重组人IL—18和IL—18—GFP融合蛋白的表达及其生物学活 …

目的 在大肠杆菌中表达重组人ＩＬ－１８（ｒｈＩＬ－１８）及ｒｈＩＬ－１８－绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）融合蛋白并测定其生物活性。方法 构建原核表达质粒ｐＥＴ２８ａ／ｈＩＬ－１８及ｐＴｒｃ９９／ｈＩＬ－１８－ＧＦＰ,并分别转化大肠杆菌ＢＬ２１。用ＩＰＴＧ诱导重组蛋白的表达,超声裂菌上清中的ｒｈＩＬ－１８用镍金属螯合层析柱进行纯化,ｒｈＩＬ－１８－ＧＦＰ用抗ＧＦＰ亲和层析柱及Ｓｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ｗｖ     

HL-60细胞中IL6基因的克隆及鉴定

目的：为探索性构建重组人白细胞介素６－绿脓杆菌外毒素融合蛋白（ＩＬ６－ＰＥ４０）以选择性杀伤高表达ＩＬ６受体（ＩＬ６Ｒ）的白血病细胞,本研究试图从人急性早幼粒细胞白血病细胞株（ＨＬ－６０）中克隆Ｎ－末端缺失２４个氨基酸的人ＩＬ６基因（ＩＬ６ｃＤＮＡ）并构建含此基因的重组质粒。方法：根据ＩＬ６基因序列设计合成可扩增ＩＬ６ｃＤＮＡ的特异性引物;利用基因重组技术,构建含ＩＬ６基因的重组质粒ｐＵＣ－ＩＬ６。结果与结论：本文首次从ＨＬ－６０中扩增出预期４８０ｂｐ的ＩＬ６ｃＤＮＡ,将其克隆至ｐＵＣ１８质粒中,命名为ｐＵＣ－ＩＬ６,并经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ双酶切电泳及序列分析鉴定加以确证,为进一步构建重组人ＩＬ６－ＰＥ４０奠定了坚实基础。     

人野生型p53 cDNA的克隆、表达和意义

目的：为探讨肿瘤细胞ｗｔ ｐ５３蛋白功能失活机制的研究,检测肿瘤患者血清抗ｐ５３抗体辅助临床诊断提供人ｗｔ ｐ５３蛋白。方法 将人ｗｔ ｐ５３基因ｃＤＮＡ片段插入到大肠杆菌表达载体ｐＱＥ－３０中,得到重组表达质粒ｐＱＥ３０－ｐ５３,用ｐＱＥ３０－ｐ５３重组质粒转化大肠杆菌Ｍ１５细胞,转化菌落经ＰＣＲ扩增和ＢａｍＨⅠ、Ｘｂａ Ｉ酶切证实ｐ５３基因插入。ＩＰＴＧ诱导大肠杆菌表达ｗｔ ｐ５３蛋白,通过Ｎ     

人白细胞介素15cDNA克隆及其在大肠杆菌中表达

从ＬＰＳ活化的人外周血单核细胞总ＲＮＡ中，用ＲＴＰＣＲ方法扩增出编码成熟人白细胞介素１５（ｈＩＬ１５）的ｃＤＮＡ，并将其克隆于ｐＢｌｕｅＳｋｍ质粒中，序列测定结果与预期一致。再将ｈＩＬ１５ｃＤＮＡ克隆于表达载体ｐＢＶ２２０，构建了高效表达克隆ｐＢＶＩＬ１５。热诱导４ｈ，ｈＩＬ１５蛋白表达即达高峰。表达的重组蛋白经ＳＤＳＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析，分子量约１３ｋＤ，占菌体总蛋白的３３％，经包涵体提取及ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００凝胶过滤纯化，重组蛋白纯度达９５％以上，具有显著的促鼠Ｔ淋巴母细胞增殖作用     

T细胞产生的一种新型细胞因子：人IL—17

从ＣＤ４＾＋Ｔ细胞文库中克隆出人ＩＬ－１７（ｈＩＬ－１７）。外周血ＣＤ４＾＋Ｔ细胞在刺激状况下表达高水平的ｈＩＬ－１７。ｈＩＬ－１７基因由哺乳动物表达载体ｐＤＣ４０９携带转染ＣＤ１／ＥＢＮＡ细胞后，可表达为糖基化及非糖基化两种形式。ｈＩＬ－１７Ｆｃ融合蛋白及转染ｈＩＬ－１７的细胞培养上清可诱导产生ＩＬ－６和ＩＬ－８，并且还可促进人或纤维细胞表面细胞间粘附分子－１（ＩＣＡＭ－１）的表达。     

hIL—13融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

通过ＲＴ－ＰＣＲ技术直接从激活的健康人外周血单个核细胞（ＨＰＢＭＣ）中扩增出的０．３ｋｂ的ｈＩＬ－１３基因片段，经ＤＮＡ重组技术，插入到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２中，转化入感受态的大肠杆菌ＴＧ１中，成功地构建了ｈＩＬ－１３的基因工程表达菌株ｈＩＬ－１３「ｐＧＥＸ－４Ｔ－２／ＴＧ１。经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后表达的ＧＳＴ－ＩＬ－１３融合蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明分子量约３６ｋＤ、     

重组人IL-18和IL-18-GFP融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

目的在大肠杆菌中表达重组人ＩＬ－１８（ｒｈＩＬ－１８）及ｒｈＩＬ－１８－绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）融合蛋白并测定其生物活性。方法构建原核表达质粒ｐＥＴ２８ａ／ｈＩＬ－１８及ｐＴｒｃ９９／ｈＩＬ－１８－ＧＦＰ,并分别转化大肠杆菌ＢＬ２１。用ＩＰＴＧ诱导重组蛋白的表达,超声裂菌上清中的ｒｈＩＬ－１８用镍金属螯合层析柱进行纯化,ｒｈＩＬ－１８－ＧＦＰ用抗ＧＦＰ亲和层析柱及ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－１００分子筛柱纯化。以人的外周血单核淋巴细胞测定两重组蛋白的生物活性。结果表达的ｒｈＩＬ－１８及ｒｈＩＬ－１８－ＧＦＰ均具有促进Ｔ细胞增殖,增强ＮＫ细胞细胞毒作用及诱导外周血单核淋巴细胞合成ＩＦＮ－γ的能力,ｒｈＩＬ－１８－ＧＦＰ还具有ＧＦＰ的绿色荧光特性,可对Ｐ８１５细胞进行标记。结论表达并纯化的ｒｈＩＬ－１８及ｒｈＩＬ－１８－ＧＦＰ具有生物活性,可用于进一步的功能研究。     

携带hIL-2cDNA的逆转录病毒载体的构建及其在人肝癌细胞中的特异表达研究

将人白细胞介素２（ｈＩＬ-２）ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＭＮＳＭ的ＰＬ位点　，分别构建了转录受ＳＶ４０早期启动子和人甲胎蛋白增强子调控的重组逆转录病毒载体ＭＮＳＩ和ＭＮＳＩＡ。用脂质体转染法将ＭＮＳＩ和ＭＮＳＩＡ分别转导ＰＡ３１７包装细胞，测质粒转染率为（５～２０）×１０~(－３)克隆／μｇＤＮＡ·１０~６细胞，病毒感染率为（５．４～４５０）×１０~４ＣＦＵ／ｍｌ。重组病毒在４μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下感染人肝癌细胞、肾癌细胞和黑色素瘤细胞，Ｎｅｏ~Ｒ克隆经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证明ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ转入人肿瘤细胞并整合，　Ｒ　ＮＡ斑点杂交及ＩＬ－２活性表达分析证明，人甲胎蛋白增强子可促进异源启动子启动ｈＩＬ－２ｃＤ－ＮＡ在合成甲胎蛋白的人肝癌细胞中高效特异转录和表达。该研究对肝癌特异性免疫增强基因治疗有重要意义。     

人重组IL—1受体拮抗剂在大肠杆菌的高效表达

利用ＰＣＲ技术从分裂素刺激的人外周血细胞ｃＤＮＡ文库扩增出人白细胞介素－１受体拮抗剂（ｈＩＬ－１ｒａ）的成熟分子编码区ｃＤＮＡ，将其克隆化插进高效表达的质粒载体ｐＫｐＬ－３α后，在大肠杆菌中高效表达出ｒｈＩＬ－１ｒａ，其Ｎ端序列与预期结果一致。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，ｒｈＩＬ－１ｒａ的表达量占菌体蛋白的３０％以上。体外试验证明，该表达产物对单核细胞衍生的ＩＬ－１活性有明显抑制作用。     

重组人IL—4 cDNA及纯化蛋白的鉴定

构建了和且人白细胞介素４（ｒｈＩＬ－４）表达质粒ｐＢＶ２２０／ｒｈＩＬ－４ａ，并在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达。经核苷酸序列分析，测出ｒｈＩＬ－４ ｃＤＮＡ全序列与国外发表的ｈＩＬ－４ ｃＤＮＡ序列完全相同。其纯化蛋白产品经分子量测定，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析，等电点分析，Ｎ－端氨基酸序列测定，比活性等测定证明，均符合ｒｈＩＬ－４。     

人胚胎生殖细胞在人胚胎成纤维细胞饲养层上的生长

目的探讨以人胚胎成纤维细胞为饲养层分离、培养人胚胎生殖细胞的方法和条件。方法分离、培养3～4月胚胎成纤维细胞,取3～15代细胞经丝裂酶素处理后铺板备用;分离6．11周胚胎原始生殖细胞,将其置于人胚胎成纤维细胞饲养层上,在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞;用免疫细胞化学方法检测胚胎生殖细胞表面标志SSEA-1和SSEA-4;钙-钴法检测碱性磷酸酶活性;RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达。结果人胚胎成纤维细胞可连续传代25代以上(6月),3～15代细胞可以用作饲养层细胞。分离的胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖细胞集落,并能连续在体外培养超过8代。集落未分化标志检测显示SSEA—1、SSEA-4呈阳性,碱性磷酸酶活性呈强阳性,Oct-4表达阳性。结论用人胚胎成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞。     

人胎睾丸的组织发生

用7～38周人胎35例,取睾丸固定于 Carnoy 液,石蜡包埋,以 HE、PAS 反应及甲绿哌喏宁法染色。7周初的性腺尚未分化,可见散在的原始生殖细胞。13周睾丸特征已明显,白膜厚,睾丸素清楚,索间有密集的嗜酸性间质细胞。14.5周部分睾丸索出现小腔,而成管状。睾丸索包含大而着色淡的原始生殖细胞及色深的原始支持细胞。胎早期原始生殖细胞含有丰富的糖原颗粒。睾丸门、白膜及表面上皮内均见散在或成群的生殖细胞。睾丸间质细胞分幼稚型、成熟型及退化型。13～15周以幼稚型为主;16～18周以成熟型为主,成熟型的胞质内含有 RNA 颗粒;20周后退化型增多,成熟型减少。38周时,睾丸间质细胞单个或成行存在,数量大为减少。     

人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)cDNA的克隆

为了研究人碱性成纤维细胞生长因子在治疗神经系统疾病中的作用 ,克隆其 c DN A序列 ,并添加 K ozak序列 ,以用于真核细胞表达。本实验提取我国自建的脑胶质瘤细胞系 BT32 5总 RN A,设计上、下游引物用逆转录 PCR法扩增 c DNA片段 ,然后重组于 p GEM- 3zf( + )载体 ,酶切鉴定插入片段正确后测序。结果 :RT- PCR扩增到 4 73bp的带有 K ozak序列的 c DN A片段。显示 :克隆到碱性成纤维细胞生长因子 c DN A片段 ,可用于真核细胞表达     

人胎儿耳郭的形态学研究

材料为泰安市引产的９－３８周胎儿标本４２１例，对耳郭的长、宽和游离缘边长进行了测量；对２１３例耳郭和耳垂的类型进行了观察。结果表明，其各数值均随胎儿的发育而增大，２４周前耳郭发育迅速，长和宽每月增长３－４ｍｍ，游离缘边长每月增加４－７ｍｍ。２５周始增长较前缓慢。耳郭和耳垂的分型在１３周前不典型，２０周始明显。耳郭以Ｖ型占有数（４７．８％），耳垂以圆形为主（５６．８１％）。     

人胎卵巢的组织发生

本文收集10～38周女性胎儿26例,取卵巢固定于Carnoy液,采用HE、PAS及Unna法显示一般结构、多糖类及RNA。胎期卵巢的发育可分为三期。1.卵原细胞期(第10～15周):可观察到繁殖中的卵原细胞群遍布于皮质,卵原细胞含有糖原颗粒。2.初级卵母细胞期(第15～20周):卵原细胞群的部分细胞分化为卵母细胞,并逐渐增多,核处于分裂前期,胞质内含有RNA颗粒,同时皮质内出现成群退化的生殖细胞。3.原始卵泡期(第20～38周):皮髓交界区于15～17周出现原始卵泡;20周后,大量原始卵泡存在于皮质。26周后可观察到少数生长卵泡,此乃母体促性腺激素作用于胎儿卵巢的结果。胎期卵巢内的间质腺细胞少而分散,存在于皮髓交界区,第12周后出现,胎期一直很少,新生儿期稍增多。     

人胚胎肺的组织发生

本文将38例胎儿肺组织,用Romeis法显示弹性纤维,PAS法显示糖原,Unna法显示RNA及Gomori钙-钴法显示ALP。胚胎期肺的发育可分为3期:1.腺状期(7～16周)以支气管树发育为主,上皮为假复层柱状,含有丰富的糖原,上皮游离缘有明显的嗜哌喏宁及ALP阳性闭锁堤;2.小管期(17～24周)以呼吸部发育为主,衬以未分化的立方上皮,上皮内糖原逐渐减少;3.原始肺泡期(25周至出生)以肺泡的形成和分化为主,肺泡上皮分化为扁平的Ⅰ型细胞及立方形Ⅱ型细胞。Ⅱ型细胞含有少量糖原颗粒及RNA颗粒,ALP弱阳性。此期有大量毛细血管嵌入上皮间,形成龛细胞及气血屏障。     

人小腿肌的构筑学研究

对１６侧人小腿肌用肌构筑学方法进行了研究。结果表明，虽然小腿前群肌的肌重超于小腿后群深层肌，但由于二者的构筑不同，小腿后群深层肌的生理横切面积是小腿前群肌的１．７５倍，参与维持足弓和内、外翻足心的胫骨前，后肌和腓骨长，短肌的生理横面积达４９．１ｃｍ＾２。小腿肌多是羽肌，其中胫骨前、后肌属于环羽肌。根据肌构筑研究，认为羽肌是静力性功能和力量型设计的产物。     

对胎儿附睾超微结构的加龄研究

应用透射电镜对１４例不同孕龄胎儿及４例新生儿的附睾上皮超微结构进行了观察。发现不同孕龄胎儿附睾各段上皮细胞类型存在差异；在起始段和头段有纤毛细胞，明柱状细胞，暗柱状细胞和窄暗细胞，而体，属段只有后三种。其中，２８周时体段的窄暗细胞最多，３３周上述细胞外，在头段还观察到淋巴细胞，在体段则看到内分泌样细胞。