胞内游离钙浓度测定平台的建立

目的：建立一种简单有效的细胞内游离钙浓度测定平台。方法：用Fura-2作为荧光指示剂标记细胞内Ca2＋,在倒置荧光显微镜下交替检测340nm和380nm激发的荧光强度,计算F340/F380代表的Ca2＋相对浓度,再校正为标准浓度。结果：给予细胞刺激（如10mM咖啡因）,F340/F380迅速增高,表明细胞内游离钙浓度迅速升高。对于快速变化的胞内Ca2＋信号,系统反应灵敏、迅速,能很好地捕捉相关钙浓度变化。结论：由此建立起了一种简单有效的细胞内游离钙浓度测定平台,并应用于实际工作。这一平台在平滑肌细胞及心肌细胞游离钙浓度测定中都得到了充分的应用,平台建设中的第一手资料具有重要参考价值。     

钙通道开放和肾上腺素受体兴奋对La3+跨豚鼠心肌细胞膜行为的影响

目的:研究钙通道开放和肾上腺素受体兴奋对稀土La3+跨豚鼠心肌细胞膜行为的影响.方法:使用Fura-2荧光探针方法,测量340 nm/380 nm的荧光强度比的变化,检测La3+的跨膜行为.结果:豚鼠心肌细胞在细胞外La3+浓度为0.01～0.1 mmol/L时,使用钙通道激动剂Bay K8644、高钾KCl(35 m...     

二氧化碳结合力试剂盒在全自动生化分析仪上的应用

<正> 二氧化碳结合力试剂盒大多采用380nm波长进行测定。贝克曼717型全自动生化分析仪没有380nm波长。在340nm波长下,试剂空白超过了仪器的显示范围,所以不能进行测定。我们尝试用二氧化碳试剂作为试剂1,用生理盐水作为试剂2进行稀释的方法,结果良好。 1.材料与方法 1·1 试剂 试剂1 上海长征公司生产的二氧化碳试剂盒,应用时按说明书加蒸馏水进行溶解。试剂2     

稀释试剂法在酶法测定血清TCO_2中的应用

在临床工作中,我们发现:酶法测定血清总二氧化碳(TCO2)所得结果都很低,经查找原因为酶法测定血清TCO2所用波长为380 nm,而我们所用自动生化分析仪的波长只有340 nm而无380 nm,自动生化分析仪显示酶法二氧化碳试剂空白吸光度为3.000左右,超出了系生化分析仪对波长的监测范围(0.2A).     

HPLC测定枸橼酸莫沙必利胶囊中的有关物质

目的 建立反相高效液相色谱法测定枸橼酸莫沙必利胶囊中有关物质的总量。方法 分析柱采用 Shimadzu C18 (150 mm×4. 6 mm, 5 μm),流动相为0.02 mol·L^-1磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调pH至4.0)-甲醇(50∶50),流速为1 mL·min^-1,检测波长为274 nm。结果 该法能将枸橼酸莫沙必利与其有关物质有效分离。供试溶液的浓度确定为500 mg·mL^-1,室温下稳定,有关物质的峰面积重复性良好。莫沙必利浓度在3.0~15.0 mg·mL^-1与峰面积线性关系良好(r=0. 999 7,n=6),精密度RSD<1.5%,回收率为100.5%~101.4%。而且,该法能用作稳定性试验的分析方法。结论 该法简单、快速、灵敏,适合用于枸橼酸莫沙必利胶囊中有关物质的检查。     

荧光比率法测量平滑肌细胞内的钙动力学变化

目的建立一种荧光比率方法来测量细胞内钙离子的动力学变化,并研究血管平滑肌细胞钙动力学变化在重症休克血管反应性降低中的作用.方法复制SD大鼠失血性休克模型,分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC),使用荧光探针Fluo-3/AM、FuraRed双标记比率方法结合激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞钙动力学变化;评估荧光比率法在动态测定胞内钙离子浓度变化中的应用及其观察ATP敏感钾通道(KATP)特异性阻滞剂优降糖对血管反应性和钙动力学影响.结果休克后2 h(失代偿期),血管反应性明显降低,NE作用带来的平滑肌细胞内钙离子浓度升高的程度明显减弱;加入优降糖可明显提高NE对平滑肌细胞内钙离子的升高作用,改善细动脉对NE的反应性,带来血管反应性部分恢复.在37℃,Fluo-3/AM、FuraRed浓度为5μnol/L的条件下,肠系膜细动脉平滑肌细胞负载40 min左右即可获得良好的标记效果.结论优降糖特异性的阻滞ATP敏感钾通道的开放,增多细胞外钙内流并提高血管反应性;使用荧光比率法可以使胞内钙离子浓度的测量不受荧光探针浓度、细胞大小、激光漂白等因素的影响,可以准确、实时、动态测量细胞内钙离子浓度变化.     

改良RP-HPLC测定全血中环孢素A的浓度

目的 建立一种简便的RP-HPLC法测定全血中环孢素A(CsA)的浓度,为临床合理应用CsA提供依据。方法 全血样品1 mL经乙醚提取,正己烷洗涤去干扰后,采用Zorbax SB-C₁₈ 柱 (4.6 mm×150 mm,3.5 μm) 分离,流动相为乙腈-甲醇-水-异丙醇(60∶10∶29∶1),流速1.5 mL·min^-1,柱温70 ℃,检测波长210 nm;环孢素D(CsD)为内标。结果 CsA全血浓度在25~1 600 ng·mL^-1内线性关系良好(r=0.999 8),平均方法回收率99.51%,日内、日间RSD均小于5%,最低检测限5 ng·mL^-1。结论 本法简便快速,灵敏度高,重复性好,线性范围广。用于患者全血中CsA浓度监测,效果良好。     

瞬时感受器电位香草酸受体1在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞内钙升高中的作用

目的观察记录低氧条件培养的人肺动脉平滑肌细胞中瞬时感受器电位香草酸受体1(transient potential vanilloid receptor1,TRPV1)对细胞内Ca2+浓度(用340nm/380nm的荧光强度比值表示)的影响,探讨TRPV1在低氧性肺动脉平滑肌细胞增生中的作用。方法应用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色、流式细胞周期测定以及细胞内Ca2+浓度测定的方法检测细胞增生及细胞内Ca2+浓度变化。结果低氧能明显促进人肺动脉平滑肌细胞的增生,升高人肺动脉平滑肌细胞内静息Ca2+浓度,显著加强环并偶氮酸(cyclopiazonic acid,CPA)诱发的库容性Ca2+内流(capacitative Ca2+entry,CCE),上述效应均可被TRPV1阻断剂Capsazepine(CPZ)所抑制。结论在人肺动脉平滑肌细胞中,TRPV1可能是低氧所致细胞内Ca2+浓度增加、CCE增强和细胞过度增生的重要途径或调制因素。     

胰腺细胞缩胆囊素和胆碱能受体对细胞内Ca~2 的调节

本文使用Fura-2做为细胞内钙离子荧光指示剂,在大白鼠胰腺分离细胞观察缩胆囊素和乙酰胆碱对细胞内钙离子的影响及其相互作用.结果表明1nmol/L缩胆囊素和lmmol/L乙酰胆碱分别使细胞内钙离子浓度从基础水平的122±8nmol/L增高至360±32nmol/L和380±20nmol/L,半最大有效浓度分别为0.45nmol/L及54μmol/L。不同剂量的缩胆囊素和乙酰胆碱彼此不同程度抑制对方的作用,后加入的试剂提高细胞内钙离子浓度的幅度与先加入的试剂所引起的增加幅度成反比,加入各自相应的受体拮抗剂可使细胞恢复对另一激素(蛙皮素)刺激的反应。说明了缩胆囊素受体和胆碱能受体的相互调节影响细胞内钙离子的活动.加入受体拮抗剂后,细胞恢复反应过程中的时间动力学改变可能与受体阻滞后钙离子通道关闭的程度和时间有关.     

荧光定量法测量平滑肌细胞内钙离子浓度的探讨

目的 研究平滑肌细胞内Ca^2 浓度的动力学变化，建立一种定量测量细胞内Ca^2 浓度的方法。方法 分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)细胞，用荧光探针Indo-1和激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞Ca^2 浓度的动力学变化；首先在37℃环境下标定Ca^2 探针indo-1的解离常数Kd值，根据荧光-浓度换算公式将测量的荧光强度值换算成Ca^2 浓度值。结果 激光扫描共聚焦显微成像技术测量的细胞荧光图像分析显示．平滑肌细胞[Ca^2 ]i在地塞米松的刺激下显著上升，有时会出现自发钙波的现象，并且细胞内出现钙超载的现象(细胞荧光图像呈现白色)。通过测量得到的Kd值结合荧光强度-浓度换算公式可准确地测量细胞内[Ca^2 ]i。结论 荧光定量法结合共聚焦显微成像技术可以简易、快捷地监测细胞内钙离子的动力学变化，不失为一种定量测量细胞内钙离子的方法。     

CoCl_2对原代培养的猪肺动脉内皮细胞钙离子的影响

目的探讨氯化钴(CoCl2)对原代培养的猪肺动脉内皮细胞钙离子浓度的影响。方法原代培养猪肺动脉内皮细胞,分别用不同浓度的CoCl2刺激2min,用双波长荧光分光光度计观察细胞质内钙离子浓度的变化;另外,用1mmol/L的CoCl2刺激细胞不同时间,观察细胞质内钙离子浓度的变化。结果不同浓度的CoCl2对猪肺动脉内皮细胞内钙离子浓度无显著影响;1mmol/L的CoCl2刺激细胞不同时间也对细胞内钙离子浓度无显著影响。结论与物理缺氧方法不同,化学缺氧试剂CoCl2对原代培养的猪肺动脉内皮细胞的钙离子浓度没有明显影响,表明猪肺动脉内皮细胞对CoCl2的刺激有一定的耐受性。     

HPLC检测人血浆中厄贝沙坦的浓度

目的 建立人血浆厄贝沙坦检测的高效液相色谱法。方法 血浆经乙醚萃取,以ZORBAX Extend-C₁₈为色谱柱;流动相为乙腈-水-0.1％TFA-0.5 mmol·L^-1 SDS体系,流速为0.8 mL·min^-1;检测波长为242 nm(0~6.5 min)和266 nm(6.5~7.8 min)。结果 厄贝沙坦浓度在0.05~6.00 mg·L^-1内线性关系良好(r=0.999 9);定量限为0.05 mg·L^-1;高中低3个浓度的相对回收率分别为(103.93±1.09)%、(99.85±0.65)%和(100.95±1.21)%;日内RSD分别为3.04％,1.15％,1.19%,日间RSD分别为4.50%,3.32%,1.18%。结论 本方法准确可靠、简便快速,适用于人血浆厄贝沙坦浓度的测定及其药动学研究。     

血管紧张素Ⅱ对大鼠肾入球小动脉细胞内钙离子浓度的影响及Losartan的拮抗作用

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对肾小球入球小动脉细胞内钙离子浓度([Ca²⁺]i)的影响与高血压肾小动脉重建的关系及Losartan的治疗作用。方法 细胞培养：大鼠肾小球入球小动脉细胞随机分为4组。对照组：不加AngⅡ处理；AngⅡ组：加入终浓度为0.1 μmol·L^-1的AngⅡ；Losartan组：加入终浓度为50 μmol·L^-1的Losartan；AngⅡ+Losartan组：同时加入Losartan 50 μmol·L^-1和AngⅡ0.1 μmol·L^-1。负载后上机检测[Ca²⁺]i。结果 细胞培养显示AngⅡ引起了细胞收缩变化，表现为胞突变细变短，胞突回缩，胞体变圆，细胞长度与直径均明显缩小。Losartan处理组较AngⅡ组细胞形态变化减轻且Losartan对AngⅡ增高RASMCs内[Ca²⁺]i有明显抑制作用。结论 AngⅡ可引起肾小球入球小动脉细胞内[Ca²⁺]i的上升，导致细胞收缩，因此Ca²⁺超载可能是肾素-血管紧张素系统起作用的重要环节。Losartan可抑制细胞内Ca²⁺超载。     

HPLC测定人血浆中霉酚酸及其代谢物浓度

目的 建立反相高效液相色谱法,同时测定人血浆中霉酚酸(mycophenolic acid, MPA)、酚化葡萄糖醛麦考酚酸(phenol glucuronide metabolite, MPAG)、酰基化MPAG(acyl-MPAG, AcMPAG)的浓度。方法 用蛋白沉淀法对样品进行处理。固定相为Zorbax Eclipse XDB C₁₈柱(4.6 mm×250 mm,5 mm),流动相：甲醇: 20 mmol×L^-1 NaH₂PO₄(用20%磷酸调至pH 3.0)为55∶45,流速：1.2 mL×min^-1,检测波长：304 nm,柱温：45 ℃。结果 MPA、MPAG、AcMPAG浓度在0.2~50 mg×mL^-1(r=0.999 7)、2.8~531 mg×mL^-1(r=0.999 9)、0.3~24 mg×mL^-1( r=0.999 4)内呈良好的线性关系。MPA及其代谢物的绝对回收率均大于80%,MPA、MPAG、AcMPAG的相对回收率分别为94.0%~101.4%,98.4%~101.9%和96.1%~104.2%。日内及日间RSD远低于15%。结论 采用反相高效液相色谱法测定人血浆中MPA、MPAG、AcMPAG的浓度和进行药物代谢动力学研究,方法灵敏度高、重复性强     

泽泻提取物HPCE指纹图谱研究

目的 建立中药泽泻提取物毛细管电泳指纹图谱。方法 采用毛细管区带电泳模式,压力进样：0.5Psi×10 s,分离电压30 kV,柱温25 ℃,DAD检测波长为202 nm,带宽8 nm,参比波长400 nm,带宽20 nm。运行缓冲液由0.1 mol·L^-1硼砂-0.1 mol·L^-1 SDS-甲醇(4∶6∶2)构成,检测结果用相似度评价软件分析其指纹图谱的相似度。结果 10批次泽泻提取物毛细管电泳指纹图谱的相似度均在0.9以上,表明其指纹图谱整体面貌基本一致。结论 所建立的泽泻提取物高效毛细管电泳指纹图谱稳定、可靠,可作为泽泻提取物的特征指纹图谱,该研究为泽泻提取物的定性鉴别及内在质量评价提供了新的参考依据。     

RP-HPLC法测定人血清中天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸含量

[目的]建立RP-HPLC法测定人体血清中天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸含量的方法.[方法]用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生;氨基酸的衍生物用Nova-Pak C18(3.9 mm×150 mm,4μm)分离;流动相A为30%甲醇、2%四氢呋喃、68%磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH 6.8),流动相B为100%甲醇,用二元线性梯度程序洗脱;荧光检测器检测,激发光波长280 nm,发射光波长340 nm.[结果]在(4～400)nmol/mL范围内,各组分线性关系良好,各氨基酸的平均回收率为90.0%～93.1%.[结论]本方法操作简便、准确,适用于人体血清中天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸浓度的测定.     

急性白血病患者外周血或骨髓中单个核细胞内钙离子浓度的测定

应用Fura-2测定急性白血病(急白)骨髓或外周血中单个核细胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]i)。肝素化血或骨髓液与RPMI1640混合后,滴入淋巴细胞分层液,离心。分离出的单个核细胞与Fura-2 AM,BSA,37℃温育40min。按激发波长350nm,发射波长500nm,测量其荧光强度F,Fmax,Fmin。用本法测定35例急白患者(51例次),结果表明[Ca~(2+)]i变化可作为一项反映化疗药物敏感性、预测化疗疗效的参考指标。     

硝酸盐还原酶一步法测定血清中硝酸盐浓度

为建立简便快速的一氧化氮(NO)间接测定方法,根据硝酸盐还原酶还原硝酸盐(NO3-)至亚硝酸盐(NO2-)的过程中,所消耗的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的量与NO-3浓度呈正比的原理,用340nm处NADPH吸光度的下降值,推算出NO-3的量.所建体系的反应时间为90min,NADPH浓度为6mmol/L,硝酸盐还原酶浓度为500U/L.NaNO3在0 u-mol/L～200umol/L范围内,与NADPH吸光度的变化量具有良好的线性关系,r=0.993.批内变异系数(CV)=4.4%,批间CV=10.5%;回收率为92.36%.20例25～55岁的正常人血清中NO-3浓度为52.42±19.76umol/L.用此法测定血清中NO3-浓度简便快速、特异性高、干扰因素少,不需昂贵仪器,适合实验室常规测量及临床推广使用.     

荧光定量法测量平滑肌细胞内钙离子浓度的探讨

目的 研究平滑肌细胞内Ca²⁺浓度的动力学变化,建立一种定量测量细胞内Ca²⁺浓度的方法。方法 分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)细胞,用荧光探针Indo-1和激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞Ca²⁺浓度的动力学变化;首先在37 ℃环境下标定Ca²⁺ 探针indo-1的解离常数Kd值,根据荧光-浓度换算公式将测量的荧光强度值换算成Ca²⁺ 浓度值。结果 激光扫描共聚焦显微成像技术测量的细胞荧光图像分析显示,平滑肌细胞[Ca²⁺]_i 在地塞米松的刺激下显著上升,有时会出现自发钙波的现象,并且细胞内出现钙超载的现象(细胞荧光图像呈现白色)。通过测量得到的Kd值结合荧光强度-浓度换算公式可准确地测量细胞内[Ca²⁺]_i。结论 荧光定量法结合共聚焦显微成像技术可以简易、快捷地监测细胞内钙离子的动力学变化,不失为一种定量测量细胞内钙离子的方法。     

辣椒素通过钙信号抑制感觉神经元的电压门控性钙离子通道

目的 研究辣椒素对大鼠背根神经节神经元的电压门控性钙离子通道的抑制效应及其信号机制.方法 在急性分离的大鼠背根神经节(DRG)神经元上,应用全细胞膜片钳技术记录电压激活性钙离子通道电流以及辣椒素诱导的电流,应用钙离子成像技术检测Ca2+浓度的变化.结果 辣椒素能够抑制大鼠DRG神经元的电压激活性钙离子通道电流.细胞外钾离子浓度显著升高引起细胞去极化并打开膜上电压门控性钙离子通道引起胞外Ca2+内流,辣椒素只在引起胞内Ca2+浓度显著升高的情况下才能抑制高钾诱导的电压门控性Ca2+内流.用咖啡因耗竭细胞内Ryanodine敏感性钙库以后,辣椒素引发的胞内钙浓度升高的效应被显著抑制,说明辣椒素可诱导胞内Ryanodine敏感性钙库释放Ca2+.结论 在辣椒素敏感性的大鼠DRG神经元中,辣椒索通过胞内钙信号抑制电压门控性钙离子通道.Ca2+信号部分来源于Ryanodine敏感性钙库.