补体系统在异种移植中作用的研究进展

补体系统在异种移植超急性排斥反应中的作用已基本被阐明。通过转基因方法使猪血管内皮细胞表达人补体调节蛋白，可以避免发生异种移植超急性排斥反应。但移植过程中的缺血再灌注损伤却不可避免，补体介导的血管内皮细胞激活可以引起急性血管性排斥反应，并影响移植物的长期存活。本文就补体系统在异种移植领域的研究进展作一综述。     

人血清对猪血管内皮细胞的细胞毒效应研究

目的 探讨异种(猪/人）超急性排斥的发生机制。方法 人血清为天然抗体和补体源。用四唑盐法行补体依赖的细胞毒反应，建立体外超急性排斥模型。结果 正常人血清能溶解猪血管内皮细胞；而Clg缺乏及B因子缺乏的人血清对猪血管内皮细胞的溶解率较低(P＜0．01)；同种猪血清及灭活补体的人血清不溶解猪血管内皮细胞；将经典或旁路途径有缺陷的人血清等体积混合，其细胞毒作用恢复正常。结论 治疗猪/人之同的超急性排斥应考虑补体旁路途径激活的问题。     

补体系统在异种移植中作用的研究进展

补体系统在异种移植超急性排斥反应中的作用已基本被阐明。通过转基因方法使猪血管内皮细胞表达人补体调节蛋白,可以避免发生异种移植超急性排斥反应。但移植过程中的缺血再灌注损伤却不可避免,补体介导的血管内皮细胞激活可以引起急性血管性排斥反应,并影响移植物的长期存活。本文就补体系统在异种移植领域的研究进展作一综述。     

异种移植排斥机理的探讨

补体的激活是超急性排斥的中心环节,为了研究经典及旁路途径在这种排斥中的作用,本研究建立了体外超急性排斥模型.选择猪血管内皮细胞为靶,人血清为天然抗体和补体源,用四唑盐法(methyl thagolyl tetragoliam,MTT)行补体依赖的细胞毒反应(complement-dependent cytotoxicity,CDC).人血清能溶解58±5%的猪血管内皮细胞.加入EGTA阻断经典途径后人血清的溶细胞率降为51±3%(P<0.01).同样Clq缺乏的人血清仅溶解37±7%猪血管内皮细胞(P<0.001).人血清50℃加热20min,阻断旁路途径后,其溶细胞率降为42±5%(P<0.001).B因子缺乏的人血清(阻断旁路途径)仅溶42±10%的猪血管内皮细胞(P<0.001)同种猪血清及加热灭活补体的人血清不溶猪血管内皮细胞.将经典途径及旁路途径缺陷的人血清等体积混合,血清的细胞毒作用恢复正常.同样,Clq缺乏人血清和B因子缺乏人血清分别加入Clq和B因子后,血清细胞毒作用亦恢复正常.在这一体外异种超急性排斥模型中,补体经典和旁路两条途径均参与超急性排斥反应.提示抑制猪/人之间的超急性排斥应考虑补体两条途径均激活的问题.     

转人CRP基因在异种移植中的研究

目的：研究转入补体调节蛋白（CRP）DAF、MCP和CD59基因对抑制人补体激活从而克服超急性排斥反应的作用。方法：利用显微注射建立转人衰变加速因子（hDAF)小鼠和猪的模型和转梁hMCP及hCD59真核表达质粒的猪内皮细胞（EC）,研究小鼠和猪EC表达抑制人补体激活的人补体调节蛋白（CRP）对异种移植超急性排斥反应的抑制作用。结果（1）转人DAF基因小鼠心脏用新鲜人血连续丛外灌注,转基因组心脏搏动时间（174．6min)比对照组（106．5min)明显延延长。（2）转hDAF基因猪心脏异位移植给猕猴、移植心最长存活90h,受者死亡前移植心仍有功能,移植心病理检查未见超急性排斥反应病理改变。（3）转DAF基因基因猪EC死亡率在不同浓度血清时均明显低于对照组,在转hDAF基因猪EC上再分别转染hMCP及hCD59真核表达质粒,转hDAF hMCP或hDAF hCD59在不同血清浓度时EC死亡率较单纯hDAF组明显下降（P＜0．05）。结论,转人DAF及MCP、CD59补体调节蛋白基因能克服人对异种器官或组织的超急性排斥反应。     

异种移植排斥机理的探讨

补体的激活是超急性排斥的中心环节，为了研究经典及旁路途径在这种排斥中的作用，本研究建立了体外超急性排斥模型。选择猪血管内皮细胞为人靶，人血清为天然抗体和补体源，用四唑盐法（ＭＴＴ）行补体依赖的细胞毒反应（ＣＤＣ）。人血清能溶解５８±５％的猪血管内皮细胞。加入ＥＧＴＡ阻断经典途径后人血清的溶细胞率降为５１±３％（Ｐ〈０．０１）。同样Ｃｌｑ缺乏的人血清仅溶解３７±７％猪血管内皮细胞（Ｐ〈０．００１）。     

异种移植超急性排斥机理的实验研究

为了研究补体经典和旁路途径在超急性排斥中的作用，选择猪血管内皮细胞为靶，人血清为天然抗体和补体源，用四唑盐法（MTT）行补体依赖的细胞毒反应（CDC）。人血清能溶解（58±5）％的猪血管内皮细胞；加入乙二醇四乙酸阻断经典途径后人血清的溶细胞率降为（51±3）％（P＜0．01）；入血清50℃加热20分钟，阻断旁路途径后，其落细胞率降为（42±5）％（P＜0．01）；将经典途径和旁路途径分别被阻断的人血清混合，血清的细胞毒作用恢复正常。在这一体外超急性排斥模型中，补体经典和旁路两条途径均参与超急性排斥。提示抑制猪-人之间的超急性排斥应考虑补体旁路途径激活的问题。     

猪到猕猴异种心脏移植超急性排斥反应的免疫学及病理学变化

目的观察猪到猕猴异种心脏移植超急性排斥反应时的免疫学及病理学变化。方法采用猪到猕猴腹腔内异位心脏移植模型,检测发生超急性排斥反应者的血液中补体、天然抗体及T淋巴细胞亚群的变化,并对移植心脏进行免疫组化(测定C3、C4、C5b9、IgG及IgM的沉积)及病理学分析。结果发生超急性排斥反应时,血清补体C3、C4的含量、总补体活性及抗猪内皮细胞天然抗体均有一定程度的下降;CD4 /CD8 T淋巴细胞的比率也有所下降;移植心脏中均有补体C3、C4、C5b9的沉积,IgG及IgM也均有沉积,但IgG和IgM沉积强度的差异无统计学意义;病理学改变主要为心肌间质弥漫性出血、水肿,毛细血管内普遍淤血。结论补体通过经典途径激活参与猪到猕猴异种心脏移植超急性排斥反应;超急性排斥反应时受者血中天然抗体水平明显下降;CD4 T淋巴细胞可能参与异种移植超急性排斥反应过程并有所消耗;发生超急性排斥反应的移植物突出病理表现为间质出血。     

异种肝移植中补体作用及抑制策略

近 40年来 ,随着同种肝移植的巨大成功 ,供肝短缺的问题日益突出。异种移植作为较有希望的解决途径之一 ,得到越来越多的重视。但阻碍异种肝移植临床实施的首要障碍即是超急性排斥反应 (ＨＡＲ)。大量的研究表明 ,补体在ＨＡＲ发生中起着重要作用 ;而抑制补体激活可以阻止ＨＡＲ ,尤其是转人补体调节蛋白 (ｈＣＲＰ)基因的动物的出现 ,更使人们看到了征服ＨＡＲ的光明前景。这里 ,将近年补体在异种肝移植中超急性排斥反应中的作用及其防治策略的进展作一综述。一、补体在超急性排斥反应发生中的作用及激活途径1.补体在超急性排斥反应发生中…     

猪血管内皮细胞与人血清反应早期PGI2和TXA2的变化

目的 探讨在猪与人异种移植超急性排斥反应中血管内皮细胞的作用。方法 用体外培养的猪血管内皮细胞和不同人的血清共同反应,建立猪与人异种移植超急性排斥反应的体外实验模型。用放射免疫法检测上清液中前列环素（ＰＧＩ２）和血栓素Ａ２（ＴＸＡ２）的稳定代谢产物（ＰＧＦ１α和ＴＸＢ２）含量,将其作为评定血管内皮细胞激活和损伤的标志。结果 各组血清与猪血管骨皮细胞反应０．５ｈ后,正常人血清组ＰＧＦ１α／ＴＸＢ２比     

人衰变加速因子基因在猪血管内皮细胞中的表达

目的 通过转基因方法使猪的血管内皮细胞表达人DAF蛋白，抑制猪供人移植超急性排斥反应。方法 体外培养猪腹主动脉内皮细胞，用透射电镜方法进行鉴定。脂质体转染法将含有人DAF基因的真核表达载体PSFFV－DAV转染进猪的血管内皮细胞，经G418筛选（浓度为100mg/L)12d，获得具有抗性的克隆，进而增殖，传代，保种。通过流式细胞仪检测转染细胞DAF的表达情况。结果 转染了基因的细胞与未转染基因的细胞在流式细胞仪检测中其莹光强度分别为82.18和1.69。转染的细胞5代后其荧光强度为71.96。结论 转染了人DAF基因的细胞荧光强度明显高于对照组。导入的外源基因在细胞内能高效、稳定地表达，为转基因猪的建立奠定一定的基础。     

抗人C5单克隆抗体对补体介导的超急性排斥反应的抑制作用

目的 研究抗人C5单克隆抗体对补体介导的超急性排斥反应的抑制作用.方法 获取8例临床心脏移植供者的主动脉血20ml和主动脉血管,分别用于提取淋巴细胞和主动脉内皮细胞.同时,采集相应8例心脏移植受者移植前的中心静脉血20 ml和外周静脉血5 ml,分别用于提取淋巴细胞和制备补体.供者主动脉内皮细胞经培养后,依次加入供、受者淋巴细胞混合培养上清50μl和受者静脉血浆(含补体)20 μl,建立主动脉内皮细胞超急性排斥反应模型.模型建立后,将供者主动脉内皮细胞平均分为2组,C5组:加入20 mg/L的抗人C5单克隆抗体20μl;对照组:加入M200培养液20 μl.经台盼蓝染色,倒置显微镜下观察主动脉内皮细胞的染色情况及活性,并测定主动脉内皮细胞刺激指数(SI).结果 经观察,对照组大部分主动脉内皮细胞蓝染、肿胀死亡,而C5组大部分主动脉内皮细胞未见蓝染,存活良好;对照组和C5组吸光度值分别为1.528±0.046和1.644±0.058,两组比较,差异有统计学意义(P<0.001),SI为1.076±0.038.结论 在离体主动脉内皮细胞超急性排斥反应模型中,抗人C5单克隆抗体可以抑制补体介导的主动脉内皮细胞溶解.     

RNA干涉α-1,3-半乳糖转移酶对猪内皮细胞免疫和生理功能的影响

目的 通过RNA干涉沉默猪内皮细胞内α-1,3-半乳糖转移酶(α-1,3GT)基因,观察基因沉默对猪内皮细胞免疫和生理功能的影响.方法 提取原代猪主动脉内皮细胞,并通过SV40LT基因转染构建永生化猪主动脉内皮细胞系.用含猪α-1,3GT干涉基因的慢病毒载体转染细胞,并检测α-1,3GT和α-1,3-半乳糖抗原(α-1,3Gal)的表达情况.将转染后细胞与正常人血清共培养,建立异种移植免疫排斥反应的细胞模型并通过四甲基偶氮唑盐、流式细胞术、免疫组织化学及免疫荧光技术检测基因沉默对内皮细胞免疫和生理功能的影响.结果 永生化前后,细胞的免疫和生理功能无明显变化.RNA干涉后,永生化细胞表达α-1,3GT及α-1,3Gal明显减少.与人血清共培养后,转染组细胞增殖速度较高,凋亡率较低,与人免疫球蛋白IgM、IgG及人补体C3和C5b-9结合较对照组及错配组减少.结论 通过沉默α-1,3GT基因可降低猪内皮细胞与人免疫球蛋白、补体的结合程度.该基因沉默后的内皮细胞可作为异种移植急性排斥反应细胞模型和研究平台.     

转人CD59基因的猪胚胎成纤维细胞的建立

补体介导的超急性排斥反应(HAR)是异种移植成功应用的主要障碍。CD59 是一种补体活化调控蛋白,具有良好的抗超急性排斥反应作用。通过对猪胚胎成纤维细胞进行基因修饰,体细胞克隆,有希望克服上述问题。材料与方法一、猪胚胎的获取孕30 d实验用猪(购自中国农业科学院实验站)     

肝移植免疫排斥反应的发生及危险因素分析

肝移植免疫排斥反应特点肝移植免疫排斥反应根据发生时间及病理特点分为超急性免疫排斥反应、急性排斥反应和慢性排斥反应3种。超急性免疫排斥反应发生于肝移植后数小时至数天,由受体已存在的抗体与移植物内皮细胞抗原决定族结合介导的。如受体中抗体滴度高,移植物血流一经建立,就可引起移植物广泛坏死;如抗体滴度不够高,则受体免疫细胞恢复分泌抗体功能,数天后产生大量特异抗体与内皮细胞结合,促使补体黏附,产生血栓和使血管痉挛的多肽,使内皮细胞破坏、血管阻塞,并刺激内皮细胞产生粘附分子,促进炎性细胞浸润[1]。急性排斥反应多见于术后5…     

清除补体避免猪到猕猴异种心脏移植超急性排斥反应的实验研究

目的 观察纯化的眼镜蛇毒因子(CVF)对猪到狱猴异种心脏移植超急性排斥反应的影响。方法 以幼猪为供者，施行猪到狱猴腹腔内异位心脏移植，实验组(n＝4)使用CVF完全清除受者体内补体，对照组(n＝5)不使用CVF，两个组术后均采用环抱素A、甲泼尼龙和环磷酰胺抑制排斥反应，通过检测血清C3、C4水平及总补体活性验证CVF的效果，移植心停跳时切取移植心进行病理检查。结果 在使用CVF后，实验组血清C3降为0，总补体活性CH50值也几乎为0，末发现明显毒副反应，移植猪心存活时间平均为lld，最长达13d，病理学提示均发生了延迟性异种排斥反应；对照组3个移植心在移植后60min内发生超急性排斥反应，另2个分别存活22h及6d。结论 纯化的CVF有良好的清除补体的作用，且末见明显副作用；使用CVF可克服猪到狱猴异种心脏移植超急性排斥反应的发生。     

猪血管内皮细胞α-Gal对人外周血淋巴作用初探

超急性排斥反应克服后，异种移植物将面临血管性和细胞性排斥。血管内皮是免疫排斥的主要场所，异种移植免疫中血管内皮细胞的作用以及其携带的αＧａｌ在超急性排斥后免疫反应中的作用研究尚少。通过混合淋巴细胞反应（ＭＬＲ），以同种异体ＭＬＲ为对照，对异种（内江猪→人）外周血淋巴细胞（ＰＢＬＣ）混合反应和内江猪血管内皮细胞（ＰＡＥＣ）人ＰＢＬＣ混合反应进行研究，同时考察α半乳糖基酶消化后ＰＡＥＣ对人ＰＢＬＣ的刺激性。结果表明：异种ＭＬＲ增殖较相应的同种异体ＭＬＲ弱，可能与在异种周围淋巴细胞ＭＬＲ中以间接呈递为主有关；ＰＡＥＣ作为刺激细胞的ＭＬＲ增殖极强，可能与ＰＡＥＣ本身是抗原呈递细胞且抗原呈递以直接呈递为主有关；αＧａｌ引起增殖，可能与其在体内数量多、与生物大分子结合可成为全抗原有关，提示该抗原可能也是超急性排斥后排斥反应的靶抗原；去除ＰＡＥＣ表面αＧａｌ后，仍可诱发人Ｔ细胞反应，提示可能还存在其它超急性排斥后抗原。     

转人α-1,2岩藻糖苷转移酶基因在异种移植中的研究

目的 研究转人α-1，2岩藻糖苷转移酶基因（HT）在克服超急性排斥反应（HAR）中的作用。方法 通过脂质体转染将人HT基因转入猪血管内皮细胞（PIECs）中，利用显微注射建立转HT基因小鼠模型，经流式细胞仪检测转HT基因阳性的PIECs表面抗原及小鼠外周血单核细胞表面抗原的变化。结果 转HT基因的PIECs表面的α-1，3半乳糖（α-Gal）比阴性对照下降了50％～60％，H抗原由无表达到44％～78％表达阳性；转HT基因小鼠白细胞表面的α-Gal比阴性对照下降了63％左右，H抗原阳性表达率为95％以上。结论 HT基因在细胞和小鼠体内均有较好的表达，可减少异种抗原与异种抗体的反应，在克服超急性排斥反应中能发挥一定的作用。     

肾脏移植

会议交流了肾脏移植领域基础和临床研究方面的进展。本次会议共选肾移植论文 12 7篇 ,其中基础研究 2 6篇 ,临床 10 1篇 ,包括移植领域的各个方面。一、异种移植暨南大学郭泽雄和苏泽轩进行了中华眼镜蛇毒抑制豚鼠至大鼠异种肾移植超急性排斥反应的实验研究。天津医科大学张泽报告了异种器官移植用血管内皮细胞特异表达人ＤＡＦ重组基因载体构建的研究 ,提供了ＤＡＦ人重组基因转基因动物的模型。上海华山医院丁强等建立了猪 -犬异种肾移植动物模型 ,并在超急性排斥反应中测定了穿孔素ｍＲＮＡ的表达。王熹等观察了异种肾移植间接体内模型中…     

水苏糖对模拟异种心脏移植超急性排斥反应的抑制作用

目的观察水苏糖对猪到人异种心脏移植超急性排斥反应的抑制作用。方法以人血液体外灌注猪游离心脏为基础，模拟猪到人异种心脏移植的超急性排斥反应模型。实验分为A、B两组：即分别用人血液灌注及人血液加水苏糖灌注猪离体心脏。观察灌注后两组心脏的跳动时间；体外灌注1h后，对两组灌注心脏进行免疫组织化学（测定IgG及IgM的沉积）及病理学分析。结果A组灌注心脏平均跳动时间为（9．5±2．5）min；B组灌注心脏平均跳动时间为（46．8±8．1）min，其中有1个心脏在灌注的1h内一直跳动；两组心脏跳动时间比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。A组心肌间质呈弥漫性出血、水肿，血管扩张，内皮细胞肿胀、坏死；免疫组织化学检查显示心肌血管内皮组织中有IgG及IgM沉积。B组心肌间质未见出、凝血和坏死，血管内皮细胞未见肿胀；免疫组织化学检测未见IgG及IgM沉积。结论水苏糖对异种心脏移植超急性排斥反应具有抑制作用。