荧光定量PCR技术检测石蜡包埋组织结核杆菌DNA的应用评价

[摘要] 目的 探讨荧光定量PCR技术（FQ-PCR）检测石蜡包埋组织结核分枝杆菌DNA（TB-DNA）在结核病诊断中的应用价值。方法233例的石蜡包埋组织标本采用实时荧光定量PCR技术检测TB-DNA，同时进行抗酸染色和组织病理学检查，以临床诊断结果为金标准，分别计算TB-DNA、抗酸染色和病理学检查的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值。结果129例临床诊断为结核病的组织标本中，TB-DNA阳性107例， TB-DNA阴性22例；104例非结核病的标本中， TB-DNA阳性2例，TB-DNA阴性102例。TB-DNA检测的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别为82.95%、98.08%、89.70%、98.17%、82.25%，均高于抗酸染色的63.57%、95.19%、77.68%、94.25%、67.80%和病理学检查的77.52%、96.15%、85.84%、96.15%、77.52%。结论 FQ-PCR技术检测石蜡包埋组织的TB-DNA用于各种结核病的诊断具有灵敏度高、特异性强的优点，与病理学检查相结合可以大大提高结核病的诊断率，适合于临床推广应用。     

涂阴PCR-TB-DNA阳性患者组织标本病原学研究

对146例胸水或痰涂阴PCR-TB-DNA阳性患者62例活检组织和84例石蜡包埋组织进行了PCR-TB-DNA扩增和抗酸染色检测,结果146例患者病理诊断结核108例,肿瘤24例,炎症14例;组织标本抗酸染色阳性107例,其中杆菌型31例,L型76例(结核组、肿瘤组和炎症组分别为99例、7例和1例);组织标本PCR检测阳性121例(结核组、肿瘤组和炎症组分别为106例、13例和2例);38例非结核患者有结核病和结核密切接触史者33例。临床标本PCR结果与组织标本的病理学诊断、抗酸染色和PCR结果符合率分别为74.0％(108/146)、73.3％(107/146)和82.9％(121/146);组织标本抗酸染色和PCR检测总符合率为83.6％。提示PCR-TB-DNA扩增对于涂阴结核患者快速诊断有很大帮助,临床标本PCR阳性大多为结核所致,非结核患者有结核感染史者PCR大多数可出现阳性;PCR-TB-DNA阳性除抗酸菌杆菌型外大多数与抗酸菌L型感染有关。     

巢式PCR法在结核病与结节病鉴别中的应用

目的观察结核病和结节病病理组织中结核分支杆菌DNA检出情况,探讨巢式PCR方法在结核病与结节病鉴别中的作用。方法以结核分支杆菌内插入序列IS6110为扩增靶序列,用巢式PCR法检测37例结核病和31例结节病石蜡包埋病理组织中结核菌DNA,以H37RV标准结核菌株作阳性对照,鼠胎肺作阴性对照,并与同步进行的普通PCR结果作比较。结果对照组分别均为阳性及阴性结果,37例结核病组中36例呈阳性结果（阳性率为97．3％）,31例结节病组中8例呈阳性结果（阳性率为25．8％）,经统计学分析两组阳性率有显著差异;与普通PCR方法比。采用巢式PCR方法对结核菌DNA检出阳性率明显提高。结论用巢式PCR法检测石蜡包埋病理组织中结核菌DNA可作为鉴别结核病和结节病的方法之一。     

PCR反向膜杂交技术检测临床标本中结核分枝杆菌的临床意义

目的 探讨聚合酶链反应（PCR）反向膜杂交技术检测临床标本中结算分枝杆菌（TB）DNA的价值。方法 用PCR反向膜杂交技术检测522例结核及60例非结核患者临床标本中TB－DNA,同时用培养、抗酸染色涂片及常规PCR法作对照。结果 PCR反向膜杂交法阳性率为80．6％（556／690）,培养为18．1％（125／690）,镜检为13．9（96／690）,常规PCR为59．6％（411／690）,PCR反向膜杂交法与常规法比较（P＜0．001）,差异具显著意义。PCR反向膜杂交法阳性检出率高于常规PCR,差异具显著意义（P＜0．001）;该技术假阳性为零。结论 PCR反向膜杂交技术检测临床标本中TB－DNA具有快速、高度特异性和敏感性,可为结核病的临床早期诊断提供一种新的病原学诊断手段。     

活检组织结核杆菌NA检测在临床病理应用的探讨

目的：探讨活检标本石蜡组织中结核分枝杆菌DNA检测在临床病理诊断与鉴别诊断中的价值。方法：采用PCR杂交梳法及抗酸染色法检测本院90例病理组织学改变不典型的可疑活检标本。结果：PCR杂交梳法检测可疑组织中结核杆菌DNA阳性率23．33％（21／90）；抗酸染色阳性率10％（9／90），两有显差异（P＜0．05）。PCR杂交梳检测阳性病例经随访证实临床抗结核治疗后均有好转。结论：临床活检标本石蜡组织中结核分枝杆菌DNA检测具有特异性强，敏感性高，操作简便省时的特点，有助于组织学改变不典型病例的病理诊断与鉴别诊断，具有重要临床意义和应用价值。     

结核感染T细胞检测在骨关节结核中的诊断价值

目的：评价结核感染T细胞检测（tuberculous infection of T cells spot test,T-SPOT．TB）在疑似骨关节结核病中的诊断价值。方法选取80例确诊为骨关节结核患者和44例排除结核患者。分别进行抗酸染色、结核菌培养、实时荧光定量 PCR 检测及 T-SPOT．TB,比较并分析检测结果。结果 T-SPOT．TB 的敏感度、特异度和准确度分别为82．5％、75．0％、79．8％。T-SPOT．TB 的阳性检出率显著高于抗酸染色、结核分枝杆菌培养（P ＜0．05）,而在不同疾病部位（脊柱、四肢关节）及不同病程分组间阳性检出率差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论 T-SPOT．TB 可以作为骨关节结核病的重要辅助诊断方法。     

T细胞斑点试验在结核病诊断中的效果分析

目的探讨T细胞斑点试验在结核病诊断中的价值。方法收集2012年7月至2015年3月海口市人民医院收治的疑似结核病患者476例,分别采用结核感染T细胞斑试验(T-SOPT.TB)和结核菌素皮肤试验(TST)检测,并与最终临床诊断结果进行对比;评价T-SOPT.TB在结核感染中的诊断价值。结果 476例受试对象中临床确诊为结核病的患者为194例,其中肺结核122例、肺外结核58例、结核性胸膜炎14例。最终临床检查结核感染阳性检出率为40.8%(194/476),T-SOPT.TB阳性检出率为39.9%(190/476),TST阳性检出率为45.4%(216/476);以最终实验室细菌学或组织学检查作为金标准,T-SOPT.TB检测特异度为98.9%(279/282),灵敏度为96.4%(187/194),准确度为97.9%(466/476);T-SOPT.TB检测Kappa值为0.956,两者一致性良好;TST检测Kappa值为0.504,两者一致性中等。结论 T-SOPT.TB对结核感染的诊断价值优于TST,具有较高的特异度、灵敏度和准确度;对疑似结核感染的患者快速、准确诊断具有重要的参考价值。     

石蜡包埋组织中结核菌抗酸染色与PCR检测意义的探讨

对６１ 例拟诊为结核病和１０ 例正常胎儿肺组织的石蜡包埋组织分别进行组织化学方法（ 抗酸染色）和ＰＣＲ检测结果,结核组６１ 例中,抗酸染色阳性２８ 例,阳性率为４５．９ ％ ;ＰＣＲ检测阳性４０ 例,阳性率为６５．６ ％ 。两种方法阳性检出率差异显著（Ｐ＜０ ．００５） 。对照组１０ 例,两种方法检测均为阴性。结果表明,ＰＣＲ 检测石蜡组织中的结核菌,具有较高的灵敏度和特异性。     

二阶控温聚合酶链原位扩增法检测石蜡切片中结核杆菌DNA

传统诊断结核病的方法依赖临床症状和涂片染色镜检及细菌培养,检出阳性率低而需时长(4～6周)。我们试用二-阶控温聚合酶链反应(PCR)法扩增石蜡切片组织内结核杆菌DNA,初步获得成功。1 材料和方法 石蜡包埋肺组织尸检标本20例,来自病理学教研室1964～1990年间尸检存档材料,     

TB—PCR与胸膜活检在结核性渗出性胸膜炎中的应用价值

目的研究结核分枝杆菌荧光定量聚合酶链反应（TB—PCR）检测技术及胸膜活检在诊断结核性渗出性胸膜炎的临床价值。方法282例确诊为结核性渗出性胸膜炎患者行胸腔穿刺抽液术,胸液送检TB—PCR,同时行针刺胸膜活检,胸膜活检组织标本送检病理检查,比较两种检测方法的阳性率。结果TB—PCR检测阳性率55．3％．明显高于胸膜活检阳性率37．9％,差异有高度统计学意义（P〈0．01）,聚合酶链式反应检测明显优于胸膜活检。两种方法联合检出阳性率为64．2％。结论TB—PCR是目前针对结核分枝杆菌检测阳性率较高的方法;联合胸膜活检,可提高对结核性渗出性胸膜炎的早期诊断。     

利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。     

膜-反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌

目的探讨膜-反向斑点杂交技术（RDB）在病理石蜡组织和肺泡灌洗液检测结核杆菌的临床应用价值。方法以97例病理石蜡组织、97例肺泡灌洗液为研究对象,分别以膜-反向斑点杂交、实时荧光PCR（RT—PCR）、抗酸染色三种方法检测结核杆菌,对三种方法进行方法学评价。结果结核组病理石蜡组织、肺泡灌洗液三种方法检测的总阳性率分别为：抗酸染色为32．8％,RT—PCR阳性率为82．8％,RDB阳性率为89．9％,两两比较差异均有统计学意义（均P〈0．05）,对照组三种方法检测结果均为阴性;三种结核杆菌的检测方法的方法学评价,RDB灵敏度（90．6％）、约登指数（0．91）、符合率（93．9％）、阴性预测值（85．0％）均较好。结论膜-反向斑点杂交技术在病理石蜡组织和肺泡灌洗液结核杆菌的检测上有很高的临床应用价值,值得临床推广应用。     

5种病原学检查在结核性病理组织及气道分泌物中的检测差异

目的 探讨5种病原学检查在结核性病理组织及气道分泌物标本中的阳性率差异及意义。方法 收集2017年武汉市肺科医院外科经手术确诊结核合并肺结核且接受气道分泌物检查的166份病例的结核病原学检查结果,根据标本来源不同分为手术标本病原学检查组（简称手术标本组）与气道分泌物标本病原学检查组（简称气道分泌物标本组）,对抗酸染色涂片（AFB）、实时荧光定量PCR（TB-DNA）、RNA恒温扩增实时荧光检测（SAT-TB）、Gene-X-pert/RIF (X-pert)、结核培养（CTB）等结果进行回顾分析。结果 以临床诊断为标准,手术标本组和气道分泌物标本组总阳性率分别为86.14%、21.08%,X-per阳性率分别为85.89%、29.76%;两组的五种检测技术阳性率由高到低排序一致,均为X-pert、TB-DNA、SAT-TB、CTB、AFB;以手术标本结果为诊断标准,气道分泌物标本结果与其一致性均较差（Kappa<0.4）,五种检查阳性率均低于手术标本,且差异具有统计学意义（McNemer检验,P<0.05）。结论 病理组织标本结核病原学阳性率高于气道分泌物标本,临床应重视对菌阴肺结核患者的病理组织标本进行X-pert、CTB等检查。     

用母体外周血中胎儿游离DNA检测胎儿SRY基因的研究

目的探索从孕妇外周血浆中检测胎儿躲y基因的高灵敏性及高准确性方法。方法应用PcR、实时荧光定量PcR、PEP—PcR技术,检测33例妊娠8～14周的正常孕妇血浆中游离胎儿DNA的脓y基因。组织标本躲y基因检测结果作为性别判定的标准。结果33例孕妇血浆标本检测职y基因,普通PcR检出的灵敏性为58．82％,特异性100％。PEP—PCR的灵敏性为88．24％,特异性100％。荧光定量PCR的灵敏性为88．24％,特异性100％。结论PEP—PCR技术和荧光定量PcR技术均可以提高胎儿游离DNA检测的灵敏度及准确性．可用于进一步染色体疾病的无创性产前筛查研究。     

Xpert MTB／RIF 系统快速检测结核分枝杆菌及利福平耐药性研究

目的：探讨 Xpert MTB/RIF 快速检测系统在结核病诊断及利福平耐药性检测中的价值。方法收集2012年12月－2013年12月在新疆医科大学第一附属医院和乌鲁木齐市胸科医院住院的疑似肺结核患者312例的痰液标本,同时进行涂片抗酸杆菌检查和用罗氏固体培养基进行结核杆菌培养,用比例法进行药物敏感性试验,并用 Xpert MTB/RIF 系统进行结核分枝杆菌 DNA 及利福平耐药性检测,结果312例痰液标本中,涂片和培养均阳性的124例患者 XpertMTB/RIF 检测的敏感度为94．3％（117/124）,涂片阴性而培养阳性者的敏感度为92．8％（26/28）,涂片阴性而符合临床标准者 XpertMTB/RIF 检测的敏感度为47．6％（10/21）,与培养结果比较, XpertMTB/RIF 检测的总敏感度为94．1％（143/152）;增加检测的次数（2次检测）可将灵敏度提高到98．7％％;对非结核病患者 XpertMTB/RIF 检测的特异度为99．3％（138/139）。与比例法相比,Xpert MTB/RIF 检测利福平耐药的灵敏度为90．9％（10/11）,特异度为99．3％（140/141）。除涂片阴性者外,Xpert MTB/RIF 半定量检测结果与涂片结果有较好的一致性。结论Xpert MTB/RIF 系统检测结核分枝杆菌及利福平耐药性具有较高的临床应用价值,且方法简便、快速。     

PCR-ELISA法及荧光定量PCR法检测HBV感染者精液HBV-DNA的探讨

目的探讨PCR-ELISA法及荧光定量PCR法（FQ-PCR）检测HBV感染者精液中HBV-DNA检出情况及其临床意义。方法选取男性HBV感染者60例,采集患者精液、静脉血,用PCR-ELISA法来检测患者精液及血清中HBV-DNA。同时采用荧光定量PCR检测患者精液中HBV-DNA。结果PCR-ELISA法：60例精液标本HBVDNA阳性12例,阳性率18.33%,拷贝数为1.267×10^3-6.532×10^5/ml,平均拷贝数为4.781×10^4/ml;60例血清标本阳性53例,阳性率为88.33%,拷贝数1.462×10^3-5.153×10^7/ml,平均拷贝数为2.451×10^6/ml。荧光定量PCR法：60例精液标本HBVDNA阳性13例,阳性率21.67%,拷贝数为1.357×10^3-7.113×10^5/ml,平均拷贝数为4.983×10^4/ml;两种检验方法检测精液HBV-DNA的阳性检出率比较无显著性意义（P〉0.05）。结论PCR-ELISA法与荧光定量PCR定量检测精液中HBVDNA同样具有较强的特异性和灵敏度,为临床了解乙型肝炎患者精液中肝炎病毒的感染状态提供了帮助,具有重要的临床意义。     

套式PCR在检测结核分枝杆菌embB基因突变中的应用价值

目的采用套式PCR（二次扩增）替代传统PCR（一次扩增）扩增痰中结核分枝杆菌embB基因。探讨其在检测结核分枝杆菌embB基因突变中的应用价值。方法选取本院已确诊的活动性肺结核住院病人68例和非结核肺部感染病人16例，嘱其留取晨痰，分别进行套式PCR扩增和传统PCR扩增，再行产物分析。结果68例活动性肺结核病人传统PCR扩增embB基因阳性结果为29例，阳性率为42．6％。套式PCR扩增embB基因阳性结果为47例。阳性率为69．1％，两者比较差异有显著性（X^2=9．66，P〈0．05）；16例非结核病人传统PCR和套式PCR和检测结果均为阴性，两者特异度均为100％。结论检测结核分枝杆菌embB基因突变，套式PCR灵敏度高于传统PCR．两者特异度相同，套式PCR能快速、敏感、特异地扩增结核分枝杆菌embB基因片段。     

快速检测结核分枝杆菌γpoB基因突变的研究

目的 :应用PCR SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌γpoB基因突变 ,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 :以结核分枝杆菌H37Rv为对照、5 0例耐RFP(单耐和多耐 )结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本 ,采用PCR SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌γpoB基因突变。结果 :5 0例耐RFP菌株中有 45例PCR SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别 ,与药敏试验结果做对比 ,PCR SSCP检测敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;12例敏感菌株与H37Rv条带一致 ,35份肺结核病人痰标本 ,2 1份痰PCR扩增阳性 ,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别 ,而用PCR SSCP 2 8份图谱与H37Rv有差别 ,阳性率为 80 %。结论 :PCR SSCP检测结核分枝杆菌γpoB基因突变快速、简便、易行 ,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定 ,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法     

肺癌K-ras基因突变的二步PCR检测及其临床应用

目的　探讨高敏感性Kras基因点突变检测方法在肺癌临床的应用价值。方法　应用二步(巢式)聚合酶链反应结合限制性片断多态性分析方法(PCRRFLP)检测临床肺癌标本Kras基因第12密码子点突变。结果　二步PCRRFLP法检测Kras点突变的敏感性较一步法提高约64倍。55例肺癌石蜡包埋标本中,Kras点突变检出率为47.3%;对另67例纤支镜标本进行基因检测,以Kras突变进行基因诊断的敏感性为70.9%,特异性为91.7%。结论　二步PCRRFLP法对临床肺癌标本Kras点突变检出率较高,对肺癌有一定的辅助诊断价值     

实时荧光定量聚合酶链反应技术在肾结核病理诊断中的应用价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术在肾结核病理诊断中的应用价值。方法回顾性收集我院泌尿外科通过后腹腔镜技术或开放技术行肾切除术后石蜡组织标本55例患者的临床资料,以术前尿结核分枝杆菌培养结果为金标准,并结合术后病理诊断结果,将研究对象分为结核肾病组25例(阳性组),非结核肾病组30例(阴性组)。采用Taqman探针法实时荧光定量PCR技术和抗酸染色技术检测每个石蜡组织标本,对比分析两种检测技术在肾结核病理诊断中的诊断效能,绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线评估两种方法在肾结核病理诊断中的价值。结果实时荧光定量PCR技术检测的敏感度与抗酸染色技术检测的敏感度分别为80.0%(20/25)和48.0(12/25),前者相比后者敏感度提高了32.0%,差异有统计学意义(χ²=5.556,P=0.018)。荧光定量PCR检测的特异度、阳性预测值、阴性预测值均高于抗酸染色检测的结果,但两者比较差异均无统计学意义(P>0.05)。荧光定量...