运动终板形态与着色接近正常。结论:神经损伤晚期修复时碱性成纤维细胞生长因子可促进运动终板再生。     

不同方向外力打击致兔颅脑损伤时血清髓鞘碱性蛋白浓度的变化

背景垂直与水平打击产生的受力不同造成破坏性病变程度是否一致?血液中的髓鞘碱性蛋白含量变化与打击形式是否有关联?目的观察不同方向外力打击致兔颅脑损伤时血清髓鞘碱性蛋白浓度以及脑组织形态学变化.设计随机对照实验.单位一所医学院附属医院的神经外科.材料实验于2003-10/2004-01在沈阳医学院中心实验室完成.选择健康家兔30只,雌雄不拘,随机分为垂直打击组和水平打击组,15只/组.方法将全部家兔麻醉后俯卧位固定于多向颅脑损伤打击器的固定台上.分别抽取每只家兔的耳缘静脉血1 mL,用作受伤前髓鞘碱性蛋白对照.垂直打击组实施垂直打击,打击锤直接垂直撞击于颅顶骨上;水平打击组实施水平打击,打击锤水平撞击于兔头侧方.48 h后按相同方法制备两组血清,用作受伤后髓鞘碱性蛋白对照.最后将两组动物断头处死作病理检查.主要观察指标①打击前后两组血清髓鞘碱性蛋白浓度的变化差异.②两组颅脑损伤后的病理形态变化差异.结果按意向处理分析,30只动物均纳入实验.①两组家兔遭遇打击前髓鞘碱性蛋白浓度无明显差异.遭遇打击48 h后髓鞘碱性蛋白浓度垂直打击组与水平打击组亦无明显差异(P＞0.05);②垂直打击组髓鞘碱性蛋白打击前浓度明显低于打击后浓度[(1.68±0.86),(5.25±1.96)μg/L,t=3.226,P＜0.05];水平打击组髓鞘碱性蛋白打击前浓度明显低于打击后浓度[(1.70±0.91),(5.73±2.07)μg/L,t=3.080,P＜0.05].③打击后病理形态变化垂直打击组双侧额顶近中线部位出现皮层脑组织内血管扩张充血,深层白质水肿,血管外和细胞外间隙明显扩大;水平打击组动物除双侧额顶近中线部位出现与垂直打击组相似变化外,相同的病理还可见于颅底面,但深层白质的病理形式与前者基本一致.结论垂直或水平方向的外力打击均可造成脑损伤.打击前后髓鞘碱性蛋白浓度和打击后病理形态学表明这两种不同方向的外力打击使实验模型兔颅脑受损程度大致接近.     

血管生成素-1转染骨髓间充质干细胞在兔骨缺损修复及血供重建中的作用

背景血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)在血管重建及创伤修复中发挥重要作用,对其在组织工程骨修复及血供重建中的作用研究较少.目的研究转染血管生成素-1基因的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)对兔骨缺损的修复作用.设计自身对照的实验研究.地点和对象实验地点为上海交通大学附属第六人民医院动物实验中心.30只6月龄健康新西兰兔作为实验对象.干预以脂质体介导pCDNA3-Ang-1质粒转染体外分离培养的兔BM-SCs,与TCP陶瓷复合,修复兔桡骨15 mm长节段性骨缺损.以未转染细胞组作自身对照,进行观测.主要观察指标电镜观察细胞与TCP材料复合生长情况,毛细血管生长及新骨形成通过组织学方法检测,局部血供及代谢利用核素扫描进行分析.结果细胞与TCP材料复合后生长良好.组织学检查见转染细胞组毛细血管生长及新骨形成活跃,核素扫描见实验侧局部血供丰富、代谢旺盛,99Tcm放射性计数在作用后4,8,12,24周分别为67.74±17.29,87.39±22.42,93.51±24.25,116.43±28.67,与对照侧(35.33±14.48,51.67±17.36,72.47±22.13,89.79±24.71)组间差异有显著性意义(t=2.80～4.22,P＜0.05).结论Ang-1转染细胞组血供增加和骨修复加速,与细胞因子局部定向释放,加强血管形成及骨代谢有关.Ang-1修饰的BMSCs预构人工骨有助于加速骨缺损的修复.     

空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157多重PCR分子检测研究

目的建立同时检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特菌（简称单增李斯特菌）和大肠杆菌O157的多重聚合酶链反应（PCR）检测技术。方法根椐空肠弯曲菌mapA基因序列、单增李斯特菌的编码溶血素（hly）基因序列和大肠杆菌的O157抗原（rfbE）基因序列,分别设计了3对特异引物,PCR扩增的目的基因片段为589 bp、360 bp和194bp;并对反应条件进行了优化。结果对3种致病菌检测,多重PCR检测DNA的敏感度分别为空肠弯曲菌2.264 ng、单增李斯特菌37.92 ng、大肠杆菌2.100 ng,样品检测时间6-8 h。结论该方法操作简便,检测周期短,特异性和敏感度高,为同时检测污染样品中空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157奠定了基础。     

不同动物红细胞制备实验教学用溶血素的方法探讨

目的检测绵羊红细胞(SRBC)和猪红细胞(PRBC)分别经2种程序免疫家兔所制得溶血素的效价,并比较几种溶血素在医学免疫学实验中的应用效果,以寻求制备符合免疫学实验及教学需求的高效价溶血素的较好方法。方法 40只雄性家兔分为4组,分别用SRBC和PRBC,间隔2d经不同程序免疫家兔制备溶血素,再用补体溶血试验检测几种溶血素的效价,比较其在免疫学实验教学中的应用,并探讨高效价溶血素的制备方法。结果经补体溶血试验测得几种溶血素效价,A组兔抗-SRBC血清效价为1∶4 800;B组兔抗-PRBC血清效价为1∶1 200;C组兔抗-SRBC血清效价为1∶1 000,D组兔抗-PRBC血清效价为1∶200。结论用SRBC制备的溶血素效价均高于相同方法下用PRBC制备的溶血素;红细胞抗原相同时,采取先皮内全血注射后耳缘静脉接种的免疫方法制备的溶血素效价也要高于单纯采取耳缘静脉注射的免疫方法制备的溶血素;且PRBC可代替SRBC免疫家兔,制备满足实验教学要求的溶血素。     

转化生长因子β1中和抗体对转化生长因子β诱导肌腱胶原和术后粘连的影响

背景:研究表明,转化生长因子β1在肌腱损伤愈合过程中增加了肌腱细胞胶原的合成和术后粘连的形成.目的:观察转化生长因子β1抗体对转化生长因子β诱导的肌腱细胞胶原产生及术后粘连形成的影响.设计、时间及地点:随机分组观察实验,于2005-09/2006-06在同济医学院实验动物中心完成.材料:选择2-5月龄新西兰大白兔,体质量3.5～4.5 kg.转化生长因子由美国SantaCruz B iotechnology公司提供.方法:取兔屈指肌腱分离肌腱成纤维细胞、腱外膜细胞和腱内膜细胞,将细胞随机分成2组,实验组加入1 μg/L转化生长因子β后,再加入0.1,0.5,1.0mg/L转化生长因子β1中和抗体,对照组不添加任何试剂,酶联免疫吸附实验测定Ⅰ型胶原.取84只兔行中趾屈指肌腱切断吻合术,将其中36只兔随机分成3组,腱鞘内分别注入生理盐水、1.0,2.0 mg/L转化生长因子β1中和抗体,4,8周后取出肌腱行肌腱粘连检测、生物力学测定、组织学观察和扫描电镜观察;余48只兔随机分成2组,腱鞘内分别注入生理盐水和1.0mg/L转化生长因子β1中和抗体,1,2,4,8周后取出肌腱,原位杂交方法测定肌腱转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA的表达.主要观察指标:各组兔肌腱细胞胶原产生及术后粘连情况.结果:酶联免疫吸附实验显示,转化生长因子β1能明显提高肌腱细胞Ⅰ型胶原的产生;转化生长因子β1抗体能降低3种细胞Ⅰ型胶原的产生,随抗体质量浓度增加,Ⅰ型胶原水平逐渐降低,且呈剂量依赖性;术后4,8周,与1.0,2.0mg/L转化生长因子β1组比较,生理盐水组屈趾肌腱滑动距离较短,模拟主动屈曲度明显受限(P<0.05),最大抗断裂载荷各组间比较差异无显著性意义(P>0.05).扫描电镜和组织学观察结果显示,术后4,8周生理盐水组胶原纤维排列紊乱,1.0,2.0 mg/L转化生长因子β1组胶原纤维排列整齐.原位杂交结果显示,术后各时间点1.0 mg/L转化生长因子β1组转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA表达均低于生理盐水组(P<0.05).结论:转化生长因子β1抗体能有效抑制转化生长因子β1在肌腱损伤修复中的作用,减少粘连形成.     

新生大鼠实验性脑室周围白质软化模型的建立及评价

背景:脑室周围白质软化症由于缺乏公认有效的动物模型,影响了对脑室周围白质软化发病机制和干预的研究,因此建立可靠的动物模型来进行脑室周围白质软化症的研究很有必要。目的:制作2日龄SD大鼠脑室周围白质软化动物模型。设计:随机对照动物实验。单位:四川大学华西第二医院儿科。材料:选用36只生后2dSD大鼠,清洁级,雌雄不限,体质量6～8g,由四川大学华西实验动物中心提供,小鼠抗O4由Chemicon公司提供,兔抗胶质纤维酸性蛋白、兔抗β-淀粉样蛋白前体蛋白、兔抗髓鞘碱性蛋白、SABC免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供,兔抗小鼠IgG-FITC由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。方法:实验于2005-05/12在四川大学华西第二医院妇儿实验室完成。随机摸球法将大鼠分为脑室周围白质软化组和对照组,每组18只。脑室周围白质软化组行右侧颈总动脉结扎手术,体积分数为0.06氧气和体积分数为0.94氮气处理4h,分别在缺氧72h,14d及28d取6只处死。对照组只进行右侧颈总动脉分离术而不作结扎及缺氧处理,时间段与脑室周围白质软化组配对。①脑组织病理学观察:各组大鼠经心脏灌注固定行常规苏木精-伊红染色及电镜检查。②免疫组织化学检测:造模72h,采用胶质纤维酸性蛋白、β-淀粉样蛋白前体蛋白、小鼠抗O4免疫组化方法观察脑室周围白质软化组脑组织组织学变化;造模14d,采用兔抗髓鞘碱性蛋白免疫组化方法观察髓鞘碱性蛋白改变。③神经行为学检测:术后28d对两组小鼠进行悬吊试验(大鼠前腿抓住水平玻璃棒,离开桌面45cm记录大鼠掉下的时间,评分标准:1分:<10s;2分:10～30s;3分:30s～2min;4分:2～5min;5分:>5min)、倾斜板试验(大鼠倒置于45°斜面上,记录大鼠转为头向上>135°角度的时间)、旷场试验(无顶方盒箱底用墨线分成9个等分小格,大鼠置于中央小方格内,观察30s内活动情况,大鼠1/2以上身体从所在方格进入相邻方格记1分;大鼠后肢站立计1分;二者相加为其总分)、圆筒实验(将大鼠放入20cm×30cm×5cm的圆桶内,记录大鼠后腿站立时,前爪最初承重触及桶壁次数,以同侧触及次数/总触及次数×100%,对侧触及次数/总触及次数×100%作分析),记录各项评分并进行统计学处理。主要观察指标:①苏木精-伊红染色和电镜观察缺氧缺血后脑组织病理学改变。②免疫组化兔抗胶质纤维酸性蛋白、兔抗β-淀粉样蛋白前体蛋白、兔抗髓鞘碱性蛋白和小鼠抗O4观察缺氧缺血后相应细胞和组织改变情况。③神经行为学评价观察缺氧缺血后大鼠神经行为改变(各实验得分)。结果:实验大鼠36只均进入结果分析。①光镜和电镜病理学检查发现脑室周围白质软化组大鼠早期可见显著侧脑室周围脑白质损害,远期可见显著的脑室扩大,髓鞘减少。②脑室周围白质软化组大鼠脑白质胶质纤维酸性蛋白阳性细胞积分吸光度值高于对照组(6566.93±455.56,1069.32±791.71,P<0.05),胶质纤维酸性蛋白阳性细胞平均直径大于对照组[(11.69±0.97),(8.24±0.22)μm,P<0.05],兔抗β-淀粉样蛋白前体蛋白阳性细胞积分吸光度值高于对照组[(59304.07±6864.03),(15132.29±2455.52),P<0.05],兔抗髓鞘碱性蛋白阳性细胞积分吸光度值低于对照组[(21764.29±1981.63),(69174.72±3199.90),P<0.05],小鼠抗O4阳性标记的异常细胞数大于对照组[(54.08±11.99),(1.25±0.51)个,P<0.05]。③脑室周围白质软化组大鼠悬吊试验玻棒悬吊时间短于对照组[(1.27±0.14),(4.24±0.59)min,P<0.05],倾斜板试验转头时间长于对照组[(7.17±2.32),(3.27±0.82)s,P<0.05],旷场试验评分低于对照组[(3.68±0.82),(12.67±1.00)min,P<0.05],圆筒实验显示脑室周围白质软化组大鼠左侧肢体活动较右侧肢体减少[(19.25±2.77),(64.55±0.36)%,P<0.05]。结论:2日龄SD大鼠单侧颈总动脉结扎-缺氧模型病理组织学观察可见明显的脑白质损害,神经行为明显异常,符合脑室周围白质软化病理及行为改变,模型制作成功。     

双基因转染兔骨髓基质干细胞与胶原/羟基磷灰石复合修复骨缺损及对假体-骨界面整合的影响

目的 构建假体周围骨缺损模型,将慢病毒介导的骨形态发生蛋白2 （BMP-2）和转化生长因子β3 （TGF-β3）双基因转染兔骨髓基质干细胞（MSCs）与胶原/羟基磷灰石复合,后植入假体周围,观察其对假体-骨界面骨整合的影响.方法 成年健康清洁新西兰白兔24只,雌雄不限,体重2.5～3.5 kg,于两侧股骨髁间造成纵向骨缺损,植入光滑钛合金假体后保持骨假体周围2 mm骨缺损,共48侧,实验组（左侧）及对照组（右侧）各24侧,采用压缩植骨技术,重建股骨髁假体周围骨缺损,分别植入组织工程骨（双基因组）、单纯胶原/羟基磷灰石（细胞组）,打压紧密并完全覆盖植入体.于术后4、8、12周时麻醉法分别处死8只兔子,行大体观察、X线观察、组织形态计量学及生物力学测定评估组织工程化骨修复骨缺损的能力及对假体-骨界面骨整合的作用.结果 术后4周,对照组、实验组X线表现无显著差别,假体周围主要为纤维结缔组织,假体骨结合强度分别为0.3388±0.7206,0.6845±0.7186,差异有统计学意义（P＜0.01）,假体骨接触率均为0;术后8周,实验组X线表现见假体周围有新骨形成,对照组、实验组假体骨结合强度分别为0.6468±0.7852,1.1824±0.0800,假体骨接触率分别为（5.93±0.60）％,（23.35±3.76）％,二者差异均有统计学意义（P＜0.01）;术后12周实验组X线表现见假体周围为骨组织,组织学所见植入体周围为连续性骨接触,对照组、实验组假体骨结合强度分别为1.4419±0.1021,2.7622±0.1802,假体骨接触率分别为（15.27±2.34）％,（39.76±1.85）％,假体结合强度与假体骨接触率均高于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.01）.对照组、实验组假体骨结合强度及假体骨界面骨接触率随着时间的延长而增大,术后8周与4周比较,术后12周与8周比较,数值均增高,有显著性差异（P＜0.01）.结论 组织工程化骨修复假体周围骨缺损,可促进假体周围新骨形成,提高假体-骨界面骨整合,改善假体稳定性.     

磷酸三钙／透明质酸／Ⅰ型胶原／骨髓基质胞复合物修复骨缺损与自体骨的比较

背景: 复合材料作为种子细胞的载体修复骨缺损较传统的自体骨移植具有创伤小、不存在供区限制的优点。目的: 观察由磷酸三钙人工骨 /透明质酸 /I 型胶原复合物作为诱导后的骨髓基质细胞载体修复兔桡骨骨缺损的能力及作为自体骨移植替代物的可能性。设计: 随机对照实验。单位: 武汉大学人民医院骨科。材料: 实验于 2003- 09/2004- 06 在武汉大学人民医院骨科进行。选择 6个月新西兰大白兔 31 只, 平均体质量 1.5～2.0 kg。随机分为对照组和实验组。对照组 4 只, 实验组 27 只。方法: ①31 只大白兔均做骨髓基质细胞体外诱导培养, 观察诱导后的骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色的阳性细胞率。扫描电镜观察磷酸三钙人工骨 / 透明质酸 /Ⅰ型胶原复合物结构。②手术制造桡骨 2 cm 长骨缺损, 8周后实验组一侧以磷酸三钙人工骨 / 透明质酸 /Ⅰ型胶原复合物 / 骨髓基质细胞植入兔桡骨骨缺损模型处, 另一侧植入自体骨; 对照组空白植入。③实验组所有动物随机在术后 4, 8, 12 周 3 个时间点处死, 4、8 周各6 只, 12 周 15 只; 对照组动物在 12 周处死。分别进行大体观察、X 射线摄片、HE 染色、无机质含量测定、12 周时标本进行成骨面积及生物力学测试, 比较各组修复骨缺损的效果。主要观察指标: 诱导后的骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色的阳性细胞率;磷酸三钙人工骨 / 透明质酸 /Ⅰ型胶原复合物结构; 大体观察; X 线摄片; HE 染色及无机质含量测定; 成骨面积及生物力学测试。结果: 31 只大白兔均进入结果分析。①诱导培养后碱性磷酸酶阳性细胞率达 75%。②扫描电镜观察显示 3 种材料均匀分布, 有大量的微孔结构。③复合物组与自体骨组 12 周时成骨面积分别为 (72.5±3.6)%;(76.7±6.2)%, (P > 0.05) 。④复合物组与自体骨组最大弯矩分别为(521.0±61.1) , (554.3±53.3) N·mm; 施力点最大位移分别为(0.816±0.071), (0.870±0.103) mm, 差异无显著性意义(P>0.05)。⑤复合物于4、8 和12周无机质含量测定分别为75% ,57% ,42%, 表明材料中的无机成分随时间的延长逐步降解。⑥大体观察X线片、组织病理学检查、生物力学测试结果显示, 随着时间的延长自体骨组和磷酸三钙人工骨 / 透明质酸/Ⅰ型胶原复合物/骨髓基质细胞填充组能修复骨缺损, 对照组不能修复。结论: 磷酸三钙人工骨/ 透明质酸/Ⅰ型胶原 /骨髓基质细胞复合物与自体骨具有相同的骨损修复能力, 可作为自体骨移植的替代物。