结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变的序列分析

目的探讨结核分枝杆菌耐药基因rpoB突变与利福平耐药性的关系。方法采集81例临床标本,分离结核分枝杆菌菌株,PCR扩增rpoB基因及测序,并与利福平药物敏感试验结果比较。结果27例耐利福平菌株中,20株发生rpoB基因突变(74.1%),突变位点包括531和526在内的7个位点10种突变类型,并发现新的突变位点和突变形式;54株敏感株中,1株发生突变(1.9%)。结论利福平耐药rpoB基因突变有一定区域性,为发展快速的基因诊断技术检测耐多药结核病奠定了基础。     

快速检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因mPCR-SSCP建立及应用

目的 建立快速检测结核分枝杆菌异烟肼(INH)和利福平(RFP)耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变的多重聚合酶链反应-单链构象多态性(multi PCR-single strand conformational polymorphism analysis,mPCR-SSCP)方法.方法 药敏试验检测134株结核分枝杆菌临床菌株对INH和RFP的耐药性.设计结核分枝杆菌INH和RFP耐药相关katG、inhA和rpoB基因PCR引物,建立mPCR-SSCP技术检测上述菌株katG、inhA和rpoB基因的突变,同时采用PCR直接测序技术(PCR-DS)检测上述基因片段突变情况,并对上述3种方法检测结果进行分析和比较.结果 134株临床菌株均含有katG、inhA和rpoB基因,其中42株(31.3％)对INH耐药、45株(33.6％)对RFP耐药.mPCR-SSCP和PCR-DS检测结果显示,92株INH敏感菌株katG和inhA基因均未发生突变,检测特异性均为100％;89株RFP敏感菌株中rpoB基因分别有2株和1株检测出突变,检测特异性分别为97.8％和98.9％;42株INH耐药菌株中分别有33株和36株katG和/或inhA基因突变,检测灵敏度分别为78.6％和85.7％;45株RFP耐药菌株中rpoB基因分别有41株和43株发生突变,检测灵敏度分别为91.1％和95.6％.结论 本研究建立的mPCR-SSCP能快速、简便、特异,并有一定的敏感性检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变,具有临床应用前景.     

结核分支杆菌3种不同靶基因传统PCR巢式PCR检测比较研究

本文以结核分支杆菌的插入序列基因、6 5KDa抗原基因和rpoB基因为靶基因 ,系统地比较了以 1对引物扩增的传统PCR和以 2对引物扩增的巢式PCR的灵敏度和特异性。结果为本文所采用的引物均为人结核分支杆菌复合群特异 ;巢式PCR灵敏度高于传统PCR ,其中以rpoB基因为靶基因的巢式PCR灵敏度达一个结核分支杆菌。rpoB基因巢式PCR产物经DNA测序并可确认对利福平敏感与否。rpoB基因巢式PCR可作为结核病和利福平耐药的辅助诊断方法     

HRCA技术联合DNA芯片检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变的初步分析

目的 对超分支滚环扩增技术(hyperbranched rolling cycle amplification, HRCA)技术联合DNA芯片检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变进行初步分析.方法 采用直接涂片检测在2013年至2015年期间搜集的898份痰液样本中结核分枝杆菌情况,同时采用改良罗氏培养法与HRCA技术联合DNA芯片法对阳性样本进行鉴定,并对利福平耐药基因进行初步分析.结果 989份检测的痰液样本中361份为阳性,涂阳率为40.2%.HRCA技术联合DNA芯片法阳性率为98.0%,显著高于改良罗氏培养法(35.2%),且差异具有统计学意义(P<0.05).通过HRCA技术联合DNA芯片法发现85株结核分枝杆菌对利福平耐药,其中单纯rpoB 基因突变比例为36.5%(31/344);katG基因与rpoB基因均突变比例为60.0%(51/344);inhA基因与rpoB基因突变比例均为3.5%(3/344);且二位点联合突变及单位点突变率分别为89.4%(76/85)与10.6%(9/85).结论 HRCA技术联合DNA芯片法能够有效快速检出结核分枝杆菌突变基因,rpoB基因突变为主要结核分枝杆菌利福平耐药的基础,且突变呈现多样性.     

特异引物双扩增即时PCR与传统测序法检测肠癌、肺癌患者K-ras基因突变的比较

目的 以特异引物双扩增即时PCR技术K-ras检测试剂盒(下称ADx-K-ras即时PCR试剂盒)和Sanger DNA测序法同时检测结直肠癌和肺癌患者K-ras基因,以了解K-ras基因突变频率和突变类型,比较ADx-K-ras即时PCR试剂盒和Sanger DNA测序法用于肿瘤K-ras基因体细胞突变检测的临床价值.方法 收集临床肿瘤病理石蜡切片样品827例,其中肠癌样品583例,肺癌样品244例,提取DNA后,对K-ras基因第12和13密码子进行PCR扩增后,使用ADx-K-ras即时PCR试剂盒进行检测,与此同时,将PCR扩增后的产物进行Sanger DNA测序.两种方法对K-ras基因第12和13密码子的检测结果进一步进行各个突变类型的数目和突变率的统计对比.结果 ADx-K-ras即时PCR试剂盒对827例样品检测都得到了明确的结果,检测成功率为100%,Sanger DNA测序成功检测了677例,成功率为81.9%.583例肠癌样品中ADx-K-ras即时PCR试剂盒检测出突变192例,突变检出率为32.9%,Sanger DNA测序成功的样品533例,检出突变160例,突变检出率为30.0%.244例肺癌样品中ADx-K-ras即时PCR试剂盒检出突变26例,突变检出率为10.7%,Sanger DNA测序成功的样品144例,检出突变12例,突变检出率为8.3%.肠癌中第12密码子第2位的GGT→GAT最常见,占全部突变的35.1%(66/188),其次是第13密码子第2位的GGC→GAC,26.6%(50/188),第12密码子第2位的GGT→GTT,18.6%(35/188),第12密码子第1位的GGT→GCT最少见,1.6%(3/188).肺癌中第12密码子第1位的GGT→GTT最常见,占全部突变的40.9%(9/22),同样第12密码子第1位的GGT→GCT最少见,占全部突变的4.5%(1/22).结论 肠癌中K-ras突变率明显高于肺癌.对于甲醛固定石蜡包埋样品而言,ADx-K-ras即时PCR试剂盒对样品的DNA质量的耐受性较好,检测成功率高于Sanger DNA测序,可替代Sanger DNA测序法成为临床上对肿瘤K-ras基因体细胞突变检测的实用方法.     

STD者人型支原体培养阳性的分子鉴定及四环素耐药的分子检测

目的　为评价人型支原体 (Mh)培养的正确性和Mh对四环素敏感状况。方法　收集 48例经法国梅里厄公司MycoplasmaID支原体鉴定培养基培养判别为Mh阳性的培养物进行Mh套式PCR检测以作分子鉴定 ,并对Mh套式PCR阳性的培养物作四环素耐药决定基因TetM基因PCR检测。结果　 48例MycoplasmaID支原体鉴定培养基培养判别为Mh阳性的培养物 45例经Mh套式PCR检测为阳性 ;该 45例TetM基因PCR检测均为阴性。结论　Mh培养至少存在假阳性。四环素类仍是Mh治疗的敏感药物     

环丙沙星药敏检测在大肠埃希菌graA基因突变关系研究

为了解3株3次环丙沙星药敏检测结果不一致的大肠埃希菌gyrA基因基因突变状况，本文对该3株菌和另3株3次环丙沙星药敏检测均为耐药的大肠埃希菌进行了gyrA基因基因喹诺酮耐药区（QRDR）PCR扩增和产物DNA测序。结果为3株3次环丙沙星药敏检测结果不一致的和另3株3次检测均为耐药的大肠埃希菌均存在gyrA基因基因第83和第87位氨基酸密码子的突变（TCG→TTG，GAC→AAC）。     

基因型分析法快速检测耐药结核分枝杆菌

目的 探讨基因型分析法检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药性的价值.方法 采用多重PCR和线性探针反向膜杂交法来检测异烟肼耐药基因katG S315T和inhA C-15T突变以及利福平耐药基因rpoB D516V,H526Y,H526D,S531L突变来判断78株结核分枝杆菌临床分离株的耐药性,并与金标准L-J固体培养基药敏法以及BACTEC960液体培养药敏法进行对比分析.结果 基因型分析法在6h内可以完成;结核分枝杆菌常规药敏检测需要3个月.与后者相比,基因型分析法检测异烟肼耐药的敏感性和特异性分别为89％ （16/18）和99％ （77/78）;检测利福平耐药的敏感性和特异性均为100％（13/13,78/78）.结论 基因型分析法检测结核菌耐药性快速准确,对耐药结核病的早期诊断和治疗很有帮助,有望在临床实验室广泛开展.     

甲状腺激素抵抗综合征一家系TRβ基因突变研究

目的研究一个甲状腺激素抵抗综合征家系甲状腺激素受β（thyroid hormone receptor β，TRβ）基因（TRβ）突变情况。方法提取患者及14名家系成员、7名健康对照的外周血基因组DNA，PCR分段扩增刀够基因的第7～10外显子，产物纯化后直接进行DNA测序检测突变。结果测序结果，该家系中5名成员TRβ基因第10外显子的1642位核苷酸发生C→G的转换突变，该突变为错义突变，使该位点所编码的氨基酸由脯氨酸变为丙氨酸（P1453A），同时刀够基因第7外显子的第1020位核苷酸发生C→T的转换突变，该突变为一同义突变，其所编码的氨基酸仍为苯丙氨酸（F245F），两种突变均为杂合子突变。结论在中国人中发现1例TRβ基因突变所致的甲状腺激素抵抗综合征家系。     

应用反向线性杂交技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

探讨反向线性杂交技术(reverse line blot assay,RLB)在结核分枝杆菌利福平(RFP)耐药性快速检测中的应用价值.采用RLB将包含rpoB基因核心区的扩增产物与标记特异性探针的膜进行杂交,共对121株结核分枝杆菌进行RFP耐药性检测,并将结果与常规药敏实验进行比较.结果发现,121株中有71株对RFP耐药,56株为多重耐药株;采用RLB共检测到65株RFP耐药株rpoB基因核心区存在突变,其灵敏度为91.5%(65/71);50株RFP敏感株中均未检测到突变,则特异性为100%(51/51);56株多耐药菌株中,92.9%(52/56)存在rpoB基因核心区突变.因此,用RLB检测结核分枝杆菌RFP耐药株具有快速,高效,特异性和灵敏度高的优点,且可用于多耐药菌株的筛选,具有推广和潜在的临床应用价值.     

一个单纯家族性嗜铬细胞瘤家系的VHL基因突变筛查

目的检测一个单纯家族性嗜铬细胞瘤家系的VHL基因突变情况。方法对一个单纯家族性嗜铬细胞瘤家系进行VHL基因突变检测，抽取该家系5例患者及15名血缘亲属外周血基因组DNA，对VHL基因3个外显子进行PCR，产物进行DNA测序。结果该家系5例患者均检测出VHL基因第2外显子上第587位核苷酸A—C突变，该突变导致第125位编码氨基酸由组氨酸（H）转变为脯氨酸（P）。15名家系成员中筛查出7名成员为该突变基因携带者，B超检查发现1例为双侧肾上腺肿瘤，1例为右肾囊肿。该突变为首次报道。结论该嗜铬细胞瘤家系中检测到可能的致病突变，VHL基因检测可早期发现致病基因携带者，建议对单纯家族性嗜铬细胞瘤患者常规进行VHL基因突变筛查。     

临床分离耐喹诺酮类铜绿假单胞菌gyrA基因单点突变研究

目的 研究临床分离铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的分子机制，对PCR－RFLP－SSCP分析铜绿假单胞菌gyrA基因突变的可行性评价。方法 以铜绿假单胞菌gyrA基因序列为靶序列，用PCR、PCR－SSCP、PCR－RFLP、DNA测序、OMIGA软件分析等方法，对铜绿假单胞菌gyrA基因突变进行研究。结果 在铜绿假单胞菌10株耐药突变株中，有8株的gyrA基因的83位表现出高频的单点突变，其突变方式全为ACC→ATC。gyrA的PCR扩增产物Sac Ⅱ酶切片段与测序结果一致。SSCP带谱与测序结果比较，除1株（PSA2）其SSCP带谱与标准株相同，但测序结果有点突变外，其余菌株与测序结果一致。结论 临床分离的铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物分子机制主要表现为gyrA基因83位氨基酸密码子突变（Thr-83→Ile)，利用PCR－SSPC－RFLP系统，可快速、准确地检测耐喹诺酮类药物的铜绿假单胞菌gyrA中至少1个碱基的差异。     

α1,3半乳糖基转移酶基因721C>T突变导致B_w亚型

目的　研究红细胞ABO血型系统Bw亚型的分子基础。方法　通过标准血型血清学方法明确鉴定2个家庭3例Bw亚型,PCR扩增Bw 亚型ABO糖基转移酶基因的增强子、启动子和第1～7外显子及侧翼内含子序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序。同时将第6和7外显子克隆到pc DNA3.1(- )质粒,转化DH5α后进行序列分析。采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法证实测序所发现的突变。结果　直接测序发现3例Bw亚型的基因型为B/ O杂合,其中糖基转移酶基因的第2 6 1位G杂合缺失,第72 1位C/ T杂合。克隆证实一条染色体上为正常的O等位基因,另一条染色体上B等位基因(α1,3半乳糖基转移酶基因)存在第72 1位C>T突变,导致多肽链Arg2 4 1Trp替换。序列特异性引物-聚合酶链反应检测14 0份随机样本未发现此突变。结论　α1,3半乳糖基转移酶基因第7外显子72 1C>T突变可能是Bw亚型分子遗传基础之一。     

α1，3半乳糖基转移酶基因721C〉T突变导致Bw亚型

目的研究红细胞ABO血型系统Bw亚型的分子基础. 方法通过标准血型血清学方法明确鉴定2个家庭3例Bw亚型,PCR扩增Bw亚型ABO糖基转移酶基因的增强子、启动子和第1～7外显子及侧翼内含子序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序.同时将第6和7外显子克隆到pcDNA3.1(-)质粒,转化DH5α后进行序列分析.采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法证实测序所发现的突变.结果直接测序发现3例Bw亚型的基因型为B/O杂合,其中糖基转移酶基因的第261位G杂合缺失,第721位C/T杂合.克隆证实一条染色体上为正常的O等位基因,另一条染色体上B等位基因(α1,3半乳糖基转移酶基因)存在第721位C>T突变,导致多肽链Arg241Trp替换.序列特异性引物-聚合酶链反应检测140份随机样本未发现此突变. 结论α1,3半乳糖基转移酶基因第7外显子721C>T突变可能是Bw亚型分子遗传基础之一.     

p53基因第8外显子在喉癌中的缺失和点突变

目的 探讨抑癌基因p53第8外显子突变在喉鳞癌分子发病机理中所起的作用。方法 应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）银染技术和DNA直接测序法,检测喉鳞癌新鲜组织中抑癌基因p53基因第8外显子的突变情况。结果 60例喉鳞癌组织中,15例发生迁移率异常的SSCP区带。在SSCP阳性样本中随机抽出4例进行测序分析,发现两个标本在288位密码子缺失一个A,两个标本在292位密码子上缺失一个A。285、287密码子上共发生3次G→T的颠换,286密码子第3位碱基发生A→T的颠换。结论 喉鳞癌p53基因点突变与碱基缺失常常同时并存。p53基因第8外显子突变在喉癌的发生中可能起着重要作用。     

32例慢性乙型肝炎患者HBV P区的多位点耐药突变分析

目的 深入了解核苷（酸）类似物对乙型肝炎病毒基因组P区耐药性突变的影响,分析其对该区诱导耐药突变的作用.方法 对服用核苷（酸）类似物并且发生病毒学突破的患者,采用PCR产物直接测序法,进行HBV基因组P区耐药性基因测序分析.结果 发现P区可出现多点耐药突变,导致临床上发生交叉耐药和多重耐药.结论 应选用高耐药基因屏障的药物进行初始抗病毒治疗.对长期服用核苷（酸）类似物的患者,应定期监测HBV DNA,以便早期发现病毒学突破并及时干预.     

三种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变的酶切分析方法及其应用

目的：建立三种乙型肝炎（乙肝）病毒拉米夫定耐药突变的酶切分析方法，了解这三种耐药突变在拉米夫定治疗患者中的发生情况。方法：设计3对HBV P基因引物进行聚合酶链反应（PCR）扩增，应用Nde I和Nla Ⅲ两种限制性内切酶对PCR产物进行酶切，酶切产物用电泳加以分析。应用此方法检测70例拉米夫定治疗的慢性乙肝患者中3种拉米夫定耐药突变的发生情况。结果：Nde I和NlaⅢ两种限制性内切酶对PCR产物进行酶切可有效区分HBV野株和YMDD（酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）变异株，并确定是YI（异亮氨酸）DD或YV（缬氨酸）DD变异。用Nla Ⅲ内切酶对PCR扩增产物酶切可有效区分HBV野株和L526M（第526位氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸）变异株。利用此方法发现11例患者在服用拉米夫定过程中出现耐药突变，其中YIDD变异6种，YVDD变异5例，后者有1例伴有L526M点突变。结论：本方法只需应用常规PCR和酶切技术，既可有效筛检出YMDD变异株标本，还可以确定属于YIDD还是YVDD变异，或是否伴有L526M点突变等，均可作为临床监测拉米夫定耐药性的参考。     

一例ABO血型cisAB06亚型的基因序列分析

目的 探讨1例ABO亚型cisAB06的血清学和分子遗传特征.方法 应用单克隆抗体检测1例ABO正反定型不符的患者红细胞ABO抗原,标准A、B、O红细胞检测血清中ABO抗体.用序列特异性引物-聚合酶链反应进行ABO基因分型.用PCR技术特异性扩增A、B基因第6～7外显子,PCR产物纯化后直接测序分析.结果 患者红细胞有A、B抗原,同时血清中存在抗A抗体.聚合酶链反应-序列特异性引物基因分型结果为B/O02型,直接测序结果为cisAB06型,与B101基因序列比对仅在第526位发生G＞C的突变(c.526G＞C),该位点的突变导致176位甘氨酸变成精氨酸(p.R176G).结论 B等位基因c.526G＞C突变形成cisAB06等位基因,其血清学表现为AB型.     

Apert综合征患儿FGFR2基因突变分析

目的研究Apert综合征患儿成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）基因突变以及临床特点。方法采集1例Apert综合征患儿及其父母的外周血,提取基因组DNA,应用PCR扩增FGFR2基因第7和第9外显子,对PCR产物进行双向测序检测基因突变。检索PubMed和中国知网数据库中相关文献进行系统分析。结果在患）LFGFR2基因的第7外显子的937碱基发生杂合突变,由c转变为G,导致FGFR2蛋白第253位密码子由脯氨酸变为精氨酸（P253w）,患儿父母均未检测到该基因突变。文献检索国内外已报道15例Apert综合征患儿,其中6例进行FGFR2基因突变分析,5例为S252W突变,1例为外显子Ⅲb／Ⅲc之间杂合缺失突变。结论该例hpert综合征患儿由FGFR2基因937C-G的杂合突变所致。     

应用蝎形探针扩增阻滞突变系统检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变与病理改变的关系

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤组织中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的检出率,比较蝎形探针扩增阻滞突变系统(scorpions amplifieation refractory mutation system,以下简称Scorpions ARMS)即时荧光PCR和直接测序检测EGFR基因突变的敏感性.方法 应用显微切割术、Scorpions ARMS及直接测序检测82例NSCLC石蜡包埋肿瘤组织以及癌旁正常肺组织中EGFR基因的第18、19、20和2l外显子的突变.结果 Scorpions ARMS检测82例NSCLC中42例的瘤组织中存在EGFR突变,突变检出率为51.2%,其中20例为EGFR第19外显子框架内多核苷酸的缺失,18例为EGFR第21外显子L858R点突变,1例为EGFR第21外显子L861Q点突变,2例为EGFR第20外显子插入突变,另外1例为EGFR第20外显子$7681点突变.而PCR反应后行直接测序,82例标本中仅58例得到可分析的测序结果,其中25例瘤组织中出现EGFR突变,因此82例的突变检出率为30.5%,25例中13例为EGFR第19外显子框架内多核苷酸的缺失,10例为EGFR第21外显子L858R点突变,1例为EGFR第21外显子L861Q点突变,另外1例为EGFR第20外显子$768I点突变.直接测序检测出25例突变模式与Scorpions ARMS检测结果一致.结果 显示Scorpions ARMS具有很高的敏感度,部分直接测序阴性的病例经Scorpions ARMS检测出EGFR突变.结论 EGFR基因的点突变或缺失在中国NSCLC的患者中的检出率明显高于其他国家,以女性、腺癌和细支气管肺泡以及不吸烟患者突变率较高.Scorpions ARMS技术能快速、敏感、准确检测EGFR突变,能为临床冶疗及预后提供重要信息.