神经干细胞诱导分化神经元培养方法的建立

目的:诱导大鼠神经干细胞(NSCs)向神经元细胞系分化,建立体外培养神经元的模型。方法:从Wistar大鼠胚胎大脑分离、培养NSCs,小剂量碱性成纤维生长因子(bFGF)无血清条件培养基诱导NSCs定向分化,以免疫组化技术检测,与直接培养的海马细胞中NF200阳性细胞数以及神经元生长情况进行比较。结果:应用小剂量bFGF无血清培养基诱导NSCs定向分化7、10d,神经元生长良好,通过免疫组化检测到NF200阳性神经元数量多于直接培养的海马神经元(P<0.01)。结论:应用小剂量bFGF无血清条件培养基对NSCs进行定向诱导分化,培养的神经元生长良好,可作为体外神经元培养模型之一。     

hBDNF-GFP基因转染神经干细胞后hBDNF的表达及生物学特性研究

目的 探讨慢病毒载体介导入脑源性神经营养因子(hBDNF)和绿色荧光蛋白(GFP)基因转染大鼠神经干细胞(NSCs)后hBDNF的表达及其生物学特性的变化.方法 构建hBDNF和GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs(hBDNF-GFP-NSCs组),同时设GFP转染NSCs组(GFP-NSCs组)和未转染的NSCs组(NSCs组).应用RT-PCR和Western blot法分别检测3组细胞中hBDNFmRNA和蛋白的表达:ELISA检测hBDNF-GFP-NSCs组细胞转染前后培养液中hBDNF含量的变化:使用上述3组细胞的上清液培养背根神经节(DRG)与NSCs,观察DRG的生长情况并应用流式细胞法检测NSCs分化为神经元的比例.结果 RT-PCR、Western blot结果显示转染后7 d hBDNF-GFP-NSCs组hBDNF mRNA和蛋白的表达均明显强于GFp-NSCs组和NSCs组;EUSA检测显示hBDNF-GFP转染NSCs后上清中hBDNF含量增加,第5天分泌达最高峰,与转染前比较差异均有统计学意义(P<0.05);使用hBDNF-GFP-NSCs组上清液培养DRG和NSCs,4 d后DRG很快伸出突起,流式细胞法检测显示NSCs分化为神经元的比例高于其他两组.结论 NSCs可作为基因转染载体,被hBDNF-GFP基因重组慢病毒转染后仍可保持原有生物学特性,并稳定表达和分泌有生物学活性的hBDNF和GFP.     

Caspase-3在H2O2诱导神经细胞凋亡中的作用

目的研究caspase-3在H2O2诱发神经细胞凋亡中的作用,以探讨氧化应激损伤诱导神经细胞凋亡的机制。方法用海马神经细胞原代培养技术,采用1mmol/L H2O2诱导建立细胞氧化损伤模型,并观察细胞形态学变化,采用TUNEL法检测H2O2诱导大鼠海马神经元凋亡率;采用RT-PCR法检测caspase-3 mRNA的表达。结果形态学观察结果显示模型组比海马组细胞损伤程度较严重;与对照组比较,模型组细胞凋亡率及caspase-3 mRNA的表达显著增高（P〈0.01）。结论本结果提示,caspase-3可能参与了氧化应激损伤诱导的神经细胞凋亡过程。     

GFP-Nurr1基因修饰神经干细胞的建立及过表达Nurr1对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响

目的利用慢病毒载体建立GFP-Nurr1基因修饰的原代神经干细胞(NSCs)模型并观察Nurr1过表达后NSCs向多巴胺神经元的分化影响。方法利用基因重组构建pLenO-DCE-Nurr1慢病毒载体,用慢病毒转染第三代NSCs,转染72 h后荧光检测转染效果;设置空白对照组、空载体组及DCE-Nurr1组,分别用Western blot及PCR检测Nurr1的表达差异;并将转染后的NSCs分化培养7 d后分别用免疫细胞化学检测、Western blot及PCR检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果慢病毒转染NSCs 72 h后,转染率可达90%,与对照组相比DCE-Nurr1组高表达Nurr1。经慢病毒载体感染后的NSCs仍具备分化潜能,分化培养后发现DCE-Nurr1组分化的神经细胞中TH阳性细胞分化率90.60%,对照组为21.2%。结论慢病毒载体可高效转染NSCs过表达Nurr1;Nurr1基因过表达可以促进中脑腹侧来源NSCs向TH阳性多巴胺能神经元方向分化。     

重组Bcl-2腺病毒对损伤运动神经元的保护作用

目的:观察携带Bcl-2基因的重组腺病毒(Ad/s-Bcl-2)对损伤运动神经元的保护作用.方法:采用培养脊髓运动神经元的谷氨酸损伤模型,评价重组Bcl-2腺病毒对损伤运动神经元的影响.指标是Bcl-2原位杂交和Bcl-2免疫组化染色、TUNEL阳性神经元计数、运动神经元[Ga2+]i的检测以及台盼蓝拒染法检测培养神经元存活.结果:①Ad/s-Bcl-2可转染原代培养的脊髓运动神经元并使其过表达Bcl-2.②过表达Bcl-2可延长培养神经元的生存时间.③过表达Bcl-2可显著减少谷氨酸诱导的原代培养脊髓运动神经元的凋亡,并显著降低谷氨酸诱导的神经元[ca2+]i的增高.结论:腺病毒中介Bcl-2基因过表达对神经毒性损伤的运动神经元具有保护作用.     

神经干细胞和嗅鞘细胞联合移植与神经干细胞移植治疗实验性脑出血的比较

目的对比神经干细胞(NSCs)和嗅鞘细胞(OECs)联合移植与NSCs移植治疗大鼠脑出血的疗效。方法制作大鼠脑出血模型,记录细胞移植后对照组和移植组(NSCs组、NSCsOECs组)大鼠运动功能,采用免疫组化观察移植细胞在体内存活、分化和迁徙的情况。结果NSCsOECs组和NSCs组移植NSCs分别有14.19%和2.96%分化为神经元,差异有统计学意义(χ2=154.79,P<0.01),30d时神经功能缺损评分NSCs组为1.60±0.13,NSCsOECs组为1.01±0.11,差异有统计学意义(P<0.05),OECs移植后能存活、迁徙,NSCs移植后能存活、分化为神经元、星形和少突胶质细胞,并向损伤区迁徙。结论OECsNSCs移植改善脑出血大鼠运动功能的疗效优于单纯NSCs移植。     

海人酸致癫癎持续状态大鼠海马神经元线粒体损伤及caspase-3表达

目的观察海人酸诱导的癫痫间持续状态(status ep ilepticus,SE)大鼠海马CA3区神经元线粒体损伤及caspase-3的表达。方法用海人酸诱导大鼠SE 2 h;于SE终止后第3、6、24 h取海马,光镜观察神经元的变化,并用电镜进一步观察线粒体的超微结构;免疫组化方法检测caspase-3的表达。结果SE终止后3h电镜下可见到线粒体嵴的肿胀和膜的崩解;SE后24 h神经元呈坏死样改变;caspase-3的表达在SE后6 h开始增加(与对照组比较,P<0.05),于第24 h明显增高(P<0.01)。结论在实验性SE模型中早期即出现线粒体超微结构的损伤,其后出现caspase-3的表达增高及神经元形态的改变,提示线粒体的损伤是SE后神经元损伤的关键环节。     

缺氧对乳鼠脊髓神经元低氧诱导因子-1α的影响

目的研究缺氧对脊髓神经元低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达和凋亡的变化,探讨HIF-1α在耐受缺氧和诱导凋亡机制中的作用。方法以体外培养的乳鼠脊髓神经元细胞为研究对象。采用激光共聚焦显微镜(LCSM)、DNA琼脂糖凝胶电泳观察缺氧诱导脊髓神经元凋亡的变化;免疫组化检测HIF-1α在缺氧脊髓神经元中的表达;流式细胞术(FCM)检测缺氧对脊髓神经元p53、Bcl-2蛋白水平表达的影响。结果持续缺氧显著抑制脊髓神经元细胞的生长;荧光显微镜下可见脊髓神经元细胞呈典型凋亡的形态学改变。脊髓神经元缺氧2、4 h时HIF-1α、P53、Bcl-2表达上调(P<0.01),8 h时其表达下调(P<0.05)。结论缺氧预处理诱导的HIF-1α的表达,在脊髓神经元的耐受缺氧和诱导凋亡机制中起着重要的作用。     

刺五加多糖对H2O2诱导的大鼠海马神经元凋亡的保护作用

目的研究刺五加多糖（ASPS）对H2O2诱导的海马神经元凋亡的影响及其机制。方法采用H2O2诱导大鼠海马神经元凋亡。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记法检测细胞凋亡率、免疫组化法检测caspase-3蛋白的表达、逆转录PCR法检测caspase-3 mRNA的表达。结果H2O2作用后,海马神经元凋亡率、caspase-3蛋白和mRNA表达水平均显著增高（P〈0.05）;给予ASPS干预后,均显著下降（P〈0.05）;而且,随ASPS剂量增加,作用效果显著增强（P〈0.05）。结论ASPS具有抑制氧化应激损伤诱导神经细胞凋亡作用,其机制与下调caspase-3 mRNA的表达有关。     

神经干细胞转染酪氨酸羟化酶基因后的分化

目的 探讨神经干细胞（NSCs）转梁酪氨酸羟化酶（TH）基因后的分化。方法 从胚胎16天Wistar大鼠室管膜前下周围区分离、增殖、鉴定NSCs；将TH基因和缺陷性逆转录病毒载体N2A构建成真核表达质粒，以电穿孔将其转入PA317包装细胞内；收集PA317包装产生的逆转录病毒颗粒，感染体外培养的NSCs，经G418筛选，获得成功转染TH基因的NSCs克隆；分别以0.4ng/ml bFGF和5％胎牛血清诱导转染及未转染TH基因的NSCs分化，比较TH基因转染及不同诱导方式对NSCs分化的影响，同时在分化细胞内检测TH的表达。结果 以0.4ng/ml bFGF诱导可使95％以上的NSCs分化为神经元，而5％FBS诱导则大多分化为神经胶质细胞，无论是否转染TH基因，神经元及神经胶质细胞的分化比例不成生改变；TH基因转染后能在神经干细胞的子代细胞内高效、稳定表达。结论 TH基因转染不影响NSCs的分化潜能，TH能在神经干细胞的子代细胞中有效表达0.4ng/ml bFGF诱导可以促使NSCs分化为神经元。     

心肌营养素-1基因与神经干细胞移植治疗脑创伤的实验研究

目的：观察重组腺病毒介导的心肌营养素-1（Adv—CT1）及CT-1基因转染的神经干细胞（NSC—CT1）对创伤性脑损伤（TBI）大鼠模型脑功能障碍的作用。方法：以Adv—CT1转染NSCs;Adv—CT1以及NSC—CT1移植于大鼠TBI模型,应用水迷宫实验和穿梭箱实验观察TBI迷宫潜伏期、主动回避次数和回避失败次数等记忆功能指标的变化。结果：大鼠TBI后5-14d的迷宫潜伏期减少、主动回避次数增加和回避失败次数减少;相比Adv—CT1治疗组,NSC—CT1移植治疗后大鼠的迷宫潜伏期减少、主动回避次数增加和失败次数减少。结论：TBI后5—14d创伤大鼠迷宫潜伏期延长、主动回避次数减少和回避失败次数增加,表明TBI后大鼠学习记忆功能障碍;Adv—CT1或NSC—CT1移植治疗TBI大鼠,大鼠迷宫潜伏期减少、主动回避次数增加和回避失败次数减少,表明移植治疗可改善大鼠学习记忆功能;NSC—CT1移植治疗后大鼠学习记忆功能恢复较Adv—CT1转染治疗组好,表明CT-1修饰的NSCs移植治疗TBI记忆功能障碍疗效优于Adv-CT1转染治疗。     

Protective effects of adenoviral cardiotrophin-1 gene transfer on rubrospinal neurons after spinal cord injury in adult rats

Cardiotrophin-1 (CT-1), a muscle-derived cytokine, supports the survival of motoneurons in vivo and in vitro. The present study investigated whether adenoviral huCT-1 gene transfer protected injured neurons from cell death or atrophy and promoted regeneration of rubrospinal tract (RST) after spinal cord injury in adult rats. Administration of the adenoviral CT-1 vector (Adv-CT1) to C3-4 lateral funiculus hemisection cavity, that completely interrupted RST, led to sustained CT-1 expression. Providing Adv-CT1, which rescued 20% of neurons, could prevent the loss of injured rubrospinal neurons 8 weeks post-injury. Retrograde tracing with FluoroGold showed that 1.2% of RST neurons regenerated at least two segments caudal to the injury site. Anterograde tracing with biotinylated dextran amine revealed that the RST axons terminated in white matter and gray matter. Behavioral testing revealed a significant functional recovery in limb usage. This observation indicated that adenoviral CT-1 gene transfer into the injured cord promoted survival and regeneration of rubrospinal neurons in adult rats.     

心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的作用**

背景：心肌营养素1属于白细胞介素6细胞因子家族,近年发现其可能对中枢神经系统有重要保护作用。 目的：探索重组腺病毒心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的保护作用,为脑损伤提供新的治疗措施。 方法：取新生Wistar大鼠海马神经干细胞,第2代培养第5天用于实验,神经干细胞分为3组：谷氨酸组、重组腺病毒心肌营养素1组及对照组,利用四唑蓝比色了解细胞存活情况及原位缺口末端标记技术检测细胞凋亡。 结果与结论：谷氨酸组神经干细胞呈现明显形态改变,重组腺病毒心肌营养素1组未见类似改变,在谷氨酸暴露后12,24,48及72 h MTT吸光度值均低于心肌营养素1组,而细胞凋亡率均高于心肌营养素1组。与其他两组比较,对照组相同时间点A值增高,细胞凋亡率降低。提示,心肌营养素1对谷氨酸损伤的神经干细胞具有保护作用,可以抑制神经干细胞凋亡,促进其存活和增殖。     

胎鼠神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响

目的研究胎鼠神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响。方法 40只SD大鼠随机分为正常对照组(Normal组),脊髓损伤组(SCI组),神经干细胞组(NSC组),神经干细胞标记组(BrdU+NSCs组)。采用电控脊髓损伤打击装置制作模型,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Br-dU)法标记处于对数生长期的NSCs,SCI后即刻进行NSCs移植。免疫组化法观察BrdU标记NSCs的存活、迁移及凋亡抑制基因Bcl-2的表达,TUNEL法标记凋亡细胞(免疫组化及免疫荧光显色),改良Rivlin法观察大鼠后肢运动功能的恢复情况。结果 BrdU+NSCs组在损伤脊髓区域可检测到BrdU标记的阳性NSCs。BrdU+NSC组与NSC组各时间点凋亡阳性细胞数均比SCI组减少(P<0.01),Bcl-2免疫阳性细胞光密度值比SCI组明显增加(P<0.01),且Bcl-2表达高峰延长至伤后7d;移植后7d、14d、28d后肢运动功能评分较SCI组明显升高(P<0.01)。Br-dU+NSC组与NSC组之间比较无明显差异(P>0.05)。结论体外培养的胚胎大鼠NSCs可在脊髓损伤区域存活、迁移,并能通过上调Bcl-2的表达来抑制大鼠脊髓损伤后神经细胞的凋亡,从而促进大鼠瘫痪肢体功能的恢复。     

远志总皂苷对海马神经干细胞定向分化的作用及对Mash1表达的影响

目的 观察远志总皂苷(TEN)对体外培养海马神经干细胞向胆碱能神经元定向分化的作用,并进一步分析其对神经干细胞Mashl表达的影响. 方法 分离新生24h内昆明小鼠海马,悬浮培养神经干细胞,取第3代神经干细胞进行分化诱导.实验分4组:空白对照组、5mg/LTEN组、20mg/LTEN组、100mg/LTEN组.应用免疫组织化学法检测神经干细胞中神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胆碱乙酰转移酶(ChAT)阳性细胞比率;采用RT-PCR半定量法检测各组神经干细胞Mashl的表达.结果 免疫组化结果显示:与对照组比较,TEN组神经干细胞向神经元及胆碱能神经元分化的比率明显升高,以20 mg/L剂量最明显,差异均有统计学意义(P<0.05);20 mg/L组Mashl的表达(0.9426±0.07286)亦明显高于对照组(0.7141±0.04016),差异具有统计学意义(P<0.05). 结论 TEN能够促进体外培养的海马神经干细胞向神经元及胆碱能神经元定向分化,能够促进神经干细胞中Mashl的表达.     

嗅鞘细胞对原代培养神经干细胞增殖、分化的影响

目的 观察嗅鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)增殖、分化的影响.方法 新生大鼠脑OECs和NSCs原代培养,采用免疫荧光及免疫细胞化学方法鉴定相关细胞.取原代OECs分为2组,实验组去除培养孔的间隔,使OECs和NSCs共用一培养液体系;对照组不破坏培养孔的间隔,单独培养NSCs,其余同实验组.观察2组细胞增殖、分化情况.结果 原代培养的OECs表达神经生长因子受体(P75NGFR);原代培养的神经球表达巢蛋白(nestin),神经球分化的细胞表达神经丝200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).增殖实验中,实验组NSCs数量较对照组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05).诱导分化实验中,实验组4d、7d时NF200阳性细胞率较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),说明2种细胞共液培养时,OECs提高了NSCs向NF200阳性细胞分化率.结论 OECs可促进NSCs增殖,并提高了NSCs向神经元分化的效率.     

Xbp-1基因重组神经干细胞移植对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤的影响

背景：将转染Xbp-1基因的神经干细胞移植至脑损伤病变部位,不但确保了Xbp-1基因的稳定及持续表达发挥抗凋亡的作用,也可促进移植后神经干细胞的存活与分化能力。 目的：验证Xbp-1基因对移植大鼠脑缺血损伤处神经干细胞的分布、分化、抗凋亡作用及神经功能恢复的影响。 方法：选取成年SD大鼠采用线栓法建立大脑中动脉阻塞模型,并随机分成4组干预：对照组(不作处理)、PBS移植组、神经干细胞移植组、Xbp-1-神经干细胞移植组。于干预后7,14,28 d进行NSS评分,并取脑制备组织切片,免疫荧光染色观察神经干细胞在脑内的存活与分布情况。移植后第28天使用TUNEL染色检测缺血区域神经细胞凋亡情况,Western blot检测Bcl-2表达水平。 结果与结论：移植后7,14,28d Xbp-1-神经干细胞移植组NSS评分显著低于其他3组(P < 0.05);神经干细胞可以成功迁徙到脑缺血区域并成活、分化为成熟神经细胞,Xbp-1基因修饰后的神经干细胞成活、增殖以及分化能力均强于普通神经干细胞(P < 0.05);与其他3组比较,Xbp-1-神经干细胞移植组脑缺血区域神经细胞凋亡数量明显减少,Bcl-2水平升高 (P < 0.05)。证实了Xbp-1基因修饰可以增加神经干细胞存活、迁徙能力,并通过抗内质网应激显著降低移植后大鼠缺血模型的NSS评分,促进其神经功能恢复。