雌激素受体α阴性乳腺癌雌激素受体α基因启动子区CpG岛甲基化和肼苯哒嗪去甲基化作用

目的 检测雌激素受体(ER)α阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞及ERα阴性乳腺癌组织中ERα基因启动子区CpG岛甲基化状态;探索肼苯哒嗪能否作为去甲基化药物恢复ERα基因表达。方法应用特异性聚合酶链反应(MSP)检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞和20例ERα阴性乳腺癌组织ERα基因3个启动子区A、B、CpG岛甲基化情况,肼苯哒嗪处理上述两种乳腺癌细胞,逆转录(RT)-PCR检测不同启动子调控下ERα基因异型体(isoform)ERα-A、ERα-B、ERα-C mRNA和ERα基因公共编码区mRNA表达。结果MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞启动子区ERα-A、ERα-B均存在CpG岛甲基化,ERα-C无甲基化,20例ERα阴性乳腺癌组织中,13例(65％)ERα-A、10例(50％)ERα-B CpG岛甲基化阳性。其中9例ERα-A、ERα-BCpG岛甲基化均阳性(45％),仅1例(5％)ERα-C存在CpG岛甲基化。肼苯哒嗪处理上述两种细胞后,检测到ERα-A、ERα-B mRNA和公共编码区mRNA表达。结论乳腺癌组织和细胞ERα基因表达沉默可能与ERα基因启动子区A、B甲基化有关,且肿瘤分期愈晚,甲基化程度愈高。肼苯哒嗪能作为去甲基化药物诱导ERα基因表达。     

银屑病患者皮损p16INK4a基因CpG甲基化位点和频度

目的研究皮损表皮p16INK4a甲基化阳性的银屑病患者基因启动子区CpG甲基化的位点和频度。方法采集50例银屑病患者皮损处皮肤,分离表皮,提取DNA。采用甲基化特异性PCR和测序法检测p16INK4a基因启动子区CpG甲基化的位点和频度。结果p16INK4a基因启动子甲基化阳性的患者,约50%CpG发生甲基化,均出现于特定位点。结论p16INK4a甲基化阳性银屑病患者p16INK4a基因启动子并非完全发生甲基化。     

乳腺癌发展过程中的bcl-2甲基化及其与蛋白表达的关系

目的建立bcl-2基因甲基化特异的PCR（MSP）检测方法,检测乳腺癌发展过程中的bcl-2甲基化．并探讨bcl-2甲基化与蛋白表达的关系。方法设计bcl-2基因MSP引物,采用MSP方法检测30例正常、25例不典型增生（癌前病变）、40例腋窝淋巴结阴性（癌症初期）和45例腋窝淋巴结阳性（癌症后期）乳腺组织的bcl-2基因5’端启动子CpG岛甲基化状态。另外采用免疫组织化学S-P法检测bcl-2的蛋白表达。结果正常、不典型增生、淋巴结阴性和淋巴结阳性乳腺组织的bcl-2甲基化率分别为10．0％、32．0％、40．0％和53．3％。乳腺癌发展过程中的bcl-2甲基化率渐增（P〈0．01）,bcl-2蛋白表达率渐减（P〈0．01）。不典型增生较正常乳腺组织的bcl-2甲基化水平显著提高（P〈0．05）。在乳腺癌发展过程中的4个阶段,bcl-2甲基化与蛋白表达两者之间均呈显著负相关性（P〈0．01）。结论该研究建立了bcl-2基因MSP检测方法,bcl-2基因MSP引物的设计是合理的。bcl-2启动子甲基化可能成为乳腺癌前病变的分子指标之一。在乳腺癌发展过程中,bcl-25’端调控区CpG岛甲基化可能是下调bcl-2表达的因素。     

FMR1基因启动子区CpG岛甲基化与智力低下的相关性研究

目的探讨智力低下基因1启动子区CpG岛甲基化与智力低下的相关性。方法应用甲基化PCR方法对79例智力低下儿童及79例正常儿童的外周血中FMRI基因启动子区CpG岛甲基化状态及（CGG）n进行检测。结果2例智力低下儿童的FMRI启动子区CpG岛发生甲基化,正常儿童基因CpG岛无甲基化;两组（CGG）n重复数分别为33—48、27—43,两者之间比较（P〉0．05）无统计学意义。结论FMRl基因启动子区CpG岛甲基化可能引起智力低下。     

肼苯哒嗪对宫颈癌细胞系APC基因异常甲基化的影响

目的检测宫颈癌细胞系HeLa、CaSki和SiHa中结肠腺瘤性息肉病基因(APC)启动子区CpG岛甲基化状态;探索肼苯哒嗪(Hyd)能否作为去甲基化药物恢复APC表达。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测细胞系中APC启动子区CpG岛甲基化情况;Hyd处理后,RT-PCR检测APCmRNA表达。结果APC启动子区CpG岛在HeLa细胞中被甲基化,在CaSki细胞中半甲基化,在SiHa细胞中无甲基化;一定浓度Hyd处理HeLa、CaSki细胞后,检测到APCmRNA表达。结论HeLa、CaSki细胞系APC表达沉默与APC启动子区甲基化有关;Hyd能作为去甲基化药物诱导APC表达。     

DNA错配修复基因甲基化在肝细胞癌发生发展中的作用

目的探讨DNA错配修复基因(MMR)hMLH1,hMSH2和hMSH3甲基化在肝细胞癌(HCC)发生发展中的作用。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法对38例新鲜HCC组织,相应非肿瘤肝组织,2例正常的捐肝组织及6种肝癌细胞系的hMLH1,hMSH2和hMSH3基因启动子CpG岛甲基化进行检测;培养6种肝癌细胞系,MSP法检测加入5-aza-2‘-deoxycytidine前后hMSH2基因在HCC中的甲基化状态改变;逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测加入5-aza-2’-deoxycytidine前后hMSH2在肝癌细胞株中的mRNA表达改变。结果HCC标本中13．2％(5／38)发生了hMLH1启动子甲基化,68．4％(26／38)发生了hMSH2启动子甲基化;相应的非肿瘤肝组织中hMLH1,hMSH2启动子甲基化阳性率分别为2．6％(1／38),55．3％(21／38);2例正常肝组织中未发现甲基化;6株肝癌细胞系中有5株发生了hMSH2启动子甲基化,而未发现有MLH1启动子甲基化。所有标本中均未发现有hMSH3启动子甲基化。5-aza-2‘-deoxycytidine处理细胞株后,可部分或完全逆转hMSH2启动子甲基化,各细胞株的mRNA均有不同程度的表达增加。结论hMSH3基因启动子CpG岛甲基化与HCC的发生发展关系不大。hMSH2基因甲基化与mRNA表达密切相关,是基因表达调节的一种重要方式。hMLH1和hMSH2基因启动子CpG岛的高甲基化在HCC中是一个常见的基因改变,DNA错配修复基因尤其是hMSH2基因启动子甲基化在HCC的发生中起了重要作用,是早期事件,其可能为临床诊断HCC提供新的检测指标。     

结直肠腺癌患者外周血CNRIP1基因启动子甲基化的临床病理学分析

目的 分析结直肠腺癌患者外周血大麻素受体互作蛋白1(cannabinoid receptor interacting protein 1,CNRIP1)基因启动子甲基化程度与临床病理学参数的相关性,探讨外周血CNRIP1基因启动子甲基化检测在结直肠腺癌早期筛查及病程评估中的价值.方法 采用定量甲基化特异性PCR技术(quantitative methylation-specific PCR,qMSP)检测结直肠腺癌患者(50例)、结直肠腺瘤患者(20例)、健康志愿者(20例)外周血CNRIP1基因启动子CpG岛甲基化程度,并通过焦磷酸测序技术确定该基因启动子甲基化位点.登记结直肠腺癌患者临床病理参数.采用Fisher检验分析CNRIP1基因启动子CpG岛甲基化与结直肠腺癌临床病理参数的相关性.结果 结直肠腺癌、结直肠腺瘤患者及健康志愿者外周血CNRIP1基因启动子CpG岛的2246位点甲基化程度分别为(85.50±8.24)％、(81.33±5.81)％、(63.66％±3.61)％(P＜0.01);结直肠腺癌CNRIP基因启动子CpG岛2246位点甲基化程度分别与肿瘤直径、原发灶浸润深度、TNM分期具有显著相关性(P＜0.01),与腺癌分化程度、淋巴结转移具有一定相关性(P＜0.05).结论 CNRIP1基因启动子CpG岛2246位点甲基化程度与结直肠腺癌病程进展相对一致,可作为结直肠腺癌早期筛查及病程评估的标志物.     

5-羟色胺转运体基因启动子区CpG岛甲基化状态与精神分裂症Ⅰ型和Ⅱ型的关联

目的:探讨5-羟色胺转运体(5-HTT)基因启动子区CpG岛甲基化状态与精神分裂症Ⅰ型和Ⅱ型的关联。方法:运用特异性甲基检测PCR和直接测序法对62例精神分裂症Ⅰ型患者、38例Ⅱ型患者和50例健康被试5-HTT基因启动子区CpG岛甲基化状态进行检测。结果:三组5-HTT基因启动子区CpG岛甲基化阳性率无显著性差异;精神分裂症Ⅰ型患者5-HTT基因启动子区CpG岛内位点甲基化率显著高于精神分裂症Ⅱ型患者和健康被试组。结论:5-HTT基因启动子区CpG岛内位点高甲基化可能是精神分裂症Ⅰ型的发病机制之一。     

维吾尔族妇女宫颈病变组织中HPV感染与低相对分子质量蛋白酶体2和7基因启动子甲基化的关系

目的 探讨维吾尔族妇女宫颈病变及其人乳头状瘤病毒( human papillomavirus,HPV)感染与低相对分子质量蛋白酶体(low molecular-weight protein,LMP)基因启动子区甲基化水平的关系和意义.方法 利用专业软件设计LMP2和LMP7基因启动子区含CpG岛特异性PCR引物,对SiHa宫颈癌细胞DNA进行亚硫酸氢盐修饰、目的片段扩增、质粒载体克隆和测序,确定该区域所含CpG序列甲基化情况;收集维吾尔族妇女正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)患者新鲜组织和石蜡组织标本78例,并提取DNA,采用Sequenom MassARRAY DNA技术平台(质谱分析),定量分析LMP2和LMP7基因启动子甲基化水平,同时以HPV分型芯片鉴定HPV亚型,分析基因甲基化与HPV感染的关系;应用RT-PCR和免疫组织化学方法检测LMP2、LMP7mRNA和蛋白的表达,并分析蛋白表达与基因甲基化的关系.结果 LMP2和LMP7基因相应目的片段各含有22个CpG位点,在SiHa宫颈癌细胞基因组DNA中,只有LMP7有2个位点发生甲基化.宫颈病变病理过程伴随着LMP7基因CpG片段甲基化水平改变,其在CSCC和CIN组织的甲基化率(0.1864±0.0893和0.0728±0.0548)高于正常宫颈上皮组织(0.0652±0.0488),差异有统计学意义(P＜0.05).随着宫颈病变的加重LMP7 mRNA和蛋白表达逐渐下调,各组间表达差异具有统计学意义(P＜0.05),LMP7蛋白表达随着该基因甲基化率增高而降低(F=8.69,P=0.035).而LMP2蛋白表达在3组间差异无统计学意义(P＞0.05).HPV分型芯片检出12种HPV基因型,其中HPV16感染率构成比为52/78(66.7％),HPV16亚型阳性与宫颈病变进程及LMP7基因甲基化率升高趋势正相关(t=1.996,P=0.049).结论 LMP7基因启动子区CpG岛甲基化是一种宫颈癌病变特异性改变,与HPV16感染可能存在密切关系.     

家族性腺瘤性息肉病患者APC基因启动子区异常甲基化及大片段结构异常

目的 研究3个家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)家系的腺瘤样息肉病(adenomatus polyposis coli)基因(APC)启动子1A区异常甲基化及DNA大片段结构异常.方法 对3个FAP家系成员的肿瘤组织标本和正常组织标本DNA进行化学修饰,应用甲基化特异PCR(methylation-speeif-ic PCR,MsP)和DNA序列分析方法筛查APC基因启动子1A区甲基化情况.采用多重连接依赖性探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MIPA)分析系统检测5例FAP患者肿瘤组织标本和正常标本的APC基因的15个外显子及启动子区DNA大片段结构异常.结果 在1个家系中发现2例患者存在APC基因启动子1A区异常甲基化.同一个家系中另1例患者存在APC基因全基因杂合性缺失.结论 APC基因启动子1A区异常甲基化可影响APC功能,可能是结直肠癌进展过程中的早期事件;大片段缺失可能是导致典型FAP的一个因素.     

Methylation-specific oligonucleotide microarray: a new potential for high-throughput methylation analysis.

Oligonucleotide microarray-based hybridization is an emerging technology for genome-wide detection of DNA variations. We have extended this principle and developed a novel approach, called methylation-specific oligonucleotide (MSO) microarray, for detecting changes of DNA methylation in cancer. The method uses bisulfite-modified DNA as a template for PCR amplification, resulting in conversion of unmethylated cytosine, but not methylated cytosine, into thymine within CpG islands of interest. The amplified product, therefore, may contain a pool of DNA fragments with altered nucleotide sequences due to differential methylation status. A test sample is hybridized to a set of oligonucleotide (19-23 nucleotides in length) arrays that discriminate methylated and unmethylated cytosine at specific nucleotide positions, and quantitative differences in hybridization are determined by fluorescence analysis. A unique control system is also implemented to test the accuracy and reproducibility of oligonucleotides designed for microarray hybridization. This MSO microarray was applied to map methylated CpG sites within the human estrogen receptor alpha (ERalpha) gene CpG island in breast cancer cell lines, normal fibroblasts, breast tumors, and normal controls. Methylation patterns of the breast cancer cell lines, determined by MSO microarray, were further validated by bisulfite nucleotide sequencing (P <0.001). This proof-of-principle study shows that MSO microarray is a promising technique for mapping methylation changes in multiple CpG island loci and for generating epigenetic profiles in cancer.     

A microarray-based method for detecting methylated loci

 CpG island DNA methylation plays an important role in regulating gene expression in development and carcinogenesis. We developed a new microarray-based method called methylation amplification DNA chip (MAD) for detecting differences in methylation. In this method, only methylated CpG islands from the two samples that we wanted to compare were amplified and used for hybridization. The resource material for the microarray was derived from the methylated DNA library of the sample in which we wanted to detect hypermethylation. Choosing the methylated DNA library as the resource material of the microarray increased the percentage of DNA fragments derived from hypermethylated loci on the microarray. Received: March 20, 2002 / Accepted: April 23, 2002     

一种快速定量检测p16基因甲基化方法的建立

目的建立一种基于错配杂交-化学发光检测的p16基因启动子区过甲基化的定量分析方法。方法用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA,所有未甲基化的胞嘧啶都被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不发生变化。设计合成一对不含CpG位点的引物同时扩增甲基化或非甲基化目的DNA片段,用两根分别与甲基化及非甲基化CpG位点互补的寡核苷酸探针与扩增产物进行杂交,化学发光检测,通过两根探针的杂交信号强度之比确定样品DNA中甲基化的p16基因的比例。结果检测结果与肿瘤细胞DNA样品中甲基化的p16基因的量成正比,而且与其表达水平呈逆相关。结论与现有方法相比,本法是一种检测快速、操作简便的p16基因甲基化的定量检测方法。     

Studying the epigenome using next generation sequencing

The advances in next generation sequencing (NGS) technologies have had a significant impact on epigenomic research. The arrival of NGS technologies has enabled a more powerful sequencing based method--that is, ChIP-Seq--to interrogate whole genome histone modifications, improving on the conventional microarray based method (ChIP-chip). Similarly, the first human DNA methylome was mapped using NGS technologies. More importantly, studies of DNA methylation and histone modification using NGS technologies have yielded new discoveries and improved our knowledge of human biology and diseases. The concept that cytosine methylation was restricted to CpG dinucleotides has only been recently challenged by new data generated from sequencing the DNA methylome. Approximately 25% of all cytosine methylation identified in stem cells was in a non-CG context. The non-CG methylation was more enriched in gene bodies and depleted in protein binding sites and enhancers. The recent developments of third generation sequencing technologies have shown promising results of directly sequencing methylated nucleotides and having the ability to differentiate between 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. The importance of 5-hydroxymethylcytosine remains largely unknown, but it has been found in various tissues. 5-hydroxymethylcytosine was particularly enriched at promoters and in intragenic regions (gene bodies) but was largely absent from non-gene regions in DNA from human brain frontal lobe tissue. The presence of 5-hydroxymethylcytosine in gene bodies was more positively correlated with gene expression levels. The importance of studying 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine separately for their biological roles will become clearer when more efficient methods to distinguish them are available.     

DENV2感染外周血单个核细胞增加TNF-α基因启动子区域CpG位点的甲基化水平

 目的：检测正常人外周血单个核细胞（PBMC）感染2型登革病毒（DENV2）后肿瘤坏死因子α（TNF-α）基因启动子区域CpG位点的甲基化水平。
方法：采用亚硫酸氢盐测序PCR法检测DNA甲基化水平。结果：TNF-α基因启动子区域为-294 bp到+58 bp,覆盖11个散在CpG位点;PCR反应后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析显示,扩增序列大小与理论预测相符合;PBMC感染DENV2 0 h和6 h 在11个甲基化位点中有2个处于甲基化状态,感染12 h有6个甲基化位点甲基化。0 h、6 h和12 h的平均甲基化率分别为103%、121%和255%,且0 h和12 h及6 h和12 h的甲基化率差异有统计学意义。结论：PBMC感染DENV2后会引起TNF-α基因启动子区域的甲基化水平增加。     

BRCA1基因复杂甲基化模式

应用体外甲基化酶M-SssI处理和甲基化敏感单链构象分析法(Methylation-sensitive single-strand conformation     

胚胎干细胞分化为表皮样干细胞基因启动子区差异甲化研究

 目的： 用全基因组甲基化芯片探讨可能参与小鼠胚胎干细胞(ESCs)分化为表皮样细胞(ELCs)的基因DNA甲基化调控机制。方法： 利用人羊膜建立体外诱导体系,将小鼠ESCs诱导定向分化为ELCs,分别取未分化的ESCs和诱导分化后的ELCs进行芯片分析,利用甲基化免疫共沉淀技术将每组染色质DNA的甲基化片段共沉淀下来,和本底对照 (input)分别标记Cy3和Cy5荧光,一同上样于Roche NimbleGen高密度(2.1M,芯片覆盖22 425个启动子)甲基化芯片,启动子区采用UCSC数据库进行注释,启动子覆盖转录起始位点上游8 200 bp、下游3 000 bp,通过对这些启动子区甲基化谱的分析,筛选出甲基化调控可能与ESCs向ELCs定向分化相关的基因。结果： 小鼠ESCs和ELCs 两组细胞在基因组水平上有17 500个启动子存在甲基化,其中有3 435个启动子发生甲基化差异变化,高CpG岛的启动子有894个发生差异甲基化,中度CpG岛的启动子有974个发生差异甲基化,低CpG岛的启动子有1 567个发生差异甲基化。结论： 在ESCs向ELCs定向分化的过程中,众多的基因启动子区发生了甲基化程度的变化,说明细胞分化是一个复杂的表观遗传学事件。这些基因启动子的差异甲基化在ESCs向ELCs定向分化过程中所起的作用及其机制尚有待进一步的功能学研究阐明。