Oct-4在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中的作用

目的应用RNA干扰方法抑制胚胎来源神经前体细胞Oct-4基因表达,以观察Oct-4基因在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中的作用。方法采用“五步法”诱导小鼠胚胎干细胞向神经元分化,进入扩增期后给予Oct-4干扰RNA,采用Real-timePCR方法检测干扰后细胞Oct-4表达情况,进行分化计数,免疫组化鉴定分化后的细胞,计数分化后的新生神经元比例。结果Oct-4干扰RNA使神经前体细胞Oct-4表达下降约40％,正常未干扰胚胎干细胞分化的神经元为（75．5±5．2）％,GFP组为（73．8±4．7）％,Oct4干扰RNA组为（33．8±2．9）％,与正常组和GFP组比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论采用RNA干扰方法可以有效降低神经前体细胞0ct-4的表达,使分化后新生神经元生成减少,证实了Oct-4基因在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中发挥着重要作用。     

丙戊酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化中对Oct-4的影响

目的探讨丙戊酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成神经样细胞分化中对Oct-4的影响。方法体外分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,将其分为两组:对照组,不加丙戊酸,细胞加入预诱导液(含1μmol/Lβ-ME,10%FBS的DMEM/F12)培养24 h,然后换诱导液(含200μmol/L BHA,2%DMSO的DMEM/F 12)诱导5 h。实验组,诱导前12 h,在细胞培养液中加入丙戊酸。用倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学法检测NSE、GFAP、Oct-4蛋白的表达。Western blot检测细胞内NSE及GFAP蛋白Oct-4的表达。结果倒置显微镜下观察可见骨髓间质干细胞呈纺锤状,诱导后出现突出,向周围伸出明显突起,呈现神经细胞样形态,且实验组的细胞突起数量和长度多于对照组;Western blot检测实验组的NSE、GFAP蛋白表达高于对照组,Oct-4的表达实验组高于对照组。结论丙戊酸能诱导骨髓间充质干细胞分化成神经样细胞,同时其增强了Oct-4在BMSCs体外定向诱导分化中的表达。     

Nanog基因在脑肿瘤干细胞中的表达及意义

目的 探讨Nanog基因在脑肿瘤干细胞(BTSCs)的表达以及生物学意义.方法 无血清悬浮培养法从U87胶质瘤细胞株分离培养BTSCs.免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测U87肿瘤细胞及其BTSCs中Nanog的表达,双重免疫细胞化学染色法检测Nanog/CD133共表达情况.结果 在U87胶质瘤细胞株中成功分离培养出BTSCs,Nanog蛋白在U87肿瘤细胞和BTSCs中的阳性率分别为(64.1±18.2)%和(97.2±1.8)%,且Nanog+/CD133+细胞共表达于部分细胞中;Nanog mRNA相对含量在U87肿瘤细胞和BTSCs中分别为0.3851±0.0771和0.6032±0.1223,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 U87细胞株中存在BTSCs.Nanog在U87细胞株中高表达,在BTSCs中表达水平高于U87肿瘤细胞且Nanog与CD133存在共表达,表明Nanog与BTSCs关系密切.

Abstract：

Objective To detect the expression of Nanog in glioma cell line U87 and the relationship with BTSCs.Methods BTSCs were isolated from glioma cell line U87 and cultured in simplified serum-free neural stem cell medium by nanosphere suspension culture method spheres,and purified continuously through the monoclonal formation experiment.The immunofluorescence staining of cells was employed to identify the BTSCs and differentiated cells.The expression of Nanog mRNA was examined by RT- PCR and Nanog protein was detected by immunocytochemistry in U87 and BTSCs respectively.Double immunocytochemistry staining was used to detect the co- expressions of Nanog/CD133.Methods BTSCs were isolated ,cultured and purified successfully from glioma cell line U87.Both Nanog mRNA and protein were expressed in U87 and BTSCs.The expression rate of immunopositive cells was (64.1 ±18.2)% in U87 and (97.2±1.8)% in BTSCs respectively(t =5.719,P =0.000).The Nanog+/CD133+ cells could be found co-expressed in U87 and BTSCs by using double immunocytochemistry s taining.The relative level of Nanog expression was 0.3851 ±0.0771 in U87 and0.6032±0.1223 in BTSCs(t =4.770,P =0.000).Conclusion BTSCs exist in glioma cell line U87 in vitro.The levels of Nanog expression in BTSCs were higher than that in U87.Nanog expression was associated with the genesis and differentiation state of glioma.The overexpression of Nanog and co- expression of Nanog/CD133 showed that it might contribute to the existence of BTSCs,which lay a foundation to the further explore its role in biological behaviour of glioma.Expression of Nanog in U87 indicated the close relationship between glioma and stem cell,and suggested Nanog may play a critical role in the development of glioma.     

两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征

背景：目前对干细胞的体外分离纯化技术大多是建立在对细胞表面标记识别的基础之上，包括单抗贴壁铺展法、流式细胞分选法、免疫磁珠分选法等，但操作复杂，价格昂贵。 目的：观察两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征。 设计、时间及地点：开放性实验，于2008-03/2009-03在新疆医科大学干细胞研究室完成。 材料：10例羊水标本来自怀孕16~22周行产前诊断或自愿引产的孕妇，在超声引导下行羊膜腔穿刺取得20~40 mL羊水。 方法：采用改进的两步培养法分离和培养人羊水间充质干细胞，首先同一步法将羊水标本离心、接种、培养至出现梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落。然后将上清培养液转移至新的25 cm2培养瓶中继续培养，至出现梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落且达70%汇合后消化，改用α-MEM培养基，同样添加碱性成纤维细胞生长因子，接种培养，记为第1代。 主要观察指标：①原代及传代羊水间充质干细胞形态学变化。②羊水间充质干细胞细胞核型、细胞周期、生长曲线和集落形成能力测定。③流式细胞仪、免疫荧光和RT-PCR检测表面抗原和细胞因子。 结果：实验成功分离、培养和传代人羊水间充质干细胞。①孕中期羊水细胞原代培养平均7 d可见散在的梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落；传代细胞在12 h内完全贴壁，经过一两天潜伏期后增殖迅速，培养六七天可达90%融合，细胞排列有一定的方向性，呈漩涡状、辐射状排列，细胞为长梭形，相互之间界限不清。②两种方法得到的羊水间充质干细胞染色体核型为正常二倍体核型；生长曲线均呈S形，但两步法在第(6.1±0.5)天就达到高峰，显著快于一步法第(7.2±0.6)天(P=0.035)。流式细胞仪检测结果显示两步法羊水P3细胞S期细胞占(14±2.3)%，显著多于一步法(9.0±1.4)% (P =0.031)。两种方法获得的羊水间充质干细胞低密度种植7 d后，均可形成散在的细胞集落，但两步法集落形成率为(15.0±2.3)%，显著多于一步法(10.0±1.8)%(P =0.021)。③流式细胞仪检测结果显示，羊水间充质干细胞表达CD44、CD29、CD105，而CD34、CD45、HLA-DR阴性；免疫荧光检测表明羊水中含有Oct-4阳性细胞，但两步法羊水间充质干细胞中Oct-4阳性细胞比例为(1.2±0.3)%，显著高于一步法(0.9±0.2)%(P =0.041)；RT-PCR分析表明两种方法获得的羊水间充质干细胞均表达Oct-4。 结论：人羊水中也存在间充质干细胞，两步培养法是一种高效、简便实用而且不干扰常规产前诊断程序的方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌HCN2及HCN4基因的表达**☆

背景：研究表明在多种心脏疾病后的心室肌中HCN2和HCN4表达异常,且与室性心律失常密切相关。骨髓间充质干细胞移植可修复受损心肌,但对梗死后心室离子通道重构的影响仍不清楚。 目的：检测大鼠骨髓间充质干细胞移植入梗死心肌后左心室HCN2和HCN4的表达变化。 方法：取3周龄SD大鼠5只,Percoll法分离培养骨髓间充质干细胞。成年健康雄性SD大鼠30只,随机分为4组：DMEM组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎,正常对照组不进行任何干预。造模后4周,DMEM组在梗死边缘区和中心区分5点注入DMEM培养液,细胞移植组同法注入第3代骨髓间充质干细胞悬液200 μL,细胞数5×106个。采用RT-PCR及Western-blot法检测左心室HCN2,HCN4在mRNA及蛋白水平的表达。 结果与结论：正常心肌区：各组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达基本相似(P > 0.05)。梗死边缘区：DMEM组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显多于正常对照组、假手术组(P < 0.05);细胞移植组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显少于DMEM组(P < 0.05)。梗死中心区：DMEM组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显少于正常对照组、假手术组(P < 0.05);细胞移植组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达与DMEM组基本相似(P > 0.05)。提示急性心肌梗死后梗死边缘区HCN2,HCN4基因在mRNA和蛋白水平的表达升高,骨髓间充质干细胞移植可能通过下调梗死边缘区HCN2,HCN4的表达来降低心律失常。     

成体干细胞在非恶性疾病中的注册临床研究

背景：随着成体干细胞研究的深入,其在非恶性疾病中的临床适应证逐年增加;但是研究者对干细胞在非恶性疾病中临床适应证的选择上目前仍然处于探索阶段。目的：提供成体干细胞在非恶性疾病中的临床研究的方向及适应证的选择方面的参考信息。方法：2010-03-03通过互联网在美国NIH (the National Institute of Health)临床试验登记注册网站(http://www. clinicaltrials.gov),选择合适的检索式,检索成体干细胞为干预措施的在非恶性肿瘤疾病受试者中的临床研究项目。不限语言种类、研究所在地和研究人种。结果与结论：在初次检索时得到的1 540个研究项目中,排除1 206个恶性肿瘤相关研究项目和13个其他不符合检索目的的研究,共321个研究项目进入分析。其中约1/3(101)的研究与心、脑血管疾病相关,主要是缺血性心脑血管疾病。另外1/3(85)的研究项目与自身免疫性疾病或器官移植后的移植物抗宿主病(GVHD)相关。其余的1/3临床试验的适应证是下肢缺血性疾病(9%,31/321)、遗传性疾病(9%,31/321)和其他疾病(22%,73/321)。在其他疾病适应证分类中,主要病种是肝硬化/肝衰竭、骨关节融合术中用及Ⅰ,Ⅱ型糖尿病等。目前,成体干细胞在非恶性肿瘤疾病中的临床研究适应证集中在心脑血管疾病和外周血管疾病。此外,基于干细胞促进组织修复/再生的理论基础,目前的一部分研究着眼于肝硬化、骨关节融合术中应用等等;间充质干细胞的免疫调节机制在免疫性疾病中的应用仍然是注册临床研究中的一个重要研究方向。     

干细胞相关因子在大肠癌组织及SW620细胞株的表达

背景：肿瘤细胞有多种干细胞标记的表达,深入研究其表达规律有助于揭示肿瘤发病机制、完善肿瘤干细胞理论。 目的：检测大肠癌实体组织中干细胞相关分子标记CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1与癌旁组织的表达差异,以及CD133免疫磁珠分选阳性与阴性SW620细胞中上述基因的表达差异。 方法：选临床病理诊断清楚的29例大肠癌组织标本提取RNA,RT-PCR检测CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1在大肠癌组织与癌旁对照组织中的表达。CD133免疫磁珠分选SW620,提取CD133细胞与CD133阴性细胞RNA,RT-PCR检测分选后上述基因的表达差异。 结果与结论：29例标本均诊断为低、中分化腺癌或黏液腺癌,干细胞相关分子标记癌组织与癌旁组织表达灰度相对值癌组织表达均高于癌旁组织(P < 0.05)。RT-PCR检测分选后CD133+细胞CD133,CD166,Oct4,Sox2,C-myc,Klf4,Bmi-1表达,结果均高于CD133-细胞。提示,CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1相关干细胞标记可作为大肠癌肿瘤干细胞标记并有望用于诊断检测。     

微小RNA在乳腺癌干细胞中的表达

摘要：微小RNA作为生物体正常生长发育的调控分子，不仅在多种恶性肿瘤中表达异常，而且在维持胚胎干细胞以及成体干细胞自我更新及多向分化潜能中起重要作用。因此，筛选乳腺癌干细胞相关微小RNA表达谱，探讨微小RNA参与肿瘤干细胞形成的分子机制，具有重要的理论意义。文章综合分析相关文献，对乳腺癌干细胞和微小RNA方面的研究情况予以综述分析和展望。乳腺癌干细胞具有自身特征性微小RNA，随着微小RNA在乳腺癌干细胞研究的不断进展，对乳腺癌干细胞的生物学特征会不断得以揭示，为进一步从干细胞层面研究乳腺癌发病机制及靶向治疗打下基础。     

HAUSP与NANOG在胶质瘤中的表达及意义

目的 探讨HAUSP、NANOG在胶质瘤细胞中的定位及在人脑胶质瘤组织中的表达,了解二者在胶质瘤进展中的作用. 方法 取安徽医科大学附属省立医院神经外科自2010年1月至2010年11月间手术切除的胶质瘤标本72例,其中WHOⅡ级19例、WHOⅢ级25例、WHOⅣ级28例,采用免疫组织化学染色检测HAUSP、NANOG蛋白在胶质瘤中的表达;常规培养U87胶质瘤细胞株,双重免疫荧光细胞化学染色检测U87细胞HAUSP/NANOG的亚细胞定位.结果 不同级别胶质瘤中HAUSP蛋白阳性细胞率比较差异有统计学意义(F=15.926,P=0.000),且胶质瘤的病理级别越高,HAUSP蛋白阳性细胞率越高,差异有统计学意义(P＜0.05);胶质瘤的病理级别和HAUSP蛋白表达水平呈正相关关系(r=0.726,P=0.000);不同级别胶质瘤中NANOG蛋白阳性细胞率比较差异有统计学意义(F=14.768,P=-0.000),且胶质瘤的病理级别越高,NANOG蛋白阳性细胞率越高,差异有统计学意义(P＜0.05);胶质瘤的病理级别和NANOG蛋白表达水平呈正相关关系(r=0.685,P=0.000);胶质瘤细胞U87中,两者均有表达,且两者共定位于细胞核. 结论 HAUSP与NANOG两者在胶质瘤发病中起重要作用,且与肿瘤恶性度相关;NANOG作为维持胶质瘤细胞未分化或低分化状态的标记物,HAUSP的去泛素化作用可能对于NANOG维持胶质瘤细胞的未分化状态有重要作用.     

Bcl-2在人脑胶质瘤干细胞样细胞中的表达及病理相关性

目的 检测B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2)基因在胶质瘤干细胞样细胞(GSLCs)中的表达水平,并分析Bcl-2与来源胶质瘤恶性程度的相关性.方法 从8例临床标本中培养出GSLCs并鉴定后,检测Bcl-2在GSLCs以及相应原代胶质瘤细胞中的mRNA和蛋白水平并比较分析;此外对GSLCs中Bcl-2水平及来源胶质瘤恶性程度之间的关系进行分析.结果 从8例胶质瘤标本中培养出GSLCs并通过鉴定.实时逆转录酶-聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测显示Bcl-2在GSLCs中的mRNA和蛋白水平均显著高于对应的原代胶质瘤细胞,配对t检验结果分别为P＜0.001和P＜0.005,有统计学意义.此外,Bcl-2的在Ⅳ级脑胶质瘤来源的GSCLs中的表达水平明显高于Ⅲ级脑胶质瘤来源的GSCLs.结论 首次检测并发现GSCLs中Bcl-2的表达水平高于相应的原代胶质瘤细胞,此结果与胶质瘤干细胞(GSCs)特点相符,这可能是GSCs产生治疗耐受性并逃避凋亡的原因之一.以Bcl-2为靶点的抗肿瘤治疗须能诱导GSCs凋亡,才有望治愈胶质瘤.     

肿瘤干细胞的调控机制及其临床意义

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的少部分具有干细胞性质的细胞群，其自我更新和分化受到严格的调控。肿瘤干细胞是肿瘤形成、复发与转移的根源。目前，对于肿瘤干细胞的调控机制存在着若干理论，包括异常信号传导通路、非整倍核型发生、原癌基因激活与抑癌基因失活和端粒酶耗损理论等。通过研究肿瘤干细胞的各种调控机制，寻找和鉴定特异性的肿瘤干细胞表面分子标志物，寻找肿瘤干细胞与肿瘤发生密切相关的基因，确定出针对肿瘤干细胞进行治疗的靶位并选择性地杀伤肿瘤干细胞，从而为临床可能根治肿瘤和防止肿瘤复发与转移提供新的思路。     

Oct-3/4 repression accelerates differentiation of neural progenitor cells in vitro and in vivo

Oct-3/4 (Oct-3/Oct-4/POU5F1) is a critical regulator of embryonic stem (ES) cell differentiation, though its role in tissue stem cells that persist in differentiated tissues has not been shown. Here, we show that Oct-3/4 is expressed in neurospheres (NS) composed of neural stem cells and neural progenitor cells and that up- or down-regulation of Oct-3/4 by using adenovirus vectors influences cell fate. Oct-3/4 down-regulation accelerates neuronal differentiation of progenitor cells while its sustained expression prevents neuronal differentiation. Transplantation of neurospheres into the adult rat brain shows that down-regulation of Oct-3/4 promotes differentiation of NS cells in vivo. Our findings indicate that Oct-3/4 is an essential regulator of NS cell differentiation and suggest that the modulation of Oct-3/4 could be a useful tool in clinical application of NS cells.     

造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因的表达*

背景：HOXB4基因不仅能促进造血干细胞的扩增及其功能的活化与表达,而且体内试验表明它不会诱发白血病。因此更好地研究HOXB4在造血细胞增殖分化中的变化及作用对进一步研究造血干细胞的扩增可以提供更多的理论基础。 目的：观察人类脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因表达的情况及全反式维甲酸对HOXB4基因表达的影响。 方法：将培养的淋巴系造血祖细胞按干预方式不同分为2组,全反式维甲酸组：在培养体系中加入全反式维甲酸,终浓度6×10-8 mol/L。正常组：不加全反式维甲酸,代之以等量的1640培养液。观察人类脐血造血干细胞经植物血凝素诱导后,在培养第3,7,12天的淋巴细胞集落形成单位生成情况。采用实时荧光定量PCR技术检测脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因的表达水平。 结果与结论：人脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中,HOXB4基因呈规律的表达。随培养时间推移,正常组和全反式维甲酸组HOXB4基因的表达均逐渐降低。与正常组比较,全反式维甲酸可上调HOXB4基因的表达。     

肝癌干细胞的研究热点及其临床意义

背景：肝癌是否存在肿瘤干细胞目前还没有明确答案。已发现一些具有特异性的细胞标志物,但需进一步验证筛选。信号传导调控在肝癌的发生发展和转移复发过程中究竟起到何种作用,是目前研究的重要课题。而针对肝癌对放化疗抵抗特性,也有许多研究分析值得关注。 目的：复习相关文献,就肝癌干细胞起源、干细胞标志物、信号传导调控、对治疗抵抗原理及相应治疗策略等方面进行综述。 方法：以“cancer stem cells, hepatocellular carcinoma, markers, therapy”为检索词,应用计算机检索Pubmed数据库1996-01/2010-01关于肝癌干细胞标识、分子调控及治疗的文献;以“肿瘤干细胞,肝细胞癌,标志物,治疗”为检索词,机检索重庆维普数据库、清华同方数据库1996-01/2010-01相关文献。纳入30篇符合标准的文献进行分析讨论。 结果与结论：研究表明肝癌组织中存在肿瘤干细胞特性的细胞亚群,其来源可能是多源的,并与肿瘤转移特性密切相关。目前已发现的肝癌干细胞标志物如OV6、AFP、c-kit、EpCAM和CD90等,对干细胞识别筛选起到重要作用。研究表明Wnt,Shh,Notch和PI3K/AKT/mTOR等信号传导途径对肝癌干细胞发挥重要的调控作用。针对干细胞抗药特性,采取分子靶向治疗、分化治疗和抗体治疗,对肝癌治疗取得了初步疗效,需要进一步深入研究。     

胶质瘤干细胞中Nanog基因启动子区甲基化检测及意义

目的检测胶质瘤干细胞中Nanog基因启动子区甲基化表达,并探讨其Nanog基因表达的关系。方法使用无血清悬浮培养法获得胶质瘤干细胞并鉴定;采用甲基化特异性多聚酶链反应(MSP)分别检测胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系U87中Nanog基因启动子区甲基化状态,实时定量多酶链反应(RT-PCR)检测相应细胞中Nanog表达情况。结果由U87胶质瘤细胞系成功获得胶质瘤干细胞(GSCs);MSP检测胶质瘤干细胞和U87细胞系Nanog启动子区皆呈非甲基化状态,且胶质瘤干细胞中Nanog非甲基化程度高于U87细胞系(t=6.988,P=0.000)。实时定量PCR结果显示胶质瘤干细胞中Nanog mRNA相对表达量高于U87细胞系。结论胶质瘤干细胞中Nanog基因启动子区呈非甲基化状态,可能与Nanog基因表达有关,且可能促进Nanog的转录并维持着胶质瘤干细胞的恶性生物学活性。     

结直肠癌干细胞的研究与进展

学术背景：结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤,肿瘤干细胞理论为了解结直肠癌的发生发展机制提供了新思路。 目的：综述结直肠癌干细胞的存在依据,来源及分离鉴定等研究进展。 检索策略：应用计算机检索Pubmed1990-01/2007-07期间相关文章,检索词为"colorectal cancer,stem cell,tumor stem cells"。同时检索维普数据库1990-01/2007-07期间相关文章,检索词为"结直肠癌,干细胞,肿瘤干细胞"。对资料进行初审,并查看每篇文献及其引文。纳入标准：文章所述内容应与结直肠癌干细胞存在依据,来源及分离鉴定等研究进展相关。排除标准：重复性研究。共收集到63篇相关文献,33篇文献符合纳入标准,排除的30篇为内容陈旧或重复文献。 文献评价：符合纳入标准的33篇文献中,28篇涉及结直肠癌干细胞的存在依据及来源,4篇涉及结直肠癌干细胞的分离鉴定,1篇涉及存在的问题与展望。 资料综合：肿瘤干细胞是肿瘤组织中数量极少的、具有无限增殖和自我更新能力、导致肿瘤发生的细胞,它是肿瘤转移、复发及耐药的根源,也有望成为根治恶性肿瘤的新靶点。目前已在白血病和多种实体瘤中发现具有特殊表面标记的肿瘤干细胞,肠道干细胞本身为分化未成熟的细胞,因此,其细胞表型难以确定而不易鉴别,目前对其数量、定位、组织起源、功能以及和肠道疾病关系研究的相对较多。在结直肠癌中已经分离出以EpCAMhigh/CD44+为表型特征的肿瘤干细胞,进一步加速了人们对结直肠癌发生发展机制的认识。 结论：结直肠癌干细胞的发现是人类认识恶性肿瘤发生发展机制的又一进步,肿瘤干细胞可能成为根治恶性肿瘤的最为重要的新靶点,为人类战胜肿瘤带来了希望。