神经母细胞瘤SK-N-SH细胞内DHRS4L2基因一种新选择性剪接亚型S4的克隆和亚细胞定位

目的 神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系脱氢酶/还原酶(SDR家族)成员4类2[dehydrogenase/reductase(SDR family)member 4 like 2,DHRS4L2]基因的一种新的选择性剪接亚型克隆、生物信息学分析及其亚细胞定位.方法 以SK-N-SH细胞cDNA为模板,PCR扩增DHRS4基因簇Ea1转录本.将PCR产物A-T克隆至pGEMT-Easy质粒,对质粒进行DNA Sanger测序.将测序所得序列用NCBI ORF finder分析其编码区,用Motif Scan分析预测蛋白氨基酸序列.用Clustal Omega进行蛋白序列比对分析.将新亚型完整编码框cDNA以及删除偶核定位信号的编码框分别插入pEGFP-C1质粒,所得质粒和空质粒分别转染SK-N-SH细胞,在荧光显微镜下观察转染表达蛋白亚细胞定位.结果 用RT-PCR和Sanger测序方法发现,SK-N-SH表达DHRS4L2 Ea1转录本,未检测到其表达脱氢酶/还原酶(SDR家族)成员4类1[dehydrogenase/reductase(SDR family)member 4 like 1,DHRS4L1]的Ea2转录本.DHRS4L2 Ea1表达一个新的选择性剪接亚型DHRS4L2-S4(KU141377),由AY616183基础上在Ea1与E2外显子之间插入新外显子Ej形成,外显子Ej含有新亚型翻译起始密码子ATG.转录本KU141377预测蛋白羧基端具有偶核定位信号(bipartite nuclear localization signal,NLS),提示其可能定位于细胞核.绿色荧光蛋白融合蛋白实验显示,在SK-N-SH细胞该蛋白定位于细胞核.该蛋白还含有一个甘氨酸密集区(glycine-rich region)和阿片样生长因子受体重复(opioid growth factor receptor repeat)序列.结论 研究发现SK-N-SH细胞表达的一种DHRS4L2新选择性剪接亚型KU141377,其预测编码蛋白含有细胞偶核定位信号,融合荧光蛋白实验显示该新亚型定位于细胞核,这为后续研究DHRS4L2在神经母细胞瘤中的潜在功能奠定基础.     

DHRS4L1基因选择性剪接亚型的克隆及分析

目的 检测分析DHRS4基因簇新命名基因DHRS4L1的RNA选择性剪接亚型和转录特点,并预测其功能.方法 cDNA末端快速扩增克隆DHRS4L1转录本剪接亚型的全长序列,Jellyfish软件比对RNA亚型的外显子组成,RNAStructure和在线开放读码框预测其二级结构和蛋白编码功能,定量PCR检测DHRs4L1...     

DHRS4基因簇缺失型神经母细胞瘤细胞株的克隆和鉴定

目的 单克隆培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y-细胞株,并鉴定其在基因水平缺失DHRS4基因簇,包括DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1的基因序列.方法 有限稀释法培养实验室偶得的低表达DHRS4基因的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,相差显微镜观察细胞的生长和增殖,PCR、RT-PCR检测DHRS4、DHRS4L...     

目标序列二级结构对RNA干扰效果的影响

目的探讨RNA二级结构对RNA干扰效果的影响,为RNA干扰靶序列的选择及设计有效siRNA提供依据。方法以K562细胞为模型,N-RAS基因mRNA为模板,分别针对二级结构茎区及二级结构环区设计4对siRNA,并分别采用RT-PCR、细胞活力检测及流式细胞检测等方法在RNA及细胞水平检测干扰效果差异。结果干扰结果表明,针对目标序列的siRNA均能对同源基因的表达产生一定程度的抑制,而针对二级结构环区目标序列的siR-NA干扰效果明显优于针对二级结构茎区的siRNA。结论RNA干扰效果与目标序列二级结构密切相关,在进行RNA干扰实验的目标序列选择时,应考虑二级结构的因素。     

双表达外源性4-1BBL/IL-15的K562细胞活化外周血淋巴细胞的研究

为肿瘤过继免疫治疗开发体外激活T细胞、NK细胞的高效途径,研究双表达外源性4-1BBL和IL-15的K562细胞刺激外周血淋巴细胞活化的能力。采用分子克隆技术,分别将4-1BBL和IL-15基因插入双表达载体pVITRO-2,命名为pV4-1BBL-IL-15。经测序鉴定后,利用脂质体介导的转染及潮霉素筛选,获得稳定双表达4-1BBL、IL-15分子的K562细胞(K562/4-1BBL/IL-15)。经流式细胞仪(FACS)分选后,K562/4-1BBL/IL15细胞和K562细胞分别用丝裂霉素C处理,与外周血淋巴细胞孵育24 h,FACS检测淋巴细胞表面活化性受体CD69的表达。对NK细胞不仅同时检测活化性受体NKG2D的表达,还用乳酸脱氢酶释放法观察NK细胞受不同刺激细胞作用后,细胞毒活性的变化。结果显示受K562/4-1BBL/IL15细胞刺激后,T细胞CD69的表达无明显变化。γδT细胞CD69表达增长5倍。NK细胞CD69表达增长6倍,而NKG2D的表达增加1.5倍;NK细胞受K562/4-1BBL/IL15细胞作用72 h后,细胞毒活性明显提高。提示双表达4-1BBL/IL-15的K562细胞能够高效激活γδT细胞及NK细胞,有望用于肿瘤的过继免疫治疗。     

小干扰RNA下调白血病细胞X连锁凋亡抑制蛋白的表达及其对化疗药物敏感性的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)下调白血病MOLT-4、HL-60、K562细胞的白血病细胞X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达对化疗药物敏感性的影响.方法 采用实时荧光定量PCR和Western免疫印迹检测MOLT-4、HL-60、K562细胞及健康人外周血单个核细胞(PBMC)XIAP mRNA和XIAP蛋白表达水平.用NucleofectorTM核酸转染仪对高表达XIAP的K562细胞转染XIAP siRNA(实验组),同时以转染无同源性siRNA作阴性对照组,未转染任何siRNA的K562细胞作空白对照组,并检测3组细胞XIAP mRNA和XIAP蛋白表达水平.同时将实验组、阴性及空白对照组细胞暴露于不同浓度的依托泊苷(vp-16,0.01、0.1、1、10、100mg/L)及阿糖胞苷(Ara-c,0.1、1、10、100、1000、10 000mg/L),用CCK-8法检测细胞抑制率变化.结果 与健康人PBMC比较,MOLT-4、HL-60、K562细胞XIAPmRNA及蛋白表达均增高(均P＜0.05),其中K562细胞XIAPmRNA及蛋白表达水平最高,与MOLT-4、HL-60细胞比较差异有统计学意义(均P＜0.05).K562细胞转染XIAP siRNA48 h后,与阴性对照组、空白对照组比较,实验组细胞XIAP mRNA及蛋白表达水平均明显下降(mRNA:0.37±0.10比1.41±0.13比1.00±0.12,蛋白:0.37±0.03比0.99±0.08比0.98±0.07,均P＜0.05).在给予1 mg/L vp-16、10及100 mg/L的Ara-c后,实验组细胞抑制率与阴性对照组、空白对照组比较,差异有统计学意义(均P＜0.05);在给予其他浓度vp-16和Ara-c后,3组细胞抑制率差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 XIAP siRNA能特异性下调K562细胞XIAPmRNA和蛋白质水平的表达,增强K562细胞对化疗药物依托泊苷、阿糖胞苷的敏感性.     

CXCR4基因表达增强K562细胞的趋化作用

目的 构建高表达人CXCR4蛋白的白血病细胞系并测定CXCR4基因对其侵袭转移能力的影响.方法 从外周血淋巴细胞中提取基因组RNA,用RT-PCR扩展编码CXCR4基因片段,将CXCR4基因定向克隆到含有双启动子的真核表达载体PBudCFA.1,采用酶切和序列测定方法鉴定.将所构建的重组质粒用脂质体2000转染K562细胞,Zeoein筛选阳性克隆.流式细胞术和RT-PCR对阳性克隆进行鉴定;用Transwell板检测转染与未转染CXCR4的K562细胞对趋化因子SDF-1趋化活性.结果 成功构建编码CXCR4基因的真核表达质粒PBudCE4.1/CXCR4.经转染入K562细胞,筛选获得能稳定高表达人CXCR4蛋白的K562/CXCR4细胞;K562/CXCR4细胞对SDF-1的趋化能力较K562细胞明显增强.结论 成功构建了转染人CXCR4基因的白血病细胞系,为进一步研究白血病细胞髓外浸润的分子机制奠定基础.     

苦参碱对K562及其多药耐药细胞K562/Vin的细胞生物学影响

目的:探讨中药苦参碱对K562及其多药耐药细胞K562/Vin的细胞生物学作用及其抗肿瘤作用机制。方法:MTT法检测苦参碱对两细胞的半数抑制浓度(IC₅₀值)及其逆转K562/Vin细胞对长春新碱的耐药作用,并绘制细胞生长曲线变化。免疫组化方法测定细胞表面P-糖蛋白表达。光镜下观察细胞形态学改变,透射电镜下观察细胞结构变化。RT-PCR检测端粒酶基因hTERT-mRNA表达。结果:苦参碱对K562、K562/Vin细胞的IC₅₀值分别为3.4、4.6mmol·L ^-1。4.0mmol·L ^-1苦参碱可抑制两细胞的生长;2.0mmol·L ^-1苦参碱可降低K562/Vin细胞表面P-糖蛋白表达,增强长春新碱对K562/Vin的细胞毒性,其逆转耐药倍数为492.4倍。苦参碱作用后K562、K562/Vin细胞在光镜、电镜下均可见凋亡的形态学变化。苦参碱作用后K562细胞hTERT-mRNA表达受抑,并与药物作用浓度相关。结论:苦参碱可增强长春新碱对K562/Vin细胞的毒性,并诱导K562、K562/Vin细胞凋亡,同时可抑制K562细胞hTERT-mRNA表达,提示苦参碱可为一有效抗肿瘤药物。     

CRISPR/Cas9技术联合脂质体转染子宫内膜癌细胞单质粒基因敲除方法首次编辑免疫相关基因HLA-DRA

背景：HLA-DR基因异常表达与多种肿瘤的进展及预后相关,采用CRISPR/Cas9技术编辑子宫内膜癌HLA-DRA基因的研究目前国内外尚未见报道。目的：利用CRISPR/Cas9技术对HEC-1-A细胞的HLA-DRA基因靶向敲除,检测其敲除效率,并初步探索HLA-DRA基因的功能。方法：根据HLA-DRA基因序列,针对HLA-DRA外显子设计单链向导RNA（sg RNA）,分别将sg RNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性克隆至YKO载体中,通过脂质体将sg RNA表达质粒转染到HEC-1-A细胞中。根据荧光表达,观察评估sg RNA敲除效果后,使用表达sg RNA的质粒进行转染,用最佳浓度的嘌呤霉素筛选,获得稳定的绿色荧光蛋白阳性表达细胞后,进行PCR、基因测序、转录组测序。结果与结论：经转染和嘌呤霉素筛选后,获得稳定表达绿色荧光蛋白的HEC-1-A细胞,对其进行Sanger测序分析,结果显示HEC-1-A细胞中HLA-DRA第一号外显子基因被定向敲除,对转录组测序结果进行差异基因筛选,根据筛选所得686个差异表达基因进行GO富集分析和KEGG富集分析,构...     

PMA特异性抑制K562细胞BCR/ABL和FynmRNA的表达

目的: 研究12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波酯(PMA)对K562细胞BCR/ABL与Fyn mRNA表达的影响及两者之间的关系。方法: 1~250 μg/L PMA刺激K562细胞 24 h后,应用实时荧光定量PCR技术检测各组BCR/ABL和Fyn mRNA的水平。结果: PMA明显抑制BCR/ABL和Fyn mRNA的水平,该下调作用均具有显著的量效关系,且BCR/ABL和Fyn的mRNA表达水平下调表现出明显的相关性。比较刺激Molt-4细胞株的结果, PMA抑制作用具有细胞选择性。K562细胞株经诱导后出现伪足样的形态改变。结论: PMA通过抑制BCR/ABL融合基因的转录下调Fyn转录水平。     

肿瘤抗原联合CD40L致敏树突状细胞诱导CTLs杀伤K562细胞的实验研究

目的：以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导为树突状细胞（DCs），负载K562细胞冻融抗原，并联合CD40L诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对K562细胞的杀伤作用。方法:密度梯度离心法、贴壁法分离健康人外周血单核细胞，应用rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α等细胞因子诱导扩增，培养DCs，用K562细胞冻融抗原联合rhsCD40L致敏DCs。实验分4组：K562细胞冻融抗原致敏DCs为实验组A，联合CD40L致敏DCs为实验组B，未致敏DCs为对照组A，单核细胞+异体淋巴细胞组为对照组B，观察CTLs对K562细胞的杀伤效应。结果:培养出具有典型特征的DCs，表达CD40最高达96%、CD86达97%、CD80为77%、CD1a为 69%，体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。在效靶比为 20∶1 时，实验组A对K562细胞的杀伤率为71.3%，实验组B为86.9%，对照组A为37.6%，对照组B为21.1%。实验组均显示高水平杀伤率，与对照组比较差异显著（P＜0.05），实验组B加CD40L杀伤率高于实验组A（P＜0.05） 。结论：K562细胞冻融抗原冲击致敏DCs能有效诱导T细胞特异性抗白血病作用，联合CD40L能增强其CTL的杀伤作用。