一起诺如病毒GⅡ.17型引起的急性胃肠炎病原学诊断及基因特征分析

目的对长沙市2014年12月某厂区暴发的一起急性胃肠炎疫情进行病原学诊断及对其致病原进一步的基因分型研究。方法共采集6例病人肛拭子标本和可疑水源标本4份,提取核酸后,诺如病毒GI/GII型real-time RT-PCR试剂盒检测;阳性标本普通RT-PCR扩增VP1基因片段,产物测序后BLAST比对确定其型别,并构建进化树分析其进化关系。结果 10份标本real-time RT-PCR扩增结果显示为诺如病毒GII型,VP1区片段RT-PCR扩增后产物测序,BLAST比对发现与2014年香港诺如病毒株GII/Hu/HKG/2014/GII.17/CUHK-NS-463同源性最高,达99%,证实为诺如病毒GII.17型;构建系统进化树分析显示本次疫情分离的毒株与日本、香港、台湾等亚洲地区的毒株亲缘关系更为接近,而与美国、法国等地区的毒株亲缘关系则较远。结论诺如病毒是引起此次急性胃肠炎疫情的病原体,且引起暴发的病毒株属于GII.17型。     

一起由诺如病毒和肠道腺病毒混合感染引起的急性胃肠炎聚集性疫情的病原鉴定及进化分析

目的?对一起儿童急性胃肠炎聚集性疫情的病原进行鉴定、分型及进化分析。 方法?收集本次疫情患儿粪便标本，提取核酸，采用实时荧光PCR初步进行病原鉴定。通过反转录-聚合酶链反应对诺如病毒阳性标本的聚合酶区和衣壳VP1区部分基因序列进行扩增；通过PCR对腺病毒阳性标本的六邻体区部分基因序列进行扩增。对扩增产物进行测序，利用生物信息学软件及网站对病毒进行型别鉴定及进化分析。结果?共收集到3例患儿粪便标本，诺如病毒和腺病毒均为阳性。3株诺如病毒毒株均为诺如病毒GII.P12-GII.3型，其聚合酶区部分基因序列（206 bp）与2015─2018年我国GII.P12-GII.3型诺如病毒参考序列的同源性为98%，且位于同一进化树分支上；3株腺病毒毒株均为腺病毒F亚属41型（F41型），其六邻体区部分基因序列（420 bp）与2015─2019年我国F41型腺病毒参考序列的同源性为100%，且位于同一进化树分支上。 结论?本次儿童急性胃肠炎聚集性疫情是由GII.P12-GII.3型诺如病毒和F41型腺病毒混合感染引起，毒株序列分别与近年来我国流行的GII.P12-GII.3型诺如病毒及F41型腺病毒序列高度同源。本研究为混合感染急性胃肠炎疫情病原的快速鉴定及溯源分析提供了参考。     

诺如病毒新重组株GⅡ.P16/GⅡ.2引起福建省2016年冬季病毒性胃肠炎暴发

目的 本文旨在鉴定福建省2016年冬季导致病毒性胃肠炎暴发的病原体,并对病原体进行分子特征研究.方法 对疫情暴发地上送的福建省2016年胃肠炎暴发急性病例标本,采用荧光PCR初步判定病原体,常规RT-PCR检测诺如病毒RNA聚合酶和衣壳蛋白基因片段,并进行序列测定和分子特征分析.结果 在3起暴发疫情中18份标本经荧光PCR检测均为诺如病毒核酸阳性,其中15份标本RT-PCR检测判为GⅡ型诺如病毒,9份标本成功测序.分析测序结果,证实引起本轮疫情为诺如病毒新重组株,该重组株有别于本地散发流行及全球暴发流行的优势基因型GⅡ.4.毒株RNA聚合酶核苷酸序列与2016年日本的GⅡ.4悉尼变异株Kawasaki194毒株的同源性最高,达98％,为GⅡ.P16亚型;衣壳蛋白核苷酸序列与2008年比利时的IPH2161-08VG06毒株同源性最高(97.7％～98.8％),为GⅡ.2亚型.结论 这是福建省首次报道诺如病毒重组株GⅡ.P16/ GⅡ.2的检出,并引起病毒性胃肠炎暴发.     

一起由星状病毒1型引起的新生儿腹泻暴发的病原确证

目的 对一起新生儿急性胃肠炎暴发事件进行病原确证.方法 2008年12月至2009年2月,内蒙古自治区某妇幼医院新生儿室发生腹泻流行,高峰期采集38例患儿的45份粪标本,ELISA法检测轮状病毒、腺病毒和星状病毒病原,RT-PCR法检测星状病毒核酸,其中13份星状病毒核酸阳性标本进行测序分析和进化树分析,4份星状病毒及病毒核酸均阳性的标本进行免疫电子显微镜观察.结果 45份粪标本中,轮状病毒、腺病毒病原检测均阴性.30份标本ELISA检测星状病毒病原阳性,阳性率为66.7%;31份标本星状病毒核酸阳性,阳性率为68.9%.采用星状病毒分型引物进行分型,均为星状病毒1型.选择13株与GenBank中星状病毒1型参考株进行比较,其核苷酸序列同源性为90.9%～96.3%.13株星状病毒1型株彼此间核苷酸序列同源性为94.7%～100.0%.随机选择的4份阳性标本,免疫电子显微镜下2份有大量星状病毒颗粒.结论 此起新生儿腹泻暴发由星状病毒1型引起.     

南京地区人感染杯状病毒的病原学检测

目的了解南京地区病毒性腹泻患者中杯状病毒的感染情况,明确该地区杯状病毒的主要基因型和分子进化特点。方法收集南京市儿童医院疑似病毒性腹泻粪便标本155例,南京市某三甲医院成人腹泻标本8例,采用RT-PCR方法检测粪便中诺如病毒和札如病毒的多聚酶区核酸片段,并测序以明确基因型,对核苷酸序列使用CLUSTALW和phylip软件分析病毒的分子进化和亲缘关系。结果婴幼儿的155例标本共检出15例杯状病毒阳性,检出率达到9.7%,成人检出5份阳性,与婴幼儿感染的诺如病毒核酸在多聚酶区未发现显著差异,均为GⅡ4型,与GENBANK上序列号为EU074213(苏州)、EU096514、EF200699的毒株有较高的同源性;婴儿腹泻中有一例经核酸序列比对确认为札如病毒感染,为SGⅡ型,与GENBANK上序列号为AF439862的有94%的同源性。结论杯状病毒是本地区病毒性腹泻的重要病原体,感染的该病毒以诺如病毒GⅡ4型为主,与近年多个地区发现的该病毒有较近的亲缘关系。南京地区存在札如病毒感染。     

贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法的建立

目的建立贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法。方法对比分析6株主要流行的GⅠ、GⅡ诺如病毒及参考诺如病毒的基因序列,筛选保守区域引物,优化建立SYBR Green Ⅰ荧光定量检测与熔解曲线快速分群方法,并对实际样品检测验证。结果引物P289/290可同时检测GⅠ、GⅡ诺如病毒,SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法在病毒浓度10~3～10~9 copies之间呈现良好的线性关系(R~2=0.993,P0.01),熔解曲线Tm值可区分GⅠ和GⅡ不同基因群的诺如病毒(F=7 507.60,P0.05)。120份贝类样品阳性检出率5.83%,其中阳性结果测序鉴定与快速分群方法结论一致。结论该方法成本低、检测快速、分群准确,具有良好重复性,适用于贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒的快速检测与分群。     

90例病毒性胃肠炎患者粪便中诺如病毒检出情况分析

目的 了解病毒性胃肠炎患者中诺如病毒感染情况. 方法 收集北京市2007年2月5~17日共计90例病毒性胃肠炎患者的粪便标本,应用逆转录聚合酶链反应法 (RT-PCR) 和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测粪便中诺如病毒核酸或抗原,并对RT-PCR阳性标本的PCR产物进行克隆测序. 结果 90例病毒性胃肠炎患者的粪便标本中,35例 (38.89%) RT-PCR为诺如病毒核酸阳性,序列分析结果显示,诺如病毒GⅡ型34例 (97.14%),GⅠ型1例 (2.86%);90例中,39例 (43.33%) 为ELISA检测诺如病毒抗原阳性.以RT-PCR检测结果作为金标准进行比较,ELISA的灵敏度和特异度分别为97.14% (34/35) 和90.91% (50/55) . 结论 诺如病毒是病毒性胃肠炎的主要病原,以GⅡ型流行为主.ELISA快速、简便,其灵敏度和特异度较高,可作为诺如病毒感染的初筛试验.     

诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备诺如病毒衣壳蛋白特异性单克隆抗体,为诺如病毒的快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法用分别表达GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型诺如病毒衣壳蛋白的重组腺病毒联合免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得分泌高滴度针对衣壳蛋白的杂交瘤细胞株,测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价,用间接ELISA、间接免疫荧光和Western-blot检测单克隆细胞株的特异性。结果通过细胞融合和克隆化,筛选出4株分泌抗衣壳蛋白的杂交瘤细胞株V1E、V1E9、V1D6和V6D6。间接ELISA、免疫荧光和Western-blot检测结果表明,V1E和V1E9可以与GGII4型诺如病毒衣壳蛋白发生特异性反应,V1D6和V6D6可以同时与GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型诺如病毒衣壳蛋白发生特异性反应。结论获得了诺如病毒特异性单克隆抗体,为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础。     

贝类中GI、GII诺如病毒快速检测与分群方法的建立

目的 建立贝类中GI、GII诺如病毒快速检测与分群方法。 方法 对比分析6株主要流行的GI、GII诺如病毒及参考诺如病毒的基因序列,筛选保守区域引物,优化建立SYBR Green I荧光定量检测与熔解曲线快速分群方法,并对实际样品检测验证。结果 引物P289/290可同时检测GI、GII诺如病毒,SYBR Green I荧光定量检测方法在病毒浓度10³~10⁹ copies 之间呈现良好的线性关系(R²=0.993,P＜0.01),熔解曲线Tm值可区分GI和GII不同基因群的诺如病毒(F=7 507.60,P＜0.05 )。120份贝类样品阳性检出率5.83%,其中阳性结果测序鉴定与快速分群方法结论一致。 结论 该方法成本低、检测快速、分群准确,具有良好重复性,适用于贝类中GI、GII诺如病毒的快速检测与分群。     

常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用

目的建立GI、GII型诺如病毒的常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法,并对两种方法进行应用。方法优化筛选出最佳PCR反应体系与反应条件,并从灵敏性、特异性、临床样品检测等方面对建立的方法进行比较与评价。结果该两种方法特异性强,与札幌病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应,同一体系内GI、GII型诺如病毒相互之间没有干扰;常规RT-PCR最低检测限为103copies/μL,荧光定量RT-PCR最低检测限为102copies/μL;对180份临床粪便样品进行检测,常规RT-PCR则检测率为5.56%(10/180),符合率达97.22%,荧光定量RT-PCR检测率为8.33%(15/180),符合率达100%;对15份阳性样品测序分析,证实均为诺如病毒。结论建立的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR均可用于诺如病毒的快速检测,荧光定量RT-PCR更为灵敏。     

丽水市贝类产品中副溶血性弧菌的血清分型及耐药性研究

目的了解丽水市贝类产品中副溶血性弧菌的血清型分布及耐药性,为防治副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供依据。方法从丽水市区农贸市场等采集贝壳类水产品,常规方法分离副溶血性弧菌,参照GB/T 4789.7—2003方法,用标准血清进行分型,用纸片扩散法进行药敏试验。结果检出阳性标本28份,检出率为26.67%(28/105)。分离得到的28株副溶血性弧菌分属于7个血清群,分别为O:4群占39.29%(11/28)、O:3群占14.29%(4/28)、O:2群占14.29%(4/28)、O:11群占14.29%(4/28)、O:1群占7.14%(2/28)、O:7群占7.14%(2/28)、O:10群占3.57%(1/28)。28株副溶血性弧菌中有25株对氨苄西林耐药,1株对四环素耐药。结论从丽水市贝类产品分离的副溶血性弧菌具有血清分群多样化和耐药性简单的特点。     

浙江省猪血清中乙脑病毒的分离鉴定及抗体的测定

目的对浙江嘉兴地区采集的猪血清进行乙型脑炎病毒分离鉴定以及了解该地区猪感染乙型脑炎病毒的状况。方法在浙江省嘉兴地区采集猪血清标本,利用病毒分离方法检测猪血清是否携带乙脑病毒,利用间接免疫荧光法对猪血清进行抗体检测。应用荧光定量RT PCR方法对新分离病毒进行鉴定;设计特异性引物,利用RT PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM-E基因,并对新分离病毒进行基因分型和E基因的分析。结果共采集240份猪血清标本,抗体检测阳性率为61.6%。其中6月中旬50%以上的猪乙脑病毒抗体呈阳性。分离出3株病毒。经荧光定量RT PCR鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因I型乙脑病毒。对这2株乙脑病毒的E基因区段进行分析,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性均为100%。与疫苗株SA14 14 2相比,核苷酸同源性在87.7%,氨基酸同源在97.0%以上。结论浙江省嘉兴地区猪群中存着乙脑病毒的隐性感染或曾经感染过,提示在该地区自然界中存在着乙脑病毒。     

海产品中沙门氏菌的分离及其ERIC-PCR指纹分析

目的了解常见市售鲜活海产品沙门氏菌污染情况及不同菌株间遗传相似性,为沙门氏菌的流行病学研究提供有价值的信息。方法采集市售常见海鱼、贝类和蟹等海产品,按照常规方法分离沙门氏菌,分析分离菌的ERIC-PCR DNA指纹图谱。结果共检查191份样品,从42份中分离到沙门氏菌45株。ERIC-PCR DNA指纹图谱分析,45株分离菌被分为两个大的分支,遗传相似性在50%~100%之间。结论市售海产品有沙门菌污染,同一种海产品污染菌的基因型可有不同,不同海产品之间也存在相同基因型沙门氏菌株污染。     

用RT-PCR和ELISA对暴发性急性胃肠炎事件中诺沃克样病毒检测的比较

目的　诺沃克样病毒是世界范围内急性非细菌性流行性胃肠炎的重要病原。采用RT-PCR和ELISA两种方法对广州市多起暴发性急性胃肠炎事件中病人标本进行诺沃克样病毒检测 ,了解广州市诺沃克样病毒流行情况 ,并对RT-PCR和ELISA两种检测方法进行比较。方法　用RT-PCR和ELISA对 76份腹泻病人粪便 ,2 3份肛拭子 ,12份食物进行诺沃克样病毒检测。结果　粪便通过RT-PCR检出阳性 37份 ,ELISA检出阳性 17份 ,肛拭子仅通过RT-PCR检出 1份阳性 ,食物无阳性检出。结论　这是首次我国实验室证实的由诺沃克样病毒引起的急性胃肠炎暴发。RT-PCR的阳性率大于ELISA ,且检品以粪便为好。并且我们的分离株与诺沃克原型株相应序列比较的同源性大于 90 %     

贝类多糖对HepG2.2.15细胞JAK-STAT信号转导途径分子表达的影响

【摘要】 目的  了解贝类多糖对HepG2.2.15细胞JAK-STAT信号转导途径分子表达的影响。 方法  用RT-PCR的方法检测经贝类多糖处理的HepG2.2.15细胞在不同时间段的STAT1和STAT2 mRNA表达的水平。 结果  RT-PCR结果显示经贝类多糖处理后HepG2.2.15细胞STAT1和STAT2 mRNA表达水平明显升高,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,表明HepG2.2.15细胞对贝类多糖有应答。 结论  贝类多糖对HBV有一定的抑制作用,其作用机制可能与INF-α类似。     

湖北地区季节性H1N1流感病毒HA基因特性分析

目的调查分析湖北地区季节性H1N1流感病毒血凝素(HA)的基因特性。方法收集2000年以来临床样品中分离鉴定的H1N1流感病毒毒株,运用RT-PCR扩增病毒HA基因,对扩增片段进行序列测定和分析。结果 H1N1流感病毒HA基因与同期世界卫生组织推荐的疫苗株相应基因的同源性为95.8%～99.6%,分离株HA基因中潜在的抗原性位点和糖基化位点与2000～2008年的疫苗株基本相同,但与2009年疫苗株有一定差异。HA基因进化分析表明在不同年份分离出的流感毒株呈现出不同的亲缘关系。结论湖北地区2000～2008年分离的季节性H1N1流感毒株与世界卫生组织同期推荐的疫苗毒株的HA核苷酸序列有高度同源性,HA基因重要抗原位点的氨基酸没有改变,但与2009年疫苗株有所不同,序列同源性和进化关系表明历年疫苗株可以给人群提供一定程度的保护。     

宁波地区人轮状病毒NSP4基因特征分析

目的研究宁波地区2005-2006年新生儿感染的A组轮状病毒NSP4基因特征及变异情况。方法利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测新生儿病毒性腹泻便样中的轮状病毒核酸,选择部分阳性样品通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增NSP4全基因并测序,测序结果利用DNAstar和Blast软件进行比较分析。结果在20份新生儿病毒性腹泻便样中共检测到RV阳性样品10份;选择4份阳性样品进行NSP4基因扩增并测序,均能扩增出750bp片段;4个宁波株与标准株Wa、KUN和AU-1的核苷酸同源性分别为93.7%～94.4%、80.5%～81.2%和80.0%～80.8%,与1994-1998年中国其他地区流行株核苷酸和氨基酸的同源性为92.8%～98.9%和93.7%～99.4%。结论在宁波新生儿中有A组轮状病毒的流行,4个宁波株的NSP4基因均为Wa型,RVNSP4蛋白的3个功能区在中国大陆十几年的进化中是高度保守的,宁波株出现了一些特征性的氨基酸变异位点。     

上海地区2009年上半年手足口病患儿肠道病毒71病毒壳体蛋白VP1基因的检测与亚型分析

目的 了解2009年4月至5月肠道病毒(EV)71在上海地区儿童手足口病(HFMD)中的分子流行病学特点.方法 收集2009年4月至5月在复旦大学附属儿科医院临床诊断为HFMD的95例住院患儿咽拭子标本73份与粪便标本38份,采用TaqMan实时RT-PCR及套式RT-PCR进行EV71病毒壳体蛋白VP1基因检测,并进行基因测序分析.结果 73份咽拭子标本中,EV71阳性6份,检出率为8.2%;38份粪便标本中,EV71阳性24份,检出率为63.2%.28份套式RT-PCR阳性标本基因测序分析结果显示,27株为C4亚型,为绝对优势流行株,另有一株为C2亚型株;1例死亡患儿分离株为C4亚型,其VP1基因序列未见明显变异.结论 EV71是上海地区2009年4月至5月儿童HFMD的重要病原体,C4亚型株占绝对优势地位,同时伴有C2亚型株的流行.     

2019-2020年湖北部分地区G9P[8]型人轮状病毒基因特征北大核心CSCD

目的对人A组轮状病毒进行检测及分离鉴定,并研究其各基因片段的遗传进化关系。方法2019-2020年对湖北武汉市和襄阳市临床腹泻病人的粪便样品进行采集,共319份。设计特异性轮状病毒VP6基因引物,RT-PCR检测轮状病毒的感染情况。将阳性样品接种于MA104细胞进行轮状病毒的分离。RT-PCR特异性扩增VP6基因和特异性间接免疫荧光对其进行病毒鉴定及病毒增殖检测;并进一步通过RT-PCR扩增轮状病毒的11个基因片段,在线工具Rota C V2.0对测序结果进行分型分析。Mega软件对其全基因组序列进行遗传进化分析。结果轮状病毒感染阳性标本共69份,阳性率为21.63%。成功分离获得11株人轮状病毒,主要衣壳蛋白VP7和VP4基因型均为G9P[8]型。其中3株轮状病毒归属于类Wa株毒株,基因型图谱为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1。8株毒株在Wa-like的基因型中具有DS-1-like的NSP4为E2基因型特征。基因型图谱为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E2-H1。结论G9P[8]型人轮状病毒毒株在2019-2020年湖北部分地区占主导趋势,且其NSP4基因以E2基因型为主要流行形式。     

成人手足口病四例患者肠道病毒71型的检测及核苷酸序列分析

目的 了解成人手足口病的病原体,并分析肠道病毒71型(EV71)核苷酸序列特征.方法 RT-PCR技术对4例成人手足口病患者标本进行肠道病毒基因检测,并测定EV71核苷酸序列,所得序列通过BLAST程序作EV71序列的进一步确认,与基因库中不同基因型EV71核苷酸序列进行比对分析、同源性分析,并构建种系进化树.结果 4例患者肠道病毒通用引物和EV71特异性引物RT-PCR检测均阳性.经BLAST分析,测序所得4条核苷酸序列(分别命名为GZl9610、GZ99310、GZ99355和GZ46477)与EV71毒株序列同源.序列分析表明,4条核苷酸序列之间的同源性为96.O%～99.1%,与2008年初我国安徽省阜阳市暴发的手足口病疫情所分离的EV71毒株同源性最高.EV71序列遗传进化分析确定其均为EV71基因亚型C4,与阜阳、深圳、重庆、上海地区及2004年我国台湾地区流行毒株基因型一致,且距离最近.结论 成人也可感染EV71引起手足口病,与我国现在及既往流行病毒株相比,此次4例成人手足几病患者感染的EV71未发生大的变异;应加强对成人手足口病患者的隔离治疗,以免其传播病毒引起疾病更大的流行.