结核分枝杆菌Rv3873抗原表位预测及其蛋白片段抗原性研究

目的对结核分枝杆菌Rv3873进行生物信息学分析及抗原表位预测,原核表达Rv3873基因21～235位氨基酸蛋白片段,命名为Rv387321～235重组蛋白,初步分析其抗原性。方法 PCR扩增结核分枝杆菌Rv3873 21～235位氨基酸的基因片段,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,获得重组蛋白并纯化;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对Rv387321～235重组蛋白进行抗原性检测。结果具有优势抗原表位的Rv3873蛋白片段在大肠杆菌中高效表达;ELISA结果显示,Rv387321～235重组蛋白在结核病检测中的敏感性为28%,特异性94.6%。结论生物信息学预测Rv3873基因抗原表位,为寻找有价值的抗原靶点提供了参考;具有优势抗原表位的重组蛋白片段在结核病诊断中具有潜在应用价值,可作为联合诊断的备选抗原之一。     

结核分枝杆菌Rv2389c基因的克隆和原核表达

目的:克隆并原核表达结核分枝杆菌Rv2389c基因。方法:培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出485bp的Rv2389c基因,克隆入pSP73载体,测序分析。将该目的基因亚克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),待大肠杆菌增菌至A600nm值为0.6时,用0.3 mmol/L IPTG在30℃诱导表达重组蛋白。结果:测序结果证实获得了Rv2389c基因,其序列与GenBank中报道完全一致。构建了重组表达质粒,表达的蛋白以12%SDS-PAGE分析,在Mr约42KD处出现一条新生蛋白带,经凝胶薄层扫描检测,表达量约占菌体蛋白的26.8%。结论:成功克隆了结核分枝杆菌Rv2389c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。     

重组结核分枝杆菌Rv2389c蛋白的纯化及其生物学功能的初步研究

目的：纯化晕组的结核分枝杆菌促进复活因子（resuscitation-promoting factor，Rpf）Rv2389c蛋白，并研究其对结核分枝杆菌、卡介苗（BCG）和藤黄微球菌的生长有无促进作用？方法：用亲和层析柱纯化重组的结核分枝杆菌Rv2389c蛋白，并将其加到一定浊度的结核分枝杆菌、BCG和藤黄微球菌培养液中，每隔一定时间测定菌液OD600值。结果：经过纯化，得到了去掉谷胱苷肽转移酶（GST）标签的重组Rv2389c蛋白，浓度为306.9μg／ml，且发现Rv2389c蛋白对结核分杆菌、BCG和藤茧微球菌的牛长都有一定的促进作用。结论：成功纯化了重组结核分枝杆菌Rv2389c蛋白，并证实它具有生物学活性，能促进结核分枝杆菌、BCG和藤黄微球菌的生长，为进一步研究其机制奠定了基础。     

牛结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的原核表达和纯化

构建牛结核分枝杆菌ESAT-6基因的原核表达载体,诱导表达、纯化并初步鉴定该蛋白。方法:以牛型分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增ESAT-6基因,产物通过双酶切克隆入pET-22b(+)质粒,经PCR、酶切、测序等方法鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)polys菌体,经IPTG诱导表达蛋白;利用Western-blot鉴定重组蛋白后,纯化目的蛋白。结果:所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致。经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现在6kDa处有特异性蛋白条带。纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论:成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。     

应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌

目的 探讨应用多重PCR技术快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的可靠性.方法 根据结核分枝杆菌种的MTP40基因序列(396bp),分枝杆菌属的32kD基因序列(506bp),结核分枝杆菌复合体群的IS6110序列(984bp),采用3对特异性引物(PT1,T2;MT1,T2;IS5,S6)在同一反应体系和条件下对92株结核杆菌临床分离株和5株非结核分枝杆菌临床分离株进行扩增,并与标准菌株进行比较.结果 92株结核分枝杆菌临床分离株中,0株扩增出与结核分枝杆菌H37RV标准株相同的396bp、506bp、984bp 3条DNA片段,敏感性达97.8%,特异性为100%;5株非结核分枝杆菌临床分离株均扩增出506bp DNA片段,敏感性达100%,特异性为100%.结论 应用多重PCR方法,对结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌进行鉴定,结果快速、准确、可靠,为临床结核病与非结核分枝杆菌病的快速诊断提供了有效的手段,具有很好的临床应用价值.     

结核分枝杆菌抗原Ag85A(Rv3840c)限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的预测及鉴定新的HLA-A*0201结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原Ag85A中的CD8+CTL优势表位。方法应用数据库SYFPEITHI预测可能存在的HLA-A*0201的限制性CD8+CTL表位,并经流式细胞术分析抗原肽与HLA-A*0201的亲和力、经时间荧光分辨法检测结核(TB)患者外周血单个核细胞(PBMCs)对抗原肽的增殖反应,再通过细胞毒实验研究抗原肽诱导的T细胞毒杀伤活性,逐步鉴定Ag85A的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位。结果位于Ag85A氨基酸序列(48-56)的肽表位与HLA-A*0201分子具有较高的亲和力,并能刺激HLA-A*0201阳性结核患者PBMC增殖,诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽6(GLPVEYLQV,48-56aa)是Mtb抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CD8+CTL的优势表位,这为今后进一步研究结核杆菌,作为设计结核疫苗的候选表位奠定了一些基础。     

两种培养基对结核分枝杆菌分离鉴定的比较

与世界总体水平相比 ,目前我国的结核病发病率仍然较高。为了选择检测效果好、成本低的培养基对结核分枝杆菌进行分离与鉴定 ,我们采用匡铁吉[1] 琼脂培养基与Ｌ ｗｅｎｓｔｅｉｎ[2 ] 培养基对痰标本中的结核分枝杆菌进行分离、鉴定 ,结果显示匡铁吉琼脂培养基临床效果较优。1　材料和方法1 1　痰标本与前处理　从我院住院肺结核患者中留取 12 7份痰标本 ,每份大约 10ｍｌ,收集在一个10 0ｍｌ的干净厂口玻璃瓶内。按痰标本量的 2 5倍体积加入 2 %氢氧化钠 (ＮａＯＨ)溶液 ,用玻璃棒反复搅拌 ,以使浓痰液化均匀 ;作用 2 0ｍｉｎ后即可用于…     

结核分枝杆菌ESAT-6＋CFP-10融合抗原克隆表达及其生物学活性

目的：克隆表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）融合抗原ESAT-6＋CFP-10（EC）,评价融合抗原EC刺激THP-1细胞培养上清中特定细胞因子分泌水平的变化。方法构建融合抗原EC原核表达载体,用纯化后的不同浓度融合抗原EC （10,20μg／ml ）刺激THP-1细胞,分别收集刺激12和24 h细胞培养上清,采用Bio-PlexProTM Assays细胞因子测定试剂盒检测细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、TNF-α和IFN-γ的分泌水平。结果成功克隆表达此菌EC融合抗原;经过融合抗原EC刺激THP-1细胞培养上清中IL-6、IL-8和TNF-α的分泌水平明显升高,差异具有统计学意义（ P＜0．05）,其余细胞因子的分泌水平在刺激前后没有显著变化。结论克隆表达的融合抗原EC具有生物学活性,能使THP-1细胞分泌的IL-6、IL-8及TNF-α水平升高。     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究

目的探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达多表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定重组多表位肽的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,多表位肽(10μmol)能刺激全部10例HLA-A*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖,SI为46.2±5.6;增殖反应明显高于单肽(平均SI为10.2±2.3)以及PPD(平均SI为15.6±3.6)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在多表位肽诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μmol)的T2细胞作为靶细胞,多表位肽诱导的CTL作为效应细胞,多表位肽能诱导全部的10例A2+PPD+健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(86.2±9.6%),显著高于单肽[平均为(25.4±3.6)%]和PPD[平均为(22.6±2.8)%](P<0.01)。结论重组优化多表位肽在细胞水平具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性。     

灭活草分枝杆菌注射剂佐治耐药肺结核病的统计分析

目的评价灭活草分支杆菌注射剂佐治耐药肺结核的疗效与安全性。方法搜集公开发表的有关灭活草分枝杆菌注射剂对耐药肺结核治疗效果,设计严密的临床研究,按Meta分析的要求对检索到的原始研究进行质量评估,对符合条件的所有研究结果进行Meta分析。结果符合纳入标准的文献共6篇,总样本量424例。佐用灭活草分支杆菌注射剂组212例其中有空洞者155例,病灶吸收185例,痰菌转阴169例,空洞闭合110例;未佐用灭活草分支杆菌注射剂组212例其中有空洞者151例,病灶吸收117例,痰菌转阴104例,空洞闭合60例。3项疗效指标合并OR值分别为5.55、4.66、4.36,整体效应检验P值均〈0.00001,表明疗效有非常显著性差异。结论灭活草分支杆菌注射剂能增强耐药肺结核化疗的效果,适合作为免疫治疗药物佐治耐药肺结核。     

应用亲合层析结合液相色谱串联质谱法发现结核分枝杆菌H37Rv的新的糖蛋白

目的:应用刀豆素A(ConA)亲合层析结合液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)发现结核分枝杆菌H37Rv的新的糖蛋白.方法:收集生长2周的结核菌培养液,经过滤浓缩得到培养滤液蛋白(culture filtrate protein, CFP).应用ConA亲合层析法纯化CFP中的糖蛋白,经SDS-PAGE电泳结合考马斯亮蓝染色后,对蛋白条带进行胰蛋白酶消化.应用HPLC-MS检测消化后的糖肽结构并与结核菌H37Rv蛋白质数据库进行比对,寻找新的糖蛋白.结果:CFP经ConA亲合层析纯化后的电泳结果显示有数条蛋白条带出现,经筛选相对分子质量26×103蛋白最可能为糖蛋白.酶切消化该蛋白得到的多肽在HPLC-MS上保留时间26.24 min处显示有多肽色谱峰,其对应的一级MS图提示该多肽总质量为1 467原子质量单位(AMU),二级MS图显示为多个质荷比(m/z)逐级减少为54(一个己糖的分子质量单位为162 AMU)的多肽,提示有己糖丢失.同时,MS分析肽链氨基酸序列并证实蛋白的糖基化存在.与结核菌H37Rv蛋白质数据库比对结果提示,结核菌分泌的26×103蛋白为一新的糖蛋白,即铜-锌超氧化物歧化酶.结论:应用ConA亲合层析结合HPLC-MS发现了一个新的结核分枝杆菌糖蛋白.     

蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达

构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR,以200μg、500μg、1000μg、2000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA317包装细胞,通过G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/ml。再用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织,产后奶样经FAPA法检测蚓激酶活性,结果表明牛奶具有明显的纤溶活性,也就是说蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。     

黑色素瘤抗原基因-1,3基因在肺癌组织中的表达及其意义

目的了解肺癌组织中和黑色素瘤抗原基因(MAGE)1,3基因的表达,并探讨其作为免疫治疗的靶抗原在肺癌中的应用价值。方法采用RTPCR法检测72例肺癌患者的肿瘤组织和相应的癌旁“正常”组织中MAGE1,3基因的表达情况。结果72例肺癌组织中,MAGE1表达阳性率为72%(52/72例)MAGE3表达阳性率为69%(50/72例)MAGE1,3表达双阳性率为52%(38/72例),MAGE1,3任一基因表达阳性者64例,阳性率为89%(64/72例)。癌旁"正常"组织中MAGE1,3基因表达阳性率分别为47%(34/72例)和44%(32/72例),MAGE1,3表达双阳性率为31%(22/72例)。肺癌组织MAGE1,3基因表达阳性率均高于癌旁“正常”组织,5株肺细胞株MAGE1,3基因表达均为阳性。结论基于MAGE1,3基因在肺癌中的高表达率,可利用其作为靶分子进行免疫治疗,同时也可作为一种有临床价值的随访指标。     

血管生成素基因在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

目的：利用原核表达系统获得重组血管生成素(Ang)并研究其生物学活性。方法：构建高效融合表达载体pGEx4T—Ang，诱导表达后利用亲和层析的方法纯化目的蛋白，经切割后获得非融合的重组人Ang，利用Westem印迹检测表达产物的特异性，通过鸡胚尿囊膜血管增生实验检测重组蛋白的生物学功能。结果：表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20％，亲和层析纯化蛋白的纯度在90％，能够与Ang抗体产生特异性反应，并具有明显的促进血管新生的活性。结论：原核表达的重组Ang具有良好的生物学活性。