弓形虫SAG2和GRA2基因疫苗的免疫保护研究

DNA疫苗是将编码抗原的基因插入载体质粒中构成重组体,直接接种机体,在接种部位摄取表达并达到抗感染目的的一种疫苗。pCMV—Taq2B载体具有人巨细胞病毒（Humancytomcgalovirus,CMV）高效启动子／增强子序列,可使目的基因在真核细胞中高水平稳定表达成为DNA疫苗载体。构建pCMV-Taq2B—Surfaceantigen2（表面膜抗原2）（pSAG2）、pCMV—Taq2B—Densegranuleprotein2（致密颗粒蛋白2）（pGRA2）及pCMV．Taq2B—SAG2．GRA2（pSAG2-GRA2）DNA疫苗并研究其免疫保护效果。将pSAG2、pGRA2、pSAG2-GRA2DNA疫苗（实验组）、磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline,PBS）、pCMV—Taq2B空质粒（对照组）分别肌肉注射BALB／c小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体水平。末次免疫后第28d,各组每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子1000个,观察小鼠的生存时间。结果显示单基因疫苗pSAG2、pGRA2和双基因疫苗pSAG2一GRA2免疫组均能诱导产生特异性IgG抗体,且于末次免疫后第28d达到最高值,此时单基因疫苗pGRA2（0．382±0．66）和双基因疫苗pSAG2-GRA2（0．548±0．137）免疫组吸光度值显著高于PBS（0．137±0．016）或pCMV—Taq2B（0．135±0．010）对照组吸光度值。免疫单基因疫苗pSAG2（14．3±1．8）、pGRA2组（13．5±2．1）小鼠存活时间（d）明显长于PBS（4．3±1．6）及pCMV—Taq2B组（4．1±1．3）,且双基因疫苗pSAG2．GRA2组（19．6±2．4）小鼠存活时间明显长于单基因疫苗pSAG2组及pGRA2组。弓形虫双基因疫苗pSAG2-GRA2能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,其免疫保护性优于pSAG2、pGRA2单基因疫苗。     

弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定

本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）,并初步评价其免疫反应性。主要步骤为体外细胞培养速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP2基因全长,与pET-41 Ek／LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His—ROP2,最后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性。本研究获得了ROP2全长重组蛋白,初步证明其良好的免疫反应性,为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法,研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :构建弓形虫棒状体蛋白 (ROP2 )基因重组质粒并在大肠杆菌中表达 ,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子。方法 :根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段 ,再克隆到pGEX 4T 1质粒 ,重组质粒经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序 ;重组质粒在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中进行ITPG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE及WesternBlot分析。结果 :ROP2基因PCR产物大小与预期相符 ,约 1 0 4 3bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合 ;SDS PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为 5 5kDa ,表达产物约占菌体总蛋白1 7% ,具有一定的免疫反应性。结论 :克隆并表达了弓形虫ROP2基因 ,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain—like基因片段，构建原核表达载体，诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入SalI和EcoRI酶切位点。应用FIT—PCR扩增弓形虫RH株Calpain—like基因片段，插入pGEM—T载体，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，亚克隆到原核表达质粒pET32a，重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子eDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段；含pET32a／Calpain—like的重组质粒在宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain—like基因，弓形虫Calpain—like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

刚地弓形虫醛缩酶蛋白的表达及其多克隆抗体的纯化

目的:体外制备弓形虫醛缩酶(aldolase)蛋白及其多克隆抗体.方法:以弓形虫cDNA链为模板,PCR扩增醛缩酶基因,构建aldolase/pET30a原核表达系统;IPTG诱导表达aldolase-His6蛋白;用纯化的蛋白加免疫佐剂免疫SD大鼠,收集抗血清,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的效价.结果:构建了aldolase原核表达系统,表达并纯化了aldolase-His6蛋白;获得了抗该蛋白的大鼠源性抗血清,纯化后的多克隆抗体效价为1∶4 000.结论:在体外制备并纯化了aldolase-His6蛋白及其多克隆抗体,为后续研究aldolase的功能奠定了基础.     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

匹多莫德增强弓形虫GRA1蛋白免疫效果的动物实验评价

目的:探讨匹多莫德增强弓形虫GRA1蛋白刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果。方法:匹多莫德和毕赤酵母菌表达的弓形虫GRA1蛋白混合皮下注射免疫小鼠,以PBS作对照,检测其细胞免疫和体液免疫,并观察其受到弓形虫攻击感染后的生存情况。结果:匹多莫德能辅助GRA1蛋白刺激宿主产生较高的细胞免疫和体液免疫,并能提供较好的免疫保护力。GRA1蛋白加匹多莫德组、GRA1蛋白加弗氏完全佐剂组小鼠IFNγ-、特异性IgG显著高于对照组(P<0.01)和GRA1蛋白组(P<0.01);各免疫组CD8+T细胞数量显著高于对照组(P<0.01);GRA1蛋白加匹多莫德组CD4+T细胞数量(P<0.01)、CD4+/CD8+比值显著高于其它免疫组(P<0.05)。各免疫组T细胞增殖活性与PBS对照组比较明显增强(P<0.01),GRA1蛋白加匹多莫德组T细胞增殖活性最明显。小鼠攻击试验表明,GRA1蛋白加匹多莫德组和GRA1蛋白加弗氏完全佐剂组小鼠存活时间明显长于对照组和GRA1蛋白组。结论:匹多莫德与弗氏佐剂具有相似增强免疫应答和提高GRA1蛋白抗原的免疫原性作用,可望用于弓形虫亚单位疫苗的研制。     

人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果:RT-PCR扩增出了大小为543 bp 的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的蛋白.结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

HPV16 L1基因的原核表达及免疫反应性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)主要衣壳蛋白L1，并鉴定其免疫反应性。方法：将HPV-16L1基因克隆人原核表达载体pThioHisC中，构建重组表达载体。以重组载体分别转化大肠杆菌Top10和DH5α，在IPTG诱导下表达外源基因，用SDS—PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析。结果：构建了HPV—16L1基因的原核表达质粒pThioHisC／HPV—16L1，并在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)约为70800的蛋白。表达的蛋白能与抗HPV—16L1抗体发生特异性反应。结论：在原核细胞中成功地表达HPV—16L1基因，为HPV—16L1疫苗的研制提供了必要的基础。     

弓形虫虎源分离株ROP10基因的克隆、序列分析及其表达研究

采用RT-PCR技术从弓形虫虎源分离株中扩增出ROP10基因,将其克隆入pMD18-T载体中进行测序和生物信息学分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。该基因全长1761bp,编码586个氨基酸,其中前28个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比,16个核苷酸存在变异,导致7个氨基酸发生改变,但两者N-联糖基化位点的数量和位置没有差异,两虫株核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.2%和98.8%。转化重组质粒pETROP10的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出分子量为67.6 kDa的重组蛋白,表达量占菌体蛋白的13.8%。     

人源肠毒素大肠杆菌CS3纤毛基因的克隆及表达

Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹结果证明在ＣＦＡ／Ⅱ阳性菌Ｅ４４８１５的诸多质粒中，编码ＣＳ３纤毛抗原的质粒为一约为６０ＭＤ的大质粒；当这些质粒用ＨｉｎｄⅢ消化时，该抗原的编码基因位于５．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上。回收该片段并插入到载体质粒ｐＢＲ３２２的ＨｉｎｄⅢ位点，构建了Ｅ．ｃｏｌｉＥ４４８１５株质粒的有限基因库。通过筛选，获得了两种插入方向的阳性重组子。全细胞ＥＬＩＳＡ测定结果表明，只有当插入片段的转录方向和载体质粒中的ｐ１启动子的转录方向一致时，重组质粒才能有效地表达ＣＳ３纤毛抗原；宿主不同时表达水平存在一定差异。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹试验表明：ＣＳ３纤毛抗原有两种不同的单体形式，分子量大约分别为１５．０ｋＤ和１５．５ｋＤ。ＣＳ３纤毛抗原编码基因的克隆为研究ＣＳ３基因表达调控和研制预防ＥＴＥＣ腹泻疫苗打下了基础。