LFn-MAGE3融合蛋白表达及生物学功能初步研究

目的:表达融合蛋白LFn-MAGE3,探讨无毒炭疽毒素用于治疗肿瘤的可能性。方法:将LFn的编码序列导入PET21a表达载体中,构建LFn融合表达载体PET21a-LFn。将全长MAGE-3基因插LFn融合表达载体中,构建了PET21a-LFn-MAGE3融合蛋白表达载体。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达LFn-MAGE3融合蛋白。表达产物用QsepharoseFF离子交换柱和PheHP疏水柱进行纯化。LF毒性抑制实验和细胞免疫荧光实验检测融合蛋白的生物学活性。结果:融合蛋白LFn-MAGE3在大肠杆菌BL21a获得胞内可溶性表达,经纯化后,获得一定纯度的LFn-MAGE3融合蛋白。细胞免疫荧光实验显示LFn-MAGE3能在PA(炭疽保护性抗原)协同下高效进入巨噬细胞。结论:表达纯化获得的LFn-MAGE3融合蛋白能在PA协助高效进入细胞,可以用于下一步的肿瘤免疫治疗的动物实验中。     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

一种重组β-内酰胺酶的原核表达,纯化及其活性检测

目的:利用原核表达系统诱导表达一种可以用于肿瘤生物治疗ADEPT(单抗导向酶活化前药)的重组蛋白RGD4CβL,并对该蛋白进行纯化以及活性检测。方法:对合成的DNA序列进行测序,将重组载体pColdII-RGD4CβL转化入大肠杆菌E.coli BL(DE3),在大肠杆菌细胞中诱导表达目的蛋白,用His标签纯化树脂Ni-NTA纯化目的蛋白,以流式细胞术(FCM)检测纯化所得蛋白的活性。结果:合成的DNA全长为1125bp,其在E.coli BL(DE3)中经IPTG诱导后表达出相对分子质量(Mr)约为42000的目的蛋白,经纯化后获得了产率和纯度均很高的重组蛋白RGD4CβL,流式细胞检测证明该蛋白具有很好的肿瘤细胞靶向性。结论:成功地对重组蛋白RGD4CβL进行了诱导表达,得到的纯化蛋白具有较好的肿瘤细胞靶向性,该重组蛋白将可能成为一种免疫原性更低的新型双功能蛋白用于ADEPT。     

植原体免疫主导膜蛋白A的原核表达载体构建、表达及其抗血清制备

目的 构建植原体免疫主导膜蛋白A (IdpA)的原核表达载体,表达并纯化目的蛋白,制备抗血清.方法 以重组克隆质粒pMD18-T-IdpA为模板PCR扩增IdpA基因片段,经酶切连接将IdpA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),PCR和双酶切进行鉴定.IPTG诱导重组菌表达IdpA蛋白,并进行纯化和鉴定,以纯化获得的IdpA蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并采用ELISA和Western blot法检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-IdpA,并在大肠杆菌中能稳定表达IdpA蛋白,经纯化获得了纯度大于90％的高纯度目的蛋白,用纯化的IdpA蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了效价高于1:320 000的强特异性抗IdpA蛋白抗血清.结论 成功进行了IdpA的原核表达并制备了抗血清.     

CAD基因原核表达载体的构建及表达产物的活性鉴定

目的 构建pCool-GST-ICAD/CAD的表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有生物学活性的CAD核酸酶.方法 用PCR扩增CAD基因, 将扩增产物克隆入pCool-GST-ICAD载体中构建出pCool-GST-ICAD/CAD表达载体.经酶切和电泳鉴定正确后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化,最后用SDS-PAGE和DNA降解实验进行鉴定.结果 构建了pCool-GST-ICAD/CAD原核表达载体,重组载体转化后表达出毫克级水平的GST-ICAD/CAD蛋白复合体.经分离纯化后得到纯度很好的CAD-ICAD蛋白复合体,在SDS-PAGE电泳上呈现清晰的两条蛋白带.经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶作用.结论 成功制备了具有生物学活性的CAD核酸酶,为进一步研究细胞凋亡的作用机制提供了有效的制剂.     

人脂联素球状结构域基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建人脂联素球状结构域(gAd)基因的原核表达载体PET-28a(+)-gAd,诱导表达并纯化重组gAd蛋白,制备多克隆抗体。方法:以人基因组为模板,用PCR方法扩增人脂联素球状结构域(gAd)基因,构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经SDS-PAGE,免疫印迹法检测并鉴定表达产物,表达的目的蛋白用镍亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果:原核表达载体PET-28a(+)-gAd转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,获得gAd重组蛋白,免疫印迹证实能与抗his标签检测抗体结合,制备的多克隆抗体经间接ELISA法测得效价为1∶32 000。免疫印迹证实,抗血清不仅能特异性地识别gAd蛋白,还能识别脂联素蛋白,而不与非特异性蛋白结合。结论:成功构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,并表达、纯化重组蛋白gAd,制备的多克隆抗体特异性好,效价较高,为进一步的研究奠定了基础。     

荔枝果实中profilin的表达纯化及其与桦树花粉Bet v 2的交叉反应性研究

目的 表达和纯化荔枝果实profilin,并对其免疫学活性及交叉反应性进行研究.方法采用RT-PCR获得整个荔枝profilin的开放阅读框,将其与PET28a载体连接并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达,通过Ni2 亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用Western-blot检测其IgE结合活性,并通过ELISA抑制实验对其与桦树花粉profilin的交叉反应性进行研究.结果成功的构建了原核表达载体,并在大肠杆菌中大量的表达了荔枝profilin,纯化后的重组蛋白进行免疫印迹,结果显示15个荔枝过敏患者中有5个存在重组pofilin的特异性IgE抗体.ELISA抑制实验发现它们之间存在很高的交叉反应性.结论 成功的表达了荔枝profilin,经纯化后具有很好的免疫学活性,为进一步的深入研究奠定了基础.     

小鼠IL-33的原核表达、纯化及鉴定

目的: 在大肠杆菌中表达具有生物学活性的白细胞介素-33(mIL-33).方法: 用PCR技术扩增小鼠IL-33成熟蛋白的编码区, 与原核表达载体pET-44连接, 构建pET-44-mIL-33表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达, 镍柱亲和层析法纯化目的蛋白, SDS-PAGE分析表达产物, MTT法测定纯化IL-33的生物学活性.结果: 成功构建了pET-44-mIL-33原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达出可溶性mIL-33, SDS-PAGE分析纯化产物纯度为95%, 表达产量为95 mg/L.细胞增殖实验表明IL-33有抑制P815细胞增殖的活性.结论: 获得了有活性的重组IL-33蛋白纯品, 为后续功能研究奠定了基础.     

重阳木花粉相关变应原profilin基因的克隆、表达及免疫学鉴定

克隆、表达和纯化重阳木花粉相关变应原profilin基因,并对其免疫学活性进行鉴定。采用RT-PCR和3-’RACE技术获得整个profilin基因的开放阅读框,将其与PET28a载体连接并转化大肠杆菌E.cdiBL21(DE3)进行诱导表达,通过Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用Western blot检测其IgE结合活性。克隆获得了profilin的全长基因,开放阅读框为396个碱基(包括终止密码子),编码131个氨基酸。成功地构建了原核表达载体,并在大肠杆菌中大量地表达了profi-lin,纯化后的重组蛋白进行免疫印迹,结果显示重阳木花粉过敏患者血清对重组profilin反应呈阳性。     

小鼠FcγRⅢ原核表达、纯化及鉴定

目的: 制备纯化重组蛋白mFcγRⅢ,并鉴定其生物学活性.方法: 从克隆载体mRⅢ-T中扩增mFcγRⅢ胞外区,构建原核表达载体pETmRⅢ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot对重组表达蛋白进行鉴定;表达产物通过包涵体纯化后用稀释方法复性;ELISA检测复性蛋白活性.结果: 成功构建了重组表达质粒pETmRⅢ,纯化和复性了重组蛋白mFcγRⅢ;复性的重组蛋白mFcγRⅢ具有较强的体外活性.结论: 原核重组蛋白mFcγRⅢ复性后具有较强的体外结合配体特性,为探索重组蛋白治疗自身免疫病奠定了基础.     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达、纯化及免疫活性鉴定

目的表达、纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC并对其免疫活性进行鉴定。方法将含有ipaC基因的pET32a．ipaC表达质粒载体转入大肠杆菌BL21（kDE3）中表达，表达产物进行SDS—PAGE鉴定，并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统纯化IpaC蛋白；用纯化的蛋白免疫动物获得抗血清，Western-blot检测抗原的免疫活性。结果诱导后的表达产物经SDS—PAGE发现有一相对分子量约为63000的条带，其含量约占总蛋白量的11％，对融合蛋白进行纯化纯度可达90％以上，抗His的抗体Western-blot分析，发现特异性区带出现在63000u处，证明该蛋白是所要表达的融合蛋白，制备的免疫血清可与Ipac发生特异免疫反应。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后，可稳定、高效地表达毒力蛋白IpaC，且纯化后的蛋白具有免疫活性。     

人酪氨酸激酶6原核表达载体的构建、表达、纯化与鉴定

目的构建人络氨酸激酶6(PTK6)与His融合蛋白重组表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。方法通过PCR在编码PTK6的cDNA序列两端添加EcoR I和BamH I酶切位点,双酶切后将编码PTK6的cDNA序列亚克隆至原核表达载体PHUE构建重组蛋白表达载体PHUE/PTK。重组载体经鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞。IPTG诱导重组蛋白表达。收集菌体裂解后,用尿素洗涤和溶解包涵体。溶解上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化产物。结果成功构建人PTK6重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为55 000,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度大于80%的目的重组蛋白。结论人PTK6 His融合蛋白的纯化为多克隆及单克隆抗体的制备以及结构和功能的研究奠定了基础。     

猪囊尾蚴AgB基因的克隆表达及其免疫学特性分析

目的 克隆猪囊尾蚴 AgB 基因并在大肠杆菌中表达,为研制猪囊尾蚴病诊断试剂和基因工程疫苗奠定基础.方法 从猪囊尾蚴虫体中提取总 RNA,利用反转录聚合酶链式反应及重叠延伸 PCR 法扩增 AgB 完整序列,并克隆到原核表达载体 pGEX-4T-1,在大肠杆菌中诱导表达.通过 SDS-PAGE、Western-blotting检测AgB的表达和免疫反应活性.通过对包涵体的洗涤、纯化及变复性研究,纯化目的蛋白.采用ELISA法检测纯化蛋白检出猪囊尾蚴阳性血清率和免疫小鼠血清中抗猪囊尾蚴抗体的水平.结果 测序证实扩增出AgB基因序列并正确插入到原核表达载体.表达质粒在大肠杆菌BL21中高效表达.纯化的目的蛋白,具有良好的抗原性和免疫原性.结论 成功扩增了全长AgB基因并得到了高效表达,纯化了具有免疫性的重组蛋白,为进一步开展AgB的诊断试剂和重组疫苗研究奠定了基础.     

O型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白疫苗的构建、表达和纯化

目的 为了克服灭活口蹄疫病毒疫苗可能存在的传播病毒的潜在危险，构建一种能预防O型口蹄疫病毒感染的VPI表位重组蛋白疫苗。方法采用O型口蹄疫病毒（FMDV）表面VP1蛋白上的B细胞表位肽和T细胞表位肽，以PCR扩增和克隆连接等方法构建VP1表位六聚体重组蛋白（vP1epi）基因，并在大肠杆菌中进行诱导表达，镍亲和层析纯化。用ELISA法检测VPlepi免疫豚鼠血清中抗FMDV抗体的水平。结果构建了一种由FMDV表面vP1中B细胞表位肽重复六次的蛋白质多肽，采用pET28原核表达系统，在大肠杆菌BL21（DE3）中获得了高效表达，表达产量约占菌体蛋白的30％左右，经镍亲和层析后获得纯度高于90％的VP1表位重组蛋白。VP1epi免疫的豚鼠血清中含有一定量的抗FMDV抗体。结论VP1epi重组蛋白能诱导机体产生抗O型FMDV的抗体，说明这种重组蛋白可能成为预防O型FMDV感染的基因工程蛋白质疫苗。     

人TRIM 5α基因改构体的表达、纯化及其体外免疫活性研究

构建TRIM5α改构体TRIM5αH(R328-332)的原核表达载体pET28a。转化大肠杆菌BL21 codon plus(DE3),获得重组表达质粒pETTRIM5αH(R328 332),30℃下经IPTG诱导,该融合蛋白在大肠杆菌BL21 codon plus(DE3)中表达。获得的重组的蛋白再经过纯化,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白,并用免疫其沉淀和ELISA等对重组蛋白进行功能研究。结果构建的重组质粒在大肠杆菌中获得表达,经纯化后的重组pETTRIM5αH(R328 332)蛋白纯度可达90%以上,并且证实其在体外与HIV-1gag有结合作用。     

靶向EGFR二聚化界面的肿瘤多肽疫苗P64k-EGFR262-328的构建及免疫原性分析

目的 构建靶向EGFR二聚化界面的肿瘤多肽疫苗P64k-EGFR262-328并分析其免疫原性.方法 采用重叠延伸PCR来扩增P64k-EGFR262-328融合基因,克隆至pMD18-T,经测序鉴定后与pET-21b构建重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3).目的蛋白经IPTG诱导表达后用Source Q阴离子层析和Ni-NTA亲和层析纯化,纯化的融合蛋白乳化后免疫BALB/c小鼠分析其免疫原性.结果 获得了2031 bp的融合基因,IPTG诱导后获得了相对分子质量(Mr)70 000大小的目的蛋白,经两步柱层析后,融合蛋白达到了95％以上的纯度,并在小鼠体内产生了高达1:16 000以上的抗体滴度.结论 成功制备了肿瘤多肽疫苗P64k-EGFR262-328.     

Tat融合蛋白表达载体TAT-SOX2的克隆化及蛋白表达研究

目的 构建重组表达载体TAT-SOX2,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白.方法 经PCR获得编码人SOX2的全基因序列,连接到原核表达载体PET-28b-TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-SOX2,转化大肠埃希菌,IPTG诱导TAT-SOX2融合蛋白的表达.表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化融合蛋白,并应用Western Blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光检测融合蛋白转导HSF细胞的效果.结果 成功构建了TAT-SOX2融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白,Western Blot鉴定正确.免疫荧光提示融合蛋白可快速转导入HSF细胞内.结论 为进一步的通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供了物质基础.     

卡介苗HSP70的表达、纯化及活性检测

目的:在大肠杆菌中表达并纯化出具有良好生物学活性的卡介苗HSP70(BCG HSP70)蛋白.方法:利用PCR技术扩增出BCG HSP70的编码基因,将其克隆到pMD18-T载体,测序分析.再将该目的基因亚克隆至pET28a表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3),获得正确的阳性克隆子后,用IPTG诱导表达.纯化表达产物,SDS-PAGE及Western blot鉴定目的蛋白,并通过脾增生实验检测其生物学活性.结果:扩增的BCG HSP70基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致.表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr)约70 000处有表达条带.Western blot结果证实纯化产物在Mr约70 000处可见特异性条带.蛋白纯度约96.5%.脾细胞增生试验显示,该蛋白能够明显刺激鼠脾细胞增殖.结论:成功表达并纯化了具有良好生物学活性的BCG HSP70,为进一步研究BCG HSP70及BCG的功能奠定了基础.     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株,在大肠杆菌中表达UreB-Omp11融合蛋白,并检测其免疫学活性。方法:用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的ureB和omp11基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-omp11融合基因,将融合基因ureB-omp11插入原核表达载体pET30a( )、pET28a( )及pMAL-c2X中,筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达,采用Western blot对表达产物进行鉴定,并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,Western blot对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pET30a( )、pET28a( )与pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清和Hp阳性患者血清中的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在Mr134000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论:成功地构建并筛选出了HpMELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定

目的 构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定.方法 采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTA Agarose 纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17.IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体.结果 成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39 000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础.