PI3K阻断剂LY294002对TNF-α诱导心肌肥大的

目的　研究PI3K是否通过Ca²⁺-CaMKⅡ和CaN信号途径参与肿瘤坏死因子-α诱导的心肌肥大。方法　应用激光共聚焦显微镜检测单个心肌细胞内Ca²⁺浓度变化。Lowry法测心肌细胞蛋白含量。计算机图象分析测心肌细胞体积。应用Western　blot法测定心肌细胞CaMKⅡδB和CaN蛋白表达。结果　①PI3K阻断剂LY294002（50　μmol/L）明显抑制TNF-α（100　μg/L）诱导的心肌细胞内钙离子浓度增高（P<0.01）,对正常心肌细胞内Ca²⁺浓度无明显影响。其抑制程度与LY294002+2-APB　（30　μmol/L）组相近（P>0.05）,小于LY294002+ryanodine（50　μmol/L）组（P<0.05）。②LY294002明显抑制TNF-α诱导的心肌细胞蛋白含量的增加及细胞体积的增大;其程度与LY294002+2-APB无统计学差异,但大于单用2-APB组,小于LY294002+ryanodine组（P<0.05）。PI3K阻断剂LY294002明显抑制TNF-α诱导的心肌细胞CaMKⅡδB和CaN表达增加（P<0.01）,其抑制程度与LY294002+2-APB　组相近　（P>0.05）。结论　PI3K通过作用IP3R使心肌细胞内Ca²⁺浓度增加,进而调节心肌细胞内CaMKⅡδB和CaN的表达,从而参与TNF-α诱导的心肌肥大。     

钙离子在肿瘤坏死因子α诱导心肌肥大中的作用

目的 研究Ca2+在肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导心肌细胞肥大中的作用.方法 Lowry法测心肌细胞蛋白含量;计算机图像分析系统测心肌细胞体积;3H-亮氨酸掺入法测心肌细胞蛋白合成;Till阳离子测定系统观察胞内[Ca2+]i瞬变.结果 IP3R阻断剂2-APB(30 μmol/L)或RyR阻断剂ryanodine (50 μmol/L)能降低由TNF-α(100μg/L)诱导的心肌细胞蛋白合成、蛋白含量以及细胞体积增加,二者合用抑制作用更强.L型Ca2+通道阻断剂nifedipine(50 μmol)对上述反应无明显作用(P＞0.05).IP3R阻断剂2-APB(30μmol/L)或RyR阻断剂ryanodine(50 μmol/L)能降低由TNF-α(100 μg/L)诱导的心肌细胞内钙离子瞬变幅度增高,二者合用作用抑制更强.L型Ca2+通道阻断剂nifedipine(50μmol/L)对其无明显作用(P＞0.05).结论 TNF-α通过调节心肌细胞内钙离子浓度从而诱导心肌细胞肥大.而在此过程中TNF-α可能主要是通过作用IP3R和RyR促使胞内钙贮库Ca2+释放而引起胞内钙离子水平增高的,而非通过打开L型Ca2+通道.     

白藜芦醇抑制缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞凋亡的研究

目的探讨白藜芦醇对缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞(CMEC)凋亡的抑制作用及其可能的分子机制。方法体外培养大鼠CMEC,建立缺氧复氧损伤模型,随机分为对照1组、缺氧复氧1组、缺氧复氧+白藜芦醇组(白藜芦醇1组),白藜芦醇分别选择5、10、20、30及40μmol/L浓度,MTT法检测CMEC增殖能力。20μmol/L白藜芦醇为最适浓度,使用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002,后续实验又分为对照2组、缺氧复氧2组、缺氧复氧+白藜芦醇2组(白藜芦醇2组)、缺氧复氧+白藜芦醇+LY294002组(LY294002组)。PI-AnnexinⅤ检测CMEC的凋亡;Western blot法检测细胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达或磷酸化水平。结果与缺氧复氧1组比较,不同浓度白藜芦醇1组均可增加CMEC增殖能力,呈剂量依赖性,以白藜芦醇1组20μmol/L保护作用最显著(P<0.05)。与白藜芦醇2组比较,LY294002组CMEC凋亡率明显升高,磷酸化Akt和Akt蛋白、HIF-1α蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论白藜芦醇可显著抑制缺氧复氧诱导的CMEC凋亡,其机制可能与PI3K/Akt介导的HIF-1α上调相关。     

LY294002对人胃腺癌细胞株BGC-823糖酵解水平的影响及其机制探讨

背景:有氧糖酵解是肿瘤细胞的特征性表型之一,靶向糖酵解有望成为一种有效的肿瘤治疗策略。M2型丙酮酸激酶(PKM2)在肿瘤组织中呈高表达,参与肿瘤细胞的有氧糖酵解。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是调控肿瘤细胞糖酵解相关基因表达的重要转录因子,而PI3K信号在肿瘤细胞中可上调HIF-1α表达。目的:探讨PI3K特异性抑制剂LY294002对人胃腺癌细胞增殖和糖酵解水平的影响及其可能机制。方法:以不同浓度LY294002(10～100μmol/L)在不同条件下(常氧或缺氧)处理人胃腺癌细胞株BGC-823,CCK-8实验和流式细胞分析检测细胞增殖和细胞凋亡,蛋白质印迹法检测p-Akt、p-mTOR、HIF-1α、PKM2表达,比色法检测反映糖酵解水平的胞内乳酸脱氢酶活性和胞外乳酸浓度。结果:LY294002可呈浓度和时间依赖性地抑制BGC-823细胞增殖,在较高浓度时可诱导细胞早期凋亡。LY294002可呈浓度依赖性地抑制p-Akt、p-mTOR、HIF-1α表达,在较高浓度时可抑制PKM2表达,同时降低糖酵解水平。缺氧诱导可消除LY294002对HIF-1α、PKM2表达和糖酵解水平的抑制作用。结论:LY294002可通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制人胃腺癌细胞增殖及其糖酵解水平,而HIF-1α介导了糖酵解的抑制过程。     

LY294002对人肺腺癌A549细胞p-Akt、VEGF表达的影响

目的 探讨PI3K抑制剂LY294002对肺腺癌A549细胞p-Akt及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 不同浓度LY294002(5μmol/L、10 μmol/L、20μmol/L、40 μnol/L)处理肺腺癌A549细胞24h后,分别用免疫细胞化学法和Western印迹法检测p-Akt、VEGF蛋白表达.结果 P13K抑制剂LY294002可抑制肺腺癌A549细胞株细胞中p-Akt蛋白的表达,而且其表达呈浓度依赖型降低(r=-0.913,P＜0.05).LY294002也可抑制该细胞株中VEGF蛋白的表达,其表达也呈浓度依赖型降低(r=-0.969,P＜0.01).结论 LY294002可抑制p-Akt活性及下调VEGF蛋白的表达,该作用可能是PI3K抑制剂LY294002发挥抗癌作用及抗血管生成的机制之一.     

白藜芦醇对高糖诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9表达的影响及其作用机制的研究

目的探讨白黎芦醇(Res)对高糖诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响是否与PI3K/Akt信号通路有关。方法高糖体外培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,并应用Res和PI3K通路特异性抑制剂LY294002进行干预,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性,免疫组织化学法检测MMP-2、MMP-9表达,明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9活性,Western blot检测p-Akt、Akt蛋白表达。结果不同浓度Res(25、50、100μmol/L)和LY294002(10、20、30μmol/L)均可抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖(P0.05),且均呈剂量依赖性,还可抑制高糖诱导的MMP-2、MMP-9表达和活性(P0.05)。NC、HG、HG+LY294002(10、20、30μmol/L)组总Akt表达无明显改变,HG+Res(25、50、100μmol/L)组总Akt表达较HG组下降,但无剂量依赖性;而不同浓度的Res和LY294002可抑制高糖诱导的p-Akt表达(P0.05),且均呈剂量依赖性。结论 (1)高糖上调VSMCs MMP-2、MMP-9表达,加重VSMCs增殖;(2)Res可能通过抑制高糖激活的PI3K/Akt信号通路,下调VSMCs MMP-2、MMP-9表达并降低其活性,减轻高糖引起的VSMCs增殖。     

胰岛素的抗炎作用及其机制的研究

目的观察不同浓度胰岛素干预对脂多糖刺激的单个核细胞核因子抑制蛋白(IκB)、核转录因子κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的影响,同时在细胞水平对PI3K/Akt信号通路上关键分子P-Akt进行监测,探讨胰岛素的抗炎作用及可能机制。方法收集30例T2DM患者外周血各10ml,密度梯度法分离单核细胞,随机分5组进行干预培养,对照(Con)组、低浓度胰岛素100mU/L(L-Ins)组、低浓度胰岛素联合LY-294002 10μmol/L(L-Ins+LY)组、高浓度胰岛素1000mU/L(H-Ins)组、高浓度胰岛素联合LY-294002 10μmol/L(H-Ins+LY)组,每组设两个亚组。24h后加脂多糖100ng/ml继续培养,其中一个亚组采用Western blot测定P-Akt、IκBα、NF-κB蛋白的表达情况,另一亚组采用RT-PCR检测TNF-αmRNA水平。结果 L-Ins组、H-Ins组与Con组比较,P-Akt、IκB含量增加,NF-κB、TNF-αmRNA水平下降(P0.05);H-Ins组较L-Ins组作用更明显(P0.05);L-Ins组较低浓度L-Ins+LY组、H-Ins组较H-Ins+LY组P-Akt、IκB含量升高,NF-κB、TNF-αmRNA降低(P0.05);L-Ins+LY组、H-Ins+LY组与Con组P-Akt、IκB、NF-κB比较,差异无统计学意义(P0.05),TNF-αmRNA水平高(P0.05),L-Ins+LY组和H-Ins+LY组间比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论胰岛素有直接抗炎作用,其效应呈剂量相关性;胰岛素可能通过激活PI3K/Akt通路,增加IκB,影响NF-κB的状态,从而对炎性因子合成和分泌进行调节;在PI3K/Akt通路受阻时,胰岛素可能通过其他通路增加炎症因子的合成和分泌。     

钙神经素信号途径在前列腺素F2α诱导乳鼠心肌细胞肥大中的作用

目的:探讨Ca2 /钙调蛋白(CAM)依赖的钙神经素(CAN)信号途径在前列腺索F2α(PGF2α)诱导心肌细胞肥大中的作用.方法:用PGF2α(1 μmol/L,0.1μmol/L,0.01 μmol/L,0.001μmol/L)刺激Wistar乳鼠心肌细胞,并用CaN特异性抑制剂环胞素A(CsA)加以干预.以心肌细胞总蛋白含量和心肌细胞面积作为反映心肌肥大的指标,用免疫印迹(Western-blot)测定心肌细胞内CaN-α蛋白表达,用Fura 2/AM为荧光指示剂测定心肌细胞内游离钙浓度([Ca2 ]i).结果:除0.001μmol/L浓度的PGF2α外,1.0μmol/L,0.1μmol/L,0.01μmol/L的PGF2α均可明显提高心肌细胞内蛋白质浓度,而其中0.1μmol/L PGF2α作用最显著,增加了(67.78±11.19)%,并且使乳鼠心肌细胞面积增加了(68.94±1.52)%.0.1μmol/L PGF2α刺激的心肌细胞CaN-α蛋白表达增加和[Ca2 ]i提高,并且加入CsA可阻断0.1μmol/L PGF2α诱导的乳鼠心肌细胞肥大效应.结论:PGF2α可能通过Ca2 /CaM-CaN信号途径刺激乳鼠心肌细胞发生肥大.     

促红细胞生成素对乳鼠心肌细胞肥大及P13K/Akt-eNOS信号转导通路的影响

目的 探讨促红细胞生成素(EPO)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肥大心肌细胞的影响,以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)-内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号转导通路在其中的作用.方法 分离乳鼠心肌细胞,利用AngⅡ诱导建立心肌细胞肥大模型,以心肌细胞表面积和心钠素(ANF)mRNA表达作为心肌细胞肥大观察指标.观察不同浓度EPO对肥大心肌细胞的影响,并利用PI3K抑制剂LY294002和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME对其相关机制进行探讨,I司时对细胞培养液中一氧化氮(NO)浓度进行检测,蛋白免疫印迹法检测磷酸化Akt(p-Akt)、Akt、磷酸化eNOS(p-eNOS)和eNOS蛋白表达情况.结果 20 U/ml EPO能抑制由AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,表现为心肌细胞表面积和ANF mRNA表达均减少(P＜0.05).EPO能激活Akt,促进eNOS及p-eNOS表达增加(均P＜0.05),并使NO合成增加(P＜0.01).LY294002和L-NAME能逆转EPO的抗心肌细胞肥大作用,减少NO产最(P＜0.05).蛋白免疫印迹法榆测显示,LY294002能够抑制EPO对p-Akt、p-eNOS和eNOS蛋白表达的促进作用,而L-NAME能抑制eNOS的磷酸化(均P＜0.05).结论 EPO能够抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,该作用可能是通过激活P13K/Akt信号转导通路,促进eNOS表达与活化,从而促进NO的合成来实现的.     

黄芪抑制去甲肾上腺素诱导大鼠心肌细胞内游离钙含量升高的作用

目的 :研究黄芪对去甲肾上腺素 (NE)诱导大鼠心肌细胞内游离钙 [Ca2 + ]i 含量升高的作用。方法 :应用AR CM MIC阳离子检测系统 ,采用Ca2 + 指示剂Fura 2 /AM检测培养新生大鼠单个心肌细胞内游离钙的浓度 ,并观察Am对NE诱导大鼠心肌细胞内 [Ca2 + ]i 升高的影响。结果 :当细胞外Ca2 + 浓度为 1 .3mmol/L时 ,大鼠心肌细胞 [Ca2 + ]i 为 ( 97.1 1 +8.2 1 )nmol/L ,给予 1 0 -5mol/L的NE ,可使大鼠心肌细胞 [Ca2 + ]i 增至 ( 2 91 .73± 1 5 .0 3 )nmol/L,而经黄芪处理的大鼠心肌细胞的 [Ca2 + ]i则由 ( 95 .98±8.1 4)nmol/L增至 ( 1 1 4.2 8± 9.2 9)nmol/L。结论 :NE能诱导大鼠心肌细胞内游离钙含量明显升高 ,黄芪对心肌细胞静息 [Ca2 + ]i无明显影响 ,但能抑制NE诱导大鼠心肌细胞 [Ca2 + ]i 升高     

抑制PI3K/AKt信号通路对帕金森病炎症细胞模型反应的影响

目的探讨LY294002(LY)抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKt)信号通路后对帕金森病(PD)细胞模型中炎症反应的影响。方法体外培养小鼠小胶质瘤细胞(BV2),分为对照组、脂多糖(LPS)组、LY+LPS组及LY组。LPS刺激BV2细胞来诱导炎症反应,运用Western印迹检测PI3K/AKt信号通路标志物磷酸化(p)-AKt蛋白表达情况;LY抑制PI3K/AKt信号通路后,运用荧光定量PCR (Q-PCR)检测炎症因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α的mRNA的表达情况,Western印迹检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达情况。结果与对照组相比,LPS组p-AKt蛋白表达显著下降(P0.01);与LPS组相比,LY+LPS组p-AKt蛋白下降更明显(P0.01);与对照组相比,LPS组IL-1β、TNF-αmRNA及iNOS蛋白表达均显著升高(均P0.01);与LPS组相比,LY+LPS组中IL-1β和TNF-αmRNA及iNOS蛋白表达均显著下降(均P0.01)。结论 LY抑制PI3K/AKt信号通路对BV2细胞中的LPS诱导的炎症反应有一定的抑制作用。     

当归挥发油含药血清对肥大心肌细胞钙离子浓度的影响

目的:研究当归挥发油含药血清对肥大心肌细胞钙离子浓度的影响。方法:超临界萃取当归挥发油,制备含药血清。原代培养大鼠心肌细胞,血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导制备心肌细胞肥大模型,5%当归挥发油含药血清进行干预。以图像分析软件测量心肌细胞表面积,考马斯亮蓝法测定心肌细胞蛋白含量,Fluo-3测定肥大心肌细胞内Ca2+荧光强度变化。结果:AngⅡ组(10-7 mmol/L)心肌细胞表面积、蛋白含量均明显增加,与空白组相比(P0.05),心肌细胞肥大模型成功建立。5%当归挥发油含药血清处理组细胞内钙离子浓度明显下降,与AngⅡ组相比(P0.05),当归挥发油可减少AngⅡ(10-7 mmol/L)诱导的肥大心肌细胞内Ca2+的浓度。结论:当归挥发油含药血清可能对AngⅡ诱导的肥大心肌细胞具有钙通道阻滞的作用。     

肝细胞生长因子的抗鼠心肌细胞凋亡作用与抑制钙敏感受体有关

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)在缺血再灌注损伤中的抗细胞凋亡作用与钙敏感性受体(CaSR)mRNA表达下调的关系.方法 分离的新生鼠心肌细胞,随机分为对照组、模拟心肌缺血再灌注组(I/R组)、特异性CaSR激活剂GdCl3组(GdCl3组)、GdCl3+Na+/Ca2+交换抑制剂NiCl2+L-型钙通道阻滞剂CdCl2组(GdCl3+NiCl2+CdCl2组)、GdCl3+选择性PI3K阻断剂LY294002组(GdCl3+LY294002组)、GdCl3+肝细胞生长因子HGF组(GdCl3+HGF组)、GdCl3+HGF+LY294002组.新生鼠心肌细胞经缺氧处理后在缺血缓冲液中培养2 h,然后在标准培养液中培养24 h,建立模拟心肌缺血再灌注(I/R)模型.TUNEL法检测各组心肌细胞凋亡情况.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定各组CaSR mRNA表达.Western blot测定促凋亡蛋白Caspase-3,抗凋亡蛋白Bcl-2和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K).结果 模拟的I/R增强了CaSR mRNA的表达(I/R组:2.62±0.41,对照组:1.00±0.31,P＜0.01)及心肌细胞的凋亡[I/R组:(15.32±2.54)%,对照组:(2.90±1.45)%,P＜0.01].GdCl3进一步增强了CaSR mRNA的表达(GdCl3组:4.46±0.62,I/R组:2.62±0.41,P＜0.01)及心肌细胞的凋亡[GdCl3组:(25.36±2.60)%,L/R组:(15.32±2.54)%,P＜0.01],同时上调了Caspase-3(GdCl3组:1.93±0.28,I/R组:1.50±0.21,P＜0.01),下调了Bcl2的表达(GdCl3组:0.82±0.18,I/R组:1.71±0.30,P＜0.01),抑制了PI3K的磷酸化(I/R组:0.87±0.08,GdCl3组:0.61±0.07,P＜0.01).GdCl3+LY294002组心肌细胞凋亡率显著高于GdCl3组[(32.60±3.42)%比(25.36±2.60)%,P＜0.01],但两组间CaSR mRNA的表达差异无统计学意义.HGF通过抑制Caspase-3(GdCl3+HGF组:1.12±0.23,GdCl3组:1.93±0.28,P＜0.05;GdCl3+HGF+LY294002组:1.87±0.31,GdCl3+LY294002组:3.86±0.47,P＜0.05)和促进Bcl-2的表达(GdCl3+HGF组:2.56±0.54,GdCl3组:0.82±0.18,P＜0.05;GdCl3+HGF+LY294002组:1.68±0.28,GdCl3+LY294002组:0.68±0.13,P＜0.05)减少了I/R和GdCl3诱导的心肌细胞凋亡[GdCl3+HGF组:(11.8±1.89)%,GdCl3组:(25.36±2.60)%,P＜0.05],同时促进了PI3K的磷酸化(GdCl3+HGF组:2.87±0.21,GdCl3组:0.61±0.07,P＜0.05;GdCl3+HGF+LY294002组:2.01±0.14,GdCl3+LY294002组:0.44±0.10,P＜0.05)、下调了CaSR mRNA的表达(GdCl3+HGF组:1.46±0.37,GdCl3组:4.46±0.62,P＜0.01).结论 HGF对心肌细胞的保护作用在I/R诱导的新生鼠心肌细胞凋亡中至少部分与抑制CaSR mRNA表达、促进PI3K的磷酸化途径活化从而下调Caspase-3和上调Bcl-2有关.     

骨髓间充质干细胞来源外泌体通过PI3K/Akt途径减轻过氧化氢诱导心肌细胞损伤

目的 研究骨髓间充质干细胞(BMMSC)来源外泌体通过PI3K/Akt途径减轻过氧化氢(H2 O2)诱导心肌细胞损伤.方法 培养心肌H9c2细胞,采用0.5 mmol/L H2 O2诱导心肌细胞损伤,给予BMMSC来源外泌体、对照溶剂二甲基亚砜或PI3K抑制剂LY294002干预,检测细胞存活率、凋亡率及Bcl-2、B...     

胡椒碱对缺氧复氧心肌细胞的保护作用及机制研究

目的探讨胡椒碱(piperine,PIP)对缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)心肌细胞的保护作用及对磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路影响。方法分离培养原代心肌细胞,随机分为3组(n=3):对照组、H/R组、H/R+PIP处理组。4 h缺氧联合6 h复氧构建H/R损伤模型,在机制探讨中给予PI3K/AKT抑制剂(LY294002)干预。以心肌细胞存活率与心肌损伤酶浓度评估细胞损伤程度;促炎症标志物(IL-6/TNF-α)检测评估炎症反应;超氧化物歧化酶(SOD)/丙二醛(MDA)浓度检测氧化应激反应;流式细胞术评估细胞凋亡;Western blotting检测相关蛋白表达。结果 (1)与H/R组相比,H/R+PIP处理组心肌细胞活性增加而乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶浓度降低,差异有统计学意义(均P0.05)。(2)与H/R组相比,H/R+PIP处理组能够显著抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡、炎症与活性氧反应,表现为凋亡率、促炎症介质、丙二醛浓度降低而超氧化物歧化酶酶活性升高,差异有统计学意义(均P0.05)。(3)在机制探讨中我们观察到,PIP能够上调PI3K/AKT磷酸化水平,而抑制PI3K/AKT通路后PIP的心肌细胞保护功能被逆转(均P0.05)。结论 PIP主要通过PI3K/AKT依赖性途径改善心肌细胞H/R损伤。     

IGF-1经PI3K/Akt依赖性途径保护TNF-α诱导的大鼠心肌细胞损伤

目的观察胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理的大鼠心肌细胞存活率的影响,并探讨其与PI3K/Akt通路的关系。方法心脏逆行灌流胶原酶消化方法分离大鼠的心肌细胞培养1 d后,分为对照组、TNF-α组、IGF-1＋TNF-α组以及IGF-1＋TNF-α＋LY294002组。光学显微镜下观察心肌细胞形态学变化,并用2,3-二苯基溴化四唑（MTT）法测定细胞的存活率。结果心肌细胞活数OD值在TNF-α组较对照组明显降低;IGF-1＋TNF-α组明显高于TNF-α组,与对照组比较无统计学差异;IGF-1＋TNF-α＋LY294002组明显低于IGF-1＋TNF-α组,与TNF-α组比较无统计学差异。结论IGF-1保护TNF-α诱导的大鼠心肌细胞凋亡,这种保护作用经PI3K/Akt通路依赖性机制。     

人参皂苷Rb1通过抑制PI3K/AKT信号通路保护脂多糖诱导的心肌细胞炎症反应

目的探究人参皂苷Rb1在脂多糖(LPS)诱导的H9C2心肌细胞炎症反应中的作用及分子机制。方法建立LPS诱导的H9C2心肌细胞炎症反应模型。在用1μg/ml的LPS诱导H9C2心肌细胞炎症反应前,使用100μM人参皂苷Rb1或1μM PI3K抑制剂Wortmannin预处理1 h,2 h后收集细胞样本。利用q PCR检测白介素-6(IL-6),白介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的m RNA表达水平;用ELISA试剂盒检测细胞上清IL-6,IL-1β,TNF-α的蛋白表达;用WB实验检测p-AKT和AKT的表达水平。结果人参皂苷Rb1显著抑制LPS诱导的IL-6,IL-1β,TNF-α的m RNA(P0.001)和蛋白(P0.001)表达水平;人参皂苷Rb1显著抑制LPS诱导的PI3K/AKT信号通路的激活(P0.001);PI3K抑制剂Wortmannin也能显著抑制LPS诱导的p-AKT表达水平以及IL-6,IL-1β,TNF-α的m RNA(P0.001)和蛋白(P0.001)表达水平。结论人参皂苷Rb1通过抑制PI3K/AKT信号通路阻止LPS诱导的心肌细胞炎症反应。     

PNU上调大鼠皮质星形胶质细胞内源性Cryab抑制Aβ聚集

目的探讨PNU激活星形胶质细胞α7胆碱能受体(α7 n AChRs)上调内源性B-晶状体蛋白(Cryab)并抑制β淀粉样蛋白(Aβ)集聚的现象及其机制。方法分离24 h内新生乳鼠大脑皮质培养原代星形胶质细胞并鉴定;体外制备Aβ_(1~42)寡聚体;将细胞分为对照组、PNU组、PNU+α7 n AChRs阻断剂(MLA)组、Aβ_(1~42)组、PNU+Aβ_(1~42)组、PI3K信号通路阻断剂LY294002+PNU+Aβ_(1~42)组。用蛋白印迹法检测细胞内Cryab、P-Akt(ser473)、Aβ寡聚体的表达水平。结果 (1)PNU可以显著上调星形胶质细胞内源性Cryab蛋白(P0.05);应用MLA阻断α7 n AChRs后,PNU上调内源性Cryab蛋白的作用被显著抑制(P0.05);使用LY294002阻断PI3K信号通路后,PNU上调内源性Cryab蛋白的作用被显著抑制(P0.01);(2)PNU能够显著上调磷酸化Akt蛋白水平(P0.05);应用MLA阻断α7 n AChRs后,PNU上调磷酸化Akt蛋白的作用被显著抑制(P0.01);使用LY294002阻断PI3K信号通路后,PNU上调磷酸化Akt蛋白的作用被显著抑制(P0.01);(3)在细胞裂解液及培养基中,PNU显著增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制作用(P0.01);使用LY294002阻断PI3K信号通路后,PNU增强星形胶质细胞抑制Aβ聚集的功能显著减弱(P0.01)。结论PNU通过激活星形胶质细胞α7 n AChRs上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚;PI3K/Akt信号通路可能参与PNU激活星形胶质细胞α7 n AChRs上调内源性Cryab蛋白抑制Aβ集聚的过程。     

CormⅡ对脓毒症血小板α颗粒释放的影响及作用机制

目的探讨外源性一氧化碳释放分子(Corm)Ⅱ对脓毒症时血小板α颗粒(PLT-α)释放的影响及作用机制。方法采集健康供血者空腹外周静脉血并分离血小板,通过脂多糖体外诱导建立脓毒症血小板异常活化模型。分为空白对照组、脂多糖组、无活性CormⅡ组、10μmol/L和30μmol/L CormⅡ组,另再设PKCδ抑制剂(LY317615)组(10μmol/L脂多糖+100 nmol/L LY317615)、CormⅡ+LY317615组(10μmol/L脂多糖+30μmol/L CormⅡ+100 nmol/L LY317615)。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血小板衍生因子(PDGF)-bb、基质金属蛋白酶(MMP)-2含量,流式细胞术检测血小板P选择素表达;免疫荧光法检测PLT-α分布;Western印迹法检测血小板关键信号分子PKCδ、MUNC18a的表达。结果脂多糖诱导后PLT-α释放的PDGF-bb、MMP-2及血小板P选择素表达水平均明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P0.05);无活性CormⅡ组PLT-α内容物释放及血小板P选择素表达水平与脂多糖组之间差异无统计学意义(P0.05);CormⅡ诱导后,PLT-α释放的PDGF-bb、MMP-2明显减少,血小板P选择素表达水平明显降低且呈剂量依赖性。脂多糖诱导后中央区的PLT-α逐渐向血小板磷脂膜区转移,与磷脂膜融合后释放到血小板外;无活性CormⅡ组与脂多糖组PLT-α分布情况相似;CormⅡ诱导后血小板α颗向血小板膜汇聚明显减少。脂多糖诱导后血小板p-PKCδ、p-MUNC18a的相对表达量明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);LY317615组、CormⅡ组、CormⅡ+LY317615组板p-PKCδ、p-MUNC18a的相对表达量与脂多糖组和无活性CormⅡ组相比明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论 CormⅡ可通过释放的CO活化PKCδ/MUNC18a信号通路,抑制脓毒症时PLT-α的异常释放,减弱脓毒症损伤。     

氯喹对脂多糖诱导的Ⅱ型肺泡细胞损伤的影响

目的:探究氯喹(chloroquine,CQ)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致Ⅱ型肺泡(alveolar typeⅡ, AT2细胞株损伤的影响。方法:用不同浓度LPS和CQ分别单独处理AT2细胞,用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞活力以筛选LPS和CQ的作用浓度。根据细胞处理情况将实验分为对照组(不做任何处理的细胞)、LPS组、CQ组和CQ+LPS组4组。用蛋白质印迹法检测各组裂解的胱天蛋白酶3、Bcl-2、Bax的表达和Akt的磷酸化水平。之后增加磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/Akt信号通路抑制剂LY294002与LPS和CQ共同处理细胞,即LPS+CQ+LY294002组,通过蛋白质印迹法检测裂解的胱天蛋白酶3、Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果:用终浓度为1、10和50 mg/L的LPS作用24 h,当LPS浓度为50 mg/L时,AT2活力下降显著(P0.05),故选择该浓度的LPS构建脓毒症细胞损伤模型。用终浓度0.5μmol/L和5μmol/L CQ作用4 h时,AT2细胞活力无明显改变(P0.05),当CQ浓度达10μmol/L,AT2细胞活力开始下降,浓度越高,细胞活力下降越明显,故选择5μmol/L的CQ作为治疗浓度。用50 mg/L的LPS刺激后,细胞内裂解的胱天蛋白酶3表达增高,Bcl-2/Bax比值及Akt蛋白磷酸化减少;在加入5μmol/L的CQ后,裂解的胱天蛋白酶3含量下降,Bcl-2/Bax比值和Akt蛋白磷酸化显著增加;当加入LY294002后,CQ的作用被消除,Bcl-2/Bax比值减少,裂解的胱天蛋白酶3表达增高。结论:5μmol/L的CQ可以通过激活PI3K/Akt信号通路,抑制细胞线粒体凋亡,减轻LPS诱导的AT2细胞损伤。