脂质体转基因应用的研究进展

脂质体 (ｌｉｐｏｓｏｍｅ)特别是阳离子脂质体 (ｃａｔｉｏｎｉｃｌｉｐｏｓｏｍｅ)作为一种基因转运工具得到了广泛的应用。与其它非病毒基因转运系统一样 ,它具有生产简便、毒性低、无感染危险等优点[1] 。脂质体介导的转染技术已被广泛应用于将外源性基因导入哺乳动物细胞的研究中。本文就近年来脂质体在真核细胞和真核生物中转基因应用的研究进展做一回顾。一、在治疗肿瘤方面的应用 :脂质体作为一种转基因的载体 ,被人们纷纷应用于通过转移不同的外源基因来达到治疗各种肿瘤的目的。Ｍｅｙｅ等[2 ] 用阳离子脂质体将表达绿色荧光蛋白 …     

PEG-3启动子在前列腺癌细胞DU145中的活性鉴定

目的探讨PEG-3启动子在前列腺癌细胞DU145中的启动活性。方法用PCR法扩增PEG-3启动子;在真核表达质粒pShuttle-CMVp-EGFP基础上构建PEG-3启动子调控的、转录绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒pShuttle-PEG3p-EGFP。将2种质粒(pShuttle-PEG3p-EGFP和pShuttle-CMVp-EGFP)用脂质体分别转染前列腺癌细胞DU145和人正常前列腺上皮细胞RWPE-1,72 h后在荧光显微镜下用Im-agepro-Plus 6.0分析2种启动子启动绿色荧光蛋白基因的转录活性。结果重组质粒在前列腺癌细胞DU145中观察到了绿色荧光,在人正常前列腺上皮细胞RWPE-1细胞中无绿色荧光。pShuttle-PEG3p-EGFP和pShuttle-CMVp-EGFP 2种质粒在前列腺癌细胞DU145中的荧光强度分别为403.50、130.93。结论所克隆的PEG-3启动子表现出较强的肿瘤特异性,在前列腺癌细胞DU145中有一定的启动活性,可望开发成为肿瘤靶向性基因治疗工具。     

脆性组氨酸三联基因与妇科肿瘤

随着分子生物学的发展，许多癌基因和抑癌基因被发现。在肿瘤的发生发展和转移中，癌基因的激活和抑癌基因的失活有十分重要的作用。目前认为肿瘤是1种基因性疾病，多种癌基因和抑癌基因协同作用而导致肿瘤的发生和发展。脆性组氨酸三联基因(fragile histidine triad，FHIT)是1996年被分离出来的1种新的肿瘤抑制基因，在多种肿瘤中发现它有异常改变。现就FHIT与妇科肿瘤的研究进展作一综述。     

减毒沙门氏菌靶向携带共表达质粒p53/siRNA-survivin抗前列腺癌的体内研究

目的：以人减毒沙门氏菌为基因运载体，探讨其携带p53、siRNA-survivin及其共表达质粒p53／siRNA-survivin对肿瘤的靶向性及抗人前列腺癌效应，方法：复制裸鼠前列腺癌皮下移植瘤模型，分别将已构建的重组表达质粒siRNA-scramble，p53，siRNA-survivin及共表达质粒p53／siRNA-survivin转化到减毒人伤寒沙门菌Ty21a，制备成对应重组减毒沙门菌，通过灌胃及瘤内注射到前列腺癌荷瘤裸鼠体内，观察成瘤时间及瘤块大小；以携有绿色荧光蛋白siRNA-survivin的重组茵作为报告基因，流式细胞术检测其在肝、脾、肿瘤组织中靶向分布及基因呈递作用；应用RT-PCR，Western blot，及免疫组织化学染色方法检测治疗后肿瘤组织p53和Survivin基因及蛋白表达。结果：各治疗组均较对照组肿瘤生长缓慢，肿瘤体积小，共表达质粒组与单独基因治疗组比较，肿瘤体积明显缩小，抑瘤率高；荷瘤裸鼠肿瘤组织可测及survivin mRNA表达下降，p53基因表达增强，p53相关基因GRIM-19 mRNA和蛋白表达增强；FCM检测结果发现，减毒人沙门氏菌可在肝、脾及肿瘤组织中存活及表达，但以肿瘤中绿色荧光聚集明显且维持时间较长，其他脏器仅见极少的绿色荧光，结论：人减毒沙门氏菌可作为外源基因载体携带重组质粒，对前列腺癌移植瘤有明显的靶向性，其靶向介导的p53，siRNA-survivin及其表达基因p53／siRNA-survivin，对前列腺癌荷瘤裸鼠有治疗作用，共表达基因较单基因治疗效果好，具有显著的协同作用。     

辐照后辐射敏感启动子CArG调控HSVtk基因对肺癌细胞的杀伤效应

放射-基因治疗是将放射敏感性调控序列与治疗基因相耦联，在肿瘤受照射时诱导治疗基因仅在肿瘤内表达，以提高治疗效率。是肿瘤治疗的一种新策略。Egr-1属即刻早期应答基因家族成员之一，是编码533个氨基酸的核酸蛋白转录因子，含6个高度保守的CC（A／T）。GG结构域，又称为cA以元件。据报道CArG元件比天然的Egr-1基因射线应答性更强。本研究为了构建包含CArG元件和增强的绿色荧光蛋白（EGFP）或HSVtk基因的载体，观察射线照射时CArG元件诱导EGFP在SPCA1和A549肺癌细胞株中的表达变化；将pDNA．CArG．HSVtk质粒短暂结逝SPCA1和AS49细胞株，照射后加入GCV，     

hTERT启动子的克隆及在MCF7乳腺癌细胞中的特异转录活性

背景与目的：利用肿瘤特异性启动子增强肿瘤细胞中治疗基因的转录选择性是达到基因治疗靶向性的有效途径。人端粒酶催化亚基（hTERT）在大部分肿瘤细胞中呈特异性高表达，有可能成为肿瘤特异性启动子。本文扩增了hTERT基因启动子并分别克隆于报告基因重组质粒pEGFP-1和pGL3-Basic，检测并证实hTERT启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法：采用套式PCR法扩增hTERT启动子，将其分别克隆到含报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒pEGFP-1和含Luciferase的重组质粒pGL3-Basic，经脂质体分别转染人乳腺正常上皮细胞系HBL100和乳腺癌细胞MCF7，荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并测定两种细胞中荧光素酶转录表达差异。结果：与正常细胞HBL100相比，hTERT启动子在MCF7细胞呈现强的绿色荧光表达；荧光素酶活性检测与其一致，hTERT启动子在MCF7乳腺癌细胞的荧光素酶相对活性RLU／U值（33784）约相当于HBL100细胞中（2400）的15倍。结论：hTERT启动子在乳腺癌MCF7细胞中具有很强的特异性，为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定实验基础。     

转铁蛋白-多聚乙烯亚胺体外转染小鼠骨肉瘤细胞的实验研究

目的评价转铁蛋白-多聚乙烯亚胺(transferrin-polyethylenimine,Tf-PEI)靶向性转染小鼠骨肉瘤细胞的可行性,并确定最佳的转染条件.方法以Tf-PEI为载体,将绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因分别导入小鼠骨肉瘤细胞,用荧光显微镜及荧光素酶检测系统检测其转染效率.以游离转铁蛋白竞争性拮抗Tf-PEI,并观察它对转染效率的影响.结果Tf-PEI可以高效的、靶向性的转染小鼠骨肉瘤细胞.当N/P比值为5时,Tf-PEI的转染效率最高.游离转铁蛋白能够显著的拮抗Tf-PEI的转染.结论Tf-PEI是一种高效率、低毒性、肿瘤靶向性的基因转染载体,它可以作为体外恶性肿瘤基因治疗试验的一个有效工具.     

野生型P53基因转染对肝肿瘤细胞系的影响

随着肿瘤发生的分子机制研究取得重要进展，肿瘤的治疗技术除外科手术、放疗、化疗以及生物治疗外，人们目前正寻求一种新的治疗方法——基因治疗。P53基因是当今研究的热点之一，它与人类许多肿瘤的发生发展有关。野生型P53基因是显性基因，单拷贝基因的表达就可抑制肿瘤的生长，因此，将野生型P53基因导入肿瘤细胞，     

XRCC1基因在肿瘤研究中的应用

肿瘤是一种基因病，基因组的稳定与否和肿瘤的发生密切相关。XRCC1基因是一种DNA损伤修复基因，在基因组损伤后的修复过程中发挥作用，对维持基因组的稳定，预防肿瘤的发生有着重要的意义。本文就XRCC1基因的生物学特点，该基因单核苷酸多态性与肿瘤易感性，以及该基因的研究方法等方面进行了文献回顾，为该基因用于肿瘤的预防、诊治提供理论借鉴。     

p53基因突变在肺癌诊断中的应用研究

ｐ５３基因突变在肺癌诊断中的应用研究刘欣燕，王玉珍，孙以瑜，王孟山，徐文新ｐ５３基因是一种重要的抑癌基因，它在肿瘤的发生、发展过程中起着很重要的作用。目前已在多种人类肿瘤中发现ｐ５３基因的失活，肺癌组织中ｐ５３基因的研究在国内很少，尤其是对于在肺癌早...     

放射诱导的一氧化氮同步放大基因电路的构建及鉴定

背景与目的 正反馈基因电路（genecircuits）对基因表达有放大作用，目的 基因在细胞内的同步化表达可进一步增强基因治疗效果。本研究旨在构建由放射诱导的一氧化氮（nitric oxide，NO）同步放大基因电路，以探索提高目的基因表达水平、延长表达时间的新途径，从而进一步完善肿瘤放射基因治疗模式。方法 将具有放射诱导性的c-fos启动子与诱导性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）串联，构建c-fos启动子驱动的iNOS和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）双顺反子表达载体pros-iNOS／GFP；用脂质体介导该载体转染肺腺癌A549细胞，予以一定剂量照射，观察照射后不同时相点细胞荧光强度，检测iNOS蛋白表达水平。结果转染载体pros-iNOS／GFP的细胞照射后细胞荧光强度、iNOS表达水平均较对照组明显增加，其中以照射后16h增加最为明显。结论成功构建了放射诱导的NO同步放大基因电路，大大提高了放射诱导的目的基因的表达水平，为进一步提高肿瘤放射基因治疗的疗效奠定了理论基础。     

自杀基因靶向核素治疗肿瘤研究进展

肿瘤的基因治疗是近年来的研究热点。而基因治疗与放射性核素结合产生的基因靶向性放射性核素治疗，是在自杀基因疗法等基础上建立起来的一种新的肿瘤基因治疗方法。它形成了自杀基因和放射性核素对肿瘤的双重杀伤作用，为肿瘤的基因治疗开拓了新的研究方向。     

自杀基因靶向核素治疗肿瘤研究进展

肿瘤的基因治疗是近年来的研究热点。而基因治疗与放射性核素结合产生的基因靶向性放射性核素治疗，是在自杀基因疗法等基础上建立起来的一种新的肿瘤基因治疗方法。它形成了自杀基因和放射性核素对肿瘤的双重杀伤作用，为肿瘤的基因治疗开拓了新的研究方向。     

增强型绿色荧光蛋白基因稳定转染胰腺癌细胞

目的：建立稳定高表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）并能连续传代的胰腺癌细胞株。方法：将携带EGFP基因的pEGFP—C1质粒体外转染人胰腺癌细胞株SW1990，G418筛选稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养，用荧光显微镜和流式细胞仪检测癌细胞荧光蛋白表达。结果：转染EGFP的胰腺癌细胞用G418筛选18天后，挑选克隆扩大培养，癌细胞几乎均见荧光蛋白表达并可连续稳定传至20代以上。结论：胰腺癌细胞株SW1990-EGFP的建立有助于构建理想的动物模型来研究肿瘤侵袭和转移的机制。     

肿瘤转移相关基因原肌球蛋白2的克隆及功能初步研究

目的构建携带肿瘤转移相关基因原肌球蛋白2(TM2)的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,初步探讨其在肿瘤细胞稳定表达后的生物学功能。方法采用逆转录多聚酶链反应(RT- PCR)从人胃癌细胞株AGS中扩增全长的TM2-cDNA序列,采用基因重组技术构建带TM2的绿色荧光蛋白真核表达载体pIRES2-EGFP;通过脂质体转染方法将重组基因转入TM2低表达肝癌细胞株QGY-7703中。荧光显微镜观察及流式细胞仪检测重组pIRES2-EGFP-TM2的荧光表达;Western blot检测细胞转染后TM2的蛋白表达;研究TM2基因与肝癌细胞株QGY-7703体外侵袭、移动及裸鼠成瘤等生物学特性的关系。结果成功构建了携带TM2的绿色荧光蛋白真核表达载体;荧光显微镜观察显示,在转染重组质粒的QGY-7703细胞中均有绿色荧光的表达;流式细胞仪检测显示,QGY-7703- EGFP-TM2的荧光表达率为90%以上;Western blot检测证实,TM2在转染的QGY-7703细胞系中表达明显升高;转染了TM2的细胞株侵袭能力(45.6±9.9)显著高于其亲代细胞(21.6±3.3,P<0.05);转染TM2的细胞株迁移能力(41.4±11.8)显著强于其亲代细胞(16.7±3.7,P<0.05);实验组、空白对照组和载体对照组肿瘤平均体积分别为(241.5±95.1)mm3、(123.7±92.3)mm3和(100.6±85.4)mm3,实验组与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),表明转染TM2能明显促进肿瘤的生长。结论TM2基因对促进肝癌细胞的生长和转移发挥重要作用。     

p57^kip2与肿瘤

p57^kip2基因的编码产物是一种广泛的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的抑制蛋白。它通过调控细胞周期进程，参与肿瘤细胞的增殖、分化与凋亡。在多种肿瘤中均发现p57^kip2基因表达异常，且在某些肿瘤中是一种独立的预后因素，与肿瘤的发生、发展及预后有着密切关系。     

肿瘤血管特异结合抗体ScFvH1的靶向性和抑瘤性

目的：检测从肿瘤特异单链抗体库中筛选到的肿瘤血管特异结合单链抗体ScFvH1的靶向性和抑瘤性，探讨该抗体在癌症诊断和治疗中应用的可能性。方法：将该单链抗体基因插入到含绿色荧光蛋白（EGFP）基因及带有硫氧还原蛋白（Trx）基因的原核表达载体pET-28a（＋）／EGFP及pTIG—Trx中，在大肠杆菌中进行表达，并经镍柱（Ni—NTA）纯化。建立人宫颈癌HeLa细胞裸鼠皮下移植瘤模型，尾静脉注射纯化的单链抗体-EGFP融合蛋白，通过荧光显微镜观察肿瘤部位及其他器官中EGFP信号，考察该单链抗体的靶向性；同时在裸鼠致瘤部位注射纯化的单链抗体蛋白，观察该单链抗体对肿瘤生长的抑制性。结果：在大肠杆菌中表达了该单链抗体基因片段，并使单链抗体-EGFP融合蛋白得到了很好的表达，经镍柱纯化后得到了电泳级的单一条带。靶向性实验结果显示，单链抗体-EGFP融合蛋白在肿瘤部位得到了富集，而只注射EGFP蛋白的肿瘤组织中荧光很少，并且在裸鼠肺部组织中没有观察到EGFP荧光信号。抑瘤性实验发现，单链抗体处理组移植瘤生长速率与PBS组类似。结论：从肿瘤特异单链抗体库中筛选到的肿瘤血管特异抗体ScFvH1具有较好的肿瘤血管靶向性，而对肿瘤生长的抑制作用不明显，为进一步研究抗体在肿瘤诊断和治疗中的应用奠定了基础。     

伴颈部淋巴结转移的甲状腺乳头状癌的基因差异表达

背景与目的：甲状腺乳头状癌是预后较好的一种恶性肿瘤，颈部淋巴结转移是其主要的转移方式。近年来迅猛发展起来的基因芯片技术是研究肿瘤生物学行为的一种快速、高效的方法。本研究拟比较初治有颈部淋巴结转移（cN1）的甲状腺乳头状癌组织与正常甲状腺组织的基因差异表达，筛选甲状腺乳头状癌的转移相关基因。方法：分别用Cy3和Cy5两种荧光染料标记两组组织的总mRNA，与含有14112个基因位点的芯片进行杂交。通过对荧光信号的扫描、分析，筛选两组差异表达的基因。结果：共有1212个基因位点在两组间出现差异表达，占总基因点位数的8．71％。其中22个位点呈显著差异表达（上调或下调8倍以上）。在显著下调的6个位点中，有2个位点代表同一个基因序列（NM-001920）——decorin蛋白的mRNA序列。结论：基因芯片是研究疾病发生发展过程中基因表达改变的有效方法之一。PTC的发生发展（包括颈部淋巴结转移）涉及众多的基因参与。Decorin蛋白可能在甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移中发挥重要作用。     

EGFP标记的人肺癌裸鼠原位移植模型的建立

背景与目的 小鼠活体分子成像模型可以连续实时监测活体肿瘤的变化.本研究拟通过外科原位移植法建立表达绿色荧光蛋白的肺癌裸鼠原位移植模型并探讨其肿瘤生物学特性,从而建立一个良好的肺癌动物实验研究平台.方法 利用逆转录病毒转染法将增强型绿色荧光蛋白基因导人人肺癌大细胞系NCI-H460,采用外科原位移植法建立肺癌原位移植模型.定期通过小动物活体荧光成像系统观察肿瘤生长,利用相关性检验分析荧光面积和肿瘤体积之间的相关关系,并观察原位移植术后裸鼠的生存期和肿瘤转移情况.结果 模型建立后1周通过皮瓣在荧光体视镜下可观察到肺部肿瘤的绿色荧光,成瘤率为100%.荷瘤裸小鼠平均生存期为34.2天.解剖裸鼠观察到肿瘤侵及对侧肺、纵隔及肺门淋巴结、胸膜和膈肌,转移率分别为87.596、75%、25%和12.5%.肿瘤体积和荧光面积具有相关性(r=0.873,P=0.001).结论 外科原位移植法建立的表达EGFP的裸鼠肺癌原位模型是肺癌临床前研究的理想的实验工具.应用小动物活体荧光成像系统能够定量客观评价肿瘤在动物体内的生长、侵袭和转移,该模型可应用于肺癌的基础研究和新药开发.     

鼻咽癌中细胞凋亡与p16 p130 nm23-H1表达的关系

鼻咽癌（nasopharyngeal carciaoma，NPC）是我国南方五省及东南亚常见的上皮性恶性肿瘤。分子生物学的研究结果表明肿瘤是一种基因异常的疾患，它的发生是一个多基因、多步骤的逐步演变过程，这些基因在肿瘤中的作用及各基因之间相关性成为国内外研究的热点之一。近年来随着对机制研究的深入，发现多种肿瘤与许多癌基因、抑癌基因有关，凋亡调控基因已被看作是一类新的肿瘤发生相关基因。