结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞系恶性转化

目的:研究结晶型硫化镍(NiS)诱发SV-40 Large T抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化作用.方法:体外用不同浓度结晶型NiS多次处理16HBE细胞,软琼脂集落形成和裸鼠成瘤试验鉴定转化细胞的恶性度.结果:细胞培养至35代,发现NiS可诱导16HBE恶性转化.转化细胞排列紊乱,重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P＜0.01),并呈时间剂量依赖关系;转化细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为低分化鳞状细胞癌.结论:结晶型NiS有较强的诱导人支气管上皮细胞恶性转化能力；该转化模型为镍致癌机制的分子水平研究提供了理想的研究系统。     

DNMT1高表达在MNNG诱导哈萨克族食管上皮细胞恶性转化中的作用

目的：利用已构建的哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞模型,探讨DNMT1高表达在MNNG诱导食管上皮细胞恶性转化中的作用,为研究食管癌发病机制提供理论依据。方法：以MNNG为诱导剂,MTT法和克隆形成实验确定MNNG的恶性转化剂量;对哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞和正常上皮细胞采用隔代染毒的方式进行染毒,每次染毒1 h,软琼脂集落形成实验观察不同染毒和传代次数的细胞集落形成情况;裸鼠成瘤实验观察哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞及其转化细胞的恶变程度。结果：MTT法和克隆形成实验发现MNNG转化浓度为1.50×10^-5 mol/L,软琼脂集落形成实验发现染毒14次第27代的哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞在软琼脂上有细胞集落形成,并且随着MNNG染毒剂量、次数和细胞传代次数的增加,出现细胞形态不规则等恶性转化特点,接触抑制逐渐消失,耐受性逐渐增强,生长速度逐渐增加,而正常上皮细胞未出现阳性结果,细胞固缩死亡。接种哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞的裸鼠出现局部肿块,但病理鉴定仅为结构紊乱,并未出现鳞癌,而接种转化细胞的裸鼠出现肿瘤,经病理鉴定为鳞癌。结论：成功构建了哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞恶性转化模型,DNMT1高表达可促进MNNG致细胞恶性转化,加快其恶变速率和恶变程度。     

结晶型硫化镍及反式-BPDE恶性转化16HBE细胞hMSH2基因甲基化的研究

背景与目的： 对结晶型硫化镍(Nickel sulfide,NiS)及反式二氢二醇环氧苯并芘(anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo[a] pyrene,BPDE)恶性转化及成瘤的人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial,16HBE)hMSH2基因启动子甲基化状况及其mRNA表达进行研究,探讨镍及反式-BPDE的表遗传致癌机制。材料与方法： 采用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)法和RT-PCR法检测结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子甲基化状况及其mRNA表达,与非转化的16HBE细胞进行比较;并用去甲基化因子5-Azac(5-Aza-2′-deoxycytidine)处理有异常甲基化的细胞。 结果： 发现结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区存在CpG岛的高甲基化;与非转化16HBE细胞比较,转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因mRNA表达下降;有异常甲基化的细胞经去甲基化处理后甲基化消失。结论： 结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区CpG岛的高甲基化使其mRNA表达下降,并可能导致hMSH2基因表达抑制,这可能是结晶型NiS及反式-BPDE诱导16HBE细胞转化和成瘤的一种表遗传致癌机制。甲基化的可逆性对今后研究其表型逆转以及药物治疗提供了重要依据。     

HPV联合MNNG对Het-1A细胞恶性转化的影响

目的：探讨人乳头状瘤病毒（HPV）全长基因转染与N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）染毒联合作用对食管正常上皮Het-1A细胞恶性转化的影响,为食管癌的发病机制提供理论依据。方法：以Het-1A细胞为靶细胞,设4组,包括空载体转染对照组、转染HPV-18组（HPV）、MNNG染毒组（MNNG）、HPV与MNNG联合作用组（HPV+MNNG）,其中MNNG染毒剂量为2 μmol/L,每代染毒1次,每次24 h;选取第10代、20代及35代细胞进行形态学观察和功能学试验。采用CCK-8法检测各代各组细胞增殖活力,流式细胞术检测各代细胞周期分布,用增殖指数表示细胞的增殖状况。并采用Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡,通过侵袭迁移能力以及软琼脂集落形成试验检测细胞恶性转化表型,最后通过裸鼠成瘤试验观察恶性转化细胞在体内的增殖状况。结果：随着染毒代数增加,HPV+MNNG组与MNNG组细胞形态发生了明显的改变,连接松散、细长、伴伪足。CCK-8检测结果与细胞周期检测结果一致,与对照组比较,HPV+MNNG组和MNNG组的细胞增殖活性出现了先升高再下降最后升高的趋势（P均 < 0.05）,且HPV+MNNG组细胞变化更明显。与MNNG单独作用组比较,HPV+MNNG联合作用组细胞的抗凋亡能力增强（P < 0.05）。侵袭和迁移试验结果显示HPV+MNNG组穿膜细胞数均显著高于其他各组（P < 0.05）,MNNG组次之;软琼脂集落形成试验中,HPV+MNNG组细胞集落形成率[（30.8±0.2）%]高于MNNG组[（27.1±0.3）%]（P < 0.05）。HPV+MNNG组与MNNG组裸鼠成瘤率均为100%,瘤体大小无显著性差异。HPV单独作用组与对照组裸鼠未成瘤。结论：HPV与MNNG联合作用可致食管正常上皮细胞Het-1A恶性转化,使细胞增殖能力、抗凋亡能力、侵袭迁移能力及非锚定独立生长能力均显著增强,参与并促进恶性转化进程。     

EB病毒编码的BARF1基因在人上皮细胞恶性转化中的作用

背景与目的:EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)的BamHⅠA区域的早期基因BARF1能使猴肾上皮细胞永生化,使人淋巴细胞和呲类动物的成纤维细胞发生恶性转化,但有关该基因在人上皮细胞肿瘤发生发展中的作用未见报道。本研究的目的是观察EBV-BARF1基因对人上皮细胞生长特性的影响及能否使之发生恶性转化。方法:构建真核重组表达载体pcDNA3-BARF1,转染人支气管上皮细胞(HBE),建立稳定表达BARF1基因的HBE细胞株;观察细胞生长状况、生长速度、在软琼脂中集落形成能力及对裸鼠的致瘤能力。结果:EBV-BARF1基因转染细胞生长旺盛,失去接触抑制能力,生长速度增快,并在裸鼠体内成瘤。结论:EBV的早期基因BARF1作为病毒的癌基因,在支气管上皮细胞的恶性转化中可能起着重要作用。     

^60Coγ射线诱发人支气管上皮细胞恶性转化模型的建立

目的：建立γ射线辐射诱导支气管上皮细胞恶性转化模型。方法：永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B经总剂量22Gy^60Coγ射线分3次照射后进行传代培养，应用平板克隆实验、血清抗性实验、细胞软琼脂集落实验检测该细胞系恶性程度；裸鼠皮下种植辐射细胞检测其成瘤能力，成瘤组织H-E染色及免疫组化进行病理学观察。结果：（1）平板克隆实验表明照射细胞培养至35代后其增殖能力明显增加（P〈0．05或P〈0.01），血清抗性实验显示照射组细胞在第45代后克隆形成增加（P〈0．01），而在照射后50代细胞软琼脂集落的形成能力明显增加（P〈0．01），显示BEAS-2B细胞经辐射后出现了恶性转化。（2）皮下种植22Gy 50代细胞的8只裸鼠50d后1只成瘤，种植22Gy 60代辐射细胞的8只裸鼠中有4只成瘤；成瘤组织病理检测及免疫组化证实为上皮细胞癌。结论：成功地建立了^60Coγ射线诱导的支气管上皮细胞恶性转化模型。     

EB病毒潜伏膜蛋白1对人支气管上皮细胞转化作用机理的研究

背景与目的：目前许多研究显示潜伏膜蛋白1(latent membrane proteinl,LMPl)在一些上皮源性肿瘤的发生中可能起重要作用,但有关LMP1对正常上皮细胞作用的研究并不是很多。因而,本研究拟观察EBV-LMP1对人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial,HBE)的转化作用,并初步探讨其作用机制。方法：将LMP1单独或与hTERT逆病毒表达载体共同转染HBE细胞,经抗性药物筛选获得阳性细胞克隆;通过绘制细胞生长曲线,进行软琼脂集落形成试验、端粒酶活性检测和cyclin A、p2l、CDK4蛋白表达的检测,研究LMPl对HBE细胞生物学特性的影响。结果：共同转染LMP1和hTERT的HBE细胞生长旺盛。各组细胞HBE／LMP1 hTERT、HBE／LMP1和HBE／pLNsx pBabe的软琼脂集落形成率分别为22．98％、16．94％和8．85％;端粒酶活性分别为2．825、2．44l、1．876。我们进行Western blot检测发现前两组细胞cyclin A表达上调、p2l表达下调,且两组之间无明显差异;而CDK4蛋白在各组之间表达一致。结论：在转化HBE细胞的过程中,LMP1和hTERT可能具有协同作用,通过调节cyclin A和p2l蛋白的表达水平,引起细胞异常增殖,使细胞向恶性化转变。     

甲基丙烯酸环氧丙酯致16HBE细胞恶性转化不同时期METTL9基因甲基化状态分析

目的:分析甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)致人支气管上皮(16HBE)细胞恶性转化不同时期甲基转移酶样基因METTL9甲基化状态及其表达情况,并探讨其意义。方法:收获GMA染毒第10代(早期)、20代(中期)、30代(后期)的16HBE细胞,应用甲基化芯片检测METTL9基因在GMA诱导16HBE细胞恶性转化不同时期的甲基化状态,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测该基因在恶性转化不同时期的表达量,并与同期DMSO溶剂对照组细胞比较。结果:甲基化芯片结果显示,对照组第10代和第20代细胞未发生甲基化,第30代细胞发生甲基化;GMA染毒组16HBE细胞在第10代和第20代METTL9基因均发生甲基化(PeakScore>2),而第30代细胞未见甲基化。qPCR结果显示,与同期溶剂对照组相比,GMA染毒组16HBE细胞在第10代和第20代METTL9基因表达量上调(P<0.05);经甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-cdr)处理后,该基因与同代龄GMA组细胞相比,第10代和第30代METTL9基因的表达量水平均上升(P<0.05),第20代表达水平下降(P<0.05)。结论:METTL9基因可作为GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化前、中期的一个特异分子标志。     

胡麻油烟凝聚物诱导人胚肺二倍体细胞恶性转化作用

背景与目的:研究胡麻油烟对人体潜在的致癌危险性.材料与方法:以胡麻油烟凝聚物(SOFA)作为受试物染毒人胚肺二倍体细胞,建立体外恶性转化实验系统,对转化细胞进行ConA凝集实验、软琼脂培养实验以及裸鼠体内致瘤实验,观察并检测细胞是否发生恶性变.结果:实验剂量范围内的SOFA(25～400 μg/ml)能够诱导人胚肺二倍体细胞形成细胞恶性转化灶,转化灶细胞生长失去接触抑制性、饱和密度增大、ConA凝集能力增强、锚着依赖性丧失及裸鼠体内具有成瘤性等多种细胞发生恶性变的生物学特性改变.结论:SOFA具有诱导人胚肺二倍体细胞恶性转化的作用,对人体具有潜在致癌作用.     

GMA致人支气管上皮细胞恶性转化过程中抑癌基因P15 甲基化状态的研究

目的： 观察甲基丙烯酸环氧丙酯 (glycidyl methacrylate，GMA)致人支气管上皮 (16HBE)细胞恶性转化过程中不同时点P15基因甲基化状态，探讨其在细胞恶性转化过程中可能的作用。方法：收获GMA转化前期 (第10代)、转化中期 (第20代)、转化后期 (第30代)16HBE 细胞，应用甲基化芯片技术和甲基化特异性PCR (MSP)检测P15基因在GMA诱导16HBE细胞恶性转化不同阶段的甲基化状态。结果：甲基化芯片结果显示，P15基因在转化中期、转化后期出现甲基化而转化前期未见甲基化，MSP法检测结果与芯片结果一致。结论：P15基因可能为GMA诱导细胞恶性程度相关的特异性基因，可考虑将其作为诱导细胞恶性转化的生物标志物。     

氯化镉恶性转化16HBE细胞中ERCC1基因表达和序列的变化

目的 探讨氯化镉(CdCl2)诱发人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中,ERCC1基因mRNA和蛋白动态变化的规律及其序列变化情况.方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学SP法,检测16HBE细胞及其CdCl2恶性转化细胞不同阶段(第5、15、35代细胞及成瘤细胞)ERCC1基因mRNA和蛋白的表达情况.用直接测序法,分析ERCC1基因第3、4外显子的序列情况.结果 随着转化代数的增加,ERCC1基因mRNA和蛋白的表达逐渐降低,至第35代细胞后表达明显下调,mRNA表达从16HBE的0.7028±0.0170下降到第35代细胞的0.3480±0.0453,蛋白表达强度从16HBE的8.40±1.34下降到第35代细胞的0.20±0.44,差异均有统计学意义(P＜0.01).ERCC1基因第4外显子在第1位点出现腺嘌呤(A)缺失,为移码突变.结论 镉致癌的分子机制可能与ERCC1基因水平的下调和突变有关.     

Multistep process of neoplastic transformation of normal human fibroblasts by 60Co gamma rays and Harvey sarcoma viruses

As reported previously (Namba et al., 1985), normal human fibroblasts were transformed by 60Co gamma-ray irradiation into immortal cells with abnormal karyotypes. These transformed cells (KMST-6), however, showed a low cloning efficiency in soft agar and no transplantability. However, upon treatment with Harvey murine sarcoma virus (Ha-MSV), the cells acquired elevated clonability in soft agar and transplantability in nude mice. Ha-MSV alone, however, did not convert normal human fibroblasts into either immortal or tumorigenic cells. The Ha-MSV-transformed KMST-6 cells showed an enhanced expression of the ras oncogene, but normal and 60Co gamma-ray-transformed cells did not. Our current data suggest that gamma rays worked against normal human cells as an initiator, giving rise to chromosome aberrations and immortality, and that Ha-MSV, probably through its ras oncogene, played a role in the progression of the malignant cell population to a more malignant one showing enhanced colony formation in soft agar and tumorigenicity in nude mice.     

乙酸镍诱导的人支气管上皮细胞系转化细胞基因组不稳定性分析

背景与目的：检测乙酸镍对基因组不稳定性的影响，从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。材料与方法：采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术来对经乙酸镍在诱导人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶变细胞中的基因组不稳定性进行分析。结果：本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带，条带数在1～6条之间。7条引物中第4、7两条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异。其余五条引物均有差异，对于同一随机引物它们都具有特异的带型。结论：乙酸镍能诱发16HBE细胞基因组不稳定。     

贫铀诱发人支气管上皮细胞恶性转化

背景与目的：实验研究和流行病学调查结果表明,铀可广泛地影响人体健康,但其远期效应,特别是致癌性,还缺乏明确的结论。本文模拟人吸入贫铀（depleted uranium,DU)气溶胶的情形,研究难溶性贫铀诱发人支气管上皮细胞恶性转化及肺癌相关基因表达谱。方法：用难溶性贫铀氧化物（dUO2)作用腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支气管上皮细胞（BEAS-2B）,通过观察不同代龄细胞的倍增时间,血清抗性,半固体琼脂克隆形成率及裸鼠成瘤性,鉴定细胞的恶性转化特性;用213个肺癌相关基因的芯片对贫铀诱发的转化BEAS-2B细胞的基因表达谱进行检测。结果：贫铀作用后的第5代BEAS-2B细胞倍增时间明显缩短,血清抗性显著增强;第10代细胞具有锚着独立性生长特性（半固体琼脂克隆形成）;第15代裸鼠体内成瘤。二甲亚砜（DMSO）对贫铀诱发的BEAS-2B细胞恶性转化有明显保护效果。213个肺癌相关基因的芯片检测结果表明,转化细胞中有70多个基因的表达水平发生明显改变,其中10余个基因表达水平明显下降。结论：贫铀在体外具有致癌性。     

Uniqueness of each spontaneous transformant from a clone of BALB/c 3T3 cells

Seeding 2 X 10(4) cells from a clone of BALB/c 3T3 cells in agar led to the formation of about 100 small colonies (approximate diameter, 0.2 mm) and two large colonies (1-mm diameter). Seven of the former and both of the latter were isolated, and the morphology and growth properties of their cells were observed in repeated weekly passages. The seven subclones derived from the smaller agar colonies spread out on the dish and multiplied more slowly than the parental clone on plastic, but six of them produced more colonies in agar than the parental clone. The two subclones derived from the larger agar colonies had a fully transformed morphology, multiplied much faster than the parental clone on plastic, and produced a high percentage of large colonies in agar. Each of the subclones could be distinguished morphologically from the others and from the parental clone, and most of them could be distinguished on the basis of their colony-forming efficiency in agar. Most of the secondary subclones derived from an early passage on plastic of one of the two large agar clones, died out on the second passage after their isolation. Secondary subclones derived from the same subclone five weeks later had a wide range of fluctuating growth rates, but did not die out on passage. The two rapidly growing subclones derived from large agar colonies initiated fast-growing tumors in nude mice. None of the other subclones produced any visible growth in nude mice over a 3-month period. Large agar colonies of fast growing, morphologically transformed cells appeared once during further passage of the parental clone and two of the subclones. The results reveal a surprising degree of heritable diversity in morphology and growth characteristics of the progeny from a clonal line of nontransformed cells. They also indicate that, in this cell line, only those cells that have a high efficiency (greater than 20%) of large colony formation in agar have the capacity to form tumors in nude mice.     

人永生化食管上皮细胞恶性转化的验证

目的 检查永生化人胚食管上皮细胞系（SHEE）的恶性表型、成瘤性和侵袭力,证实此细胞系传至85代（SHEE85）已完全恶性转化。方法 培养的SHEE85细胞用光镜和电镜观察细胞形态;以流式细胞仪检查细胞周期;行细胞软琼脂培养;以裸小鼠和SCID小鼠接种检测其成瘤性;以细胞培养于羊膜的体外方法和移植至SCID小鼠腹腔的体内方法测定其侵袭力。结果 SHEE85在光镜下细胞生长拥挤,大小不一;电镜下见细胞呈增殖状态。DNA组方图统计细胞增殖指数为47％,高倍体细胞12％。软琼脂培养多细胞大集落形成率4％。接种的4只裸小鼠和4只SCID小鼠皆成瘤。结论 SHEE85已完全恶性转化,并且有较强侵袭力。此细胞系可作为研究食管癌癌变细胞和分子机制可靠的模型。