RNA干扰抑制ABCG2表达对子痫前期滋养细胞分泌hCG的影响

目的:应用RNA干扰技术,使胎盘滋养细胞ATP结合匣式转运子G2(ABCG2)基因表达沉默,检测干扰前后ABCG2的表达及人绒毛膜促性腺激素β亚单位(β-hCG)水平变化,研究ABCG2的表达对子痫前期滋养细胞分泌β-hCG功能的影响。方法:通过小干扰RNA(siRNA)预测工具确定3个ABCG2基因的siRNA靶位点,合成3对互补的短发夹RNA(shRNA)序列转化质粒,选取干扰有效的质粒包装慢病毒后感染原代培养正常及子痫前期胎盘滋养细胞,应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)及蛋白质印迹(Western blotting)检测干扰前、后滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测干扰前、后不同分化状态细胞上清液中的β-hCG水平。结果:有效的RNA干扰后滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达明显降低,无论干扰前、后子痫前期滋养细胞hCG分泌都高于正常,干扰后滋养细胞分泌hCG水平降低。结论:siRNA可有效干扰滋养细胞ABCG2基因的表达,ABCG2基因表达沉默后胎盘滋养细胞hCG分泌下降,推测子痫前期ABCG2表达升高可通过促进滋养细胞分泌hCG抑制子痫前期的发展。     

p70S6K在小鼠受精卵第一次有丝分裂周期中的表达

目的:研究p70S6K在小鼠受精卵第一次有丝分裂周期中的表达。方法:采用Westernblot和RT-PCR方法,检测在小鼠受精卵第一次有丝分裂的G1、S、G2以及M期中p70S6K在mRNA水平以及蛋白水平的表达。结果:在mRNA水平,p70S6K的表达在各期无明显变化,在蛋白水平,磷酸化状态的p70S6K在S期升高,表明从S期p70S6K的活性升高。结论:p70S6K在小鼠卵子受精后磷酸化程度增加,因而有可能参与了小鼠受精卵的早期发育。     

PKC、PKB通过p21~(CIP1/WAF1)蛋白对小鼠受精卵G2期向M期转换的影响

目的:探讨在小鼠受精卵中,PKC及PKB是如何通过p21CIP1/WAF1蛋白影响小鼠受精卵G2/M的转换。方法:以小鼠受精卵为材料,通过Westernblot及免疫荧光的方法,检测经PKC及PKB抑制剂处理后的p21蛋白表达及定位。结果:经PKC抑制剂(PMA)处理后的小鼠G2期受精卵中p21蛋白表达增加,而经PKB抑制剂(LY294002)处理后的p21蛋白表达没有变化,但是其在亚细胞的定位发生了改变。结论:PKC通过改变p21蛋白表达,影响小鼠受精卵G2/M转换。而PKB通过改变p21蛋白在小鼠受精卵中的亚细胞定位,影响受精卵G2/M转换。     

CDC25B蛋白S149/S321位点突变对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响

目的:研究小鼠CDC25B蛋白S149位点对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响及S149位点与S321位点的关系。方法:构建pBSK-CDC25B-S149A和pBSK-CDC25B-S149A/S321A突变体,体外转录成mRNA;采用小鼠超排卵技术取G1期受精卵,显微注射CDC25B-WT-mRNA和突变CDC25B-S149A-mRNA、CDC25B-S149A/S321A-mRNA,观察其对受精卵发育、M期促进因子(MPF)活性及CDC2-pTyr15磷酸化状态的影响。结果:CDC25B-S149A-mRNA注射组受精卵卵裂率明显高于CDC25B-WT-mRNA注射组,MPF活性提前1 h达到高峰;而联合突变体CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组卵裂率又显著高于CDC25B-S149A-mRNA注射组。结论:在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,蛋白激酶A(PKA)对小鼠CDC25B蛋白S149位点的磷酸化修饰是控制受精卵G2/M转换的重要方式,并且S149位点与S321位点可能具有协同作用。     

RNAi沉默CD147基因对卵巢癌细胞HO-8910pm生物学行为的影响

目的:采用RNA干扰(RNA interference,RNA i)技术,利用构建的稳定转染CD147 shRNA表达质粒载体的HO-8910pm/pGE-1 CD147shRNA细胞株观察卵巢癌细胞系HO-8910pm CD147基因的沉默作用及生物学效应。方法:用免疫细胞化学法、激光共聚焦检测HO-8910pm细胞CD147的表达;MTT法绘制细胞生长曲线,观察裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的成瘤性。结果:pGE-1CD147shRNA转染人卵巢癌细胞系后,CD147的表达受到高效且特异的抑制,细胞侵袭力减弱,荷瘤裸鼠成瘤力下降,抑瘤率达58.8%(P<0.01)。结论:RNA i沉默CD147基因可影响卵巢癌的侵袭和成瘤,有可能成为治疗卵巢癌的新途径。     

Girdin蛋白在小鼠受精卵微丝聚集调控作用的初步研究

目的:探讨Girdin蛋白在调控小鼠受精卵早期发育微丝聚集中的作用。方法:采用免疫荧光染色观察Girdin蛋白和F-actin在小鼠受精卵中的共定位情况。激光共聚焦显微镜观察Girdin表达敲低后小鼠受精卵分裂形态及分裂率。结果:在小鼠受精卵中存在Girdin蛋白并且Girdin蛋白与F-actin存在共定位。敲低Girdin蛋白的表达,小鼠受精卵出现不规则分裂,10μmol/L Girdin si RNA处理组小鼠受精卵有28.93%到达2-细胞期,而注射20μmol/L Girdin si RNA组小鼠受精卵只有15.1%到达2-细胞期。并且Girdin表达敲低的受精卵微丝不能正确聚集。结论:Girdin蛋白在调控小鼠受精卵早期分裂微丝聚集中发挥作用。     

RNAi沉默STAT3基因对人宫颈癌SiHa细胞定植和侵袭的影响

目的：探讨信号转导因子与转录激活因子3（STAT3）短发夹RNA（shRNA）真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞定植和侵袭能力的影响。方法：针对人STAT 3的基因设计并合成编码小干扰RNA（siRNA）的寡核苷酸,克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒中,构建STAT 3基因shRNA真核表达质粒,脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）法分别检测STAT 3基因的mRNA及蛋白表达水平;软琼脂克隆形成实验和体外侵袭实验检测SiHa细胞的定植和侵袭能力。结果：构建的STAT 3基因shRNA真核表达载体成功地转染人宫颈癌SiHa细胞,细胞STAT3蛋白及mRNA表达均下降（P ＜0.05）;SiHa细胞在软琼脂中形成的克隆数和穿透Matrigel膜的细胞数均明显减少（P ＜0.05）。结论：STAT 3基因shRNA真核表达载体通过下调STAT 3基因表达,抑制宫颈癌细胞的定植和侵袭能力。     

FLAG-PIPP~(H557A)在小鼠1-细胞期受精卵中对PKB/Akt表达的调节作用

目的:研究富含脯氨酸的肌醇多磷酸5-磷酸酶(proline-rich inositol polyphosphate 5-phosphatase,PIPP)在组氨酸557位点突变为丙氨酸(FLAG-PIPPH557A)时对小鼠受精卵中磷酸化苏氨酸蛋白激酶(pAkt)的影响。方法:将FLAG-PIPPH557A、FLAG-PIPP以及FLAG vector重组质粒转染到小鼠受精卵,用蛋白印记、免疫荧光染色以及活性检测方法分析FLAG-PIPPH557A对小鼠受精卵中丝氨酸(Ser)473位点磷酸化的苏氨酸蛋白激酶(pAkt Ser473)表达、定位以及活性的影响。结果:FLAG-PIPPH557A在小鼠受精卵中对pAkt Ser473的表达和活性的调节作用明显低于FLAG-PIPP的作用,两者间有显著差异(P<0.001);而且在小鼠受精卵中FLAG-PIPPH557A不能调节pAktSer473在细胞膜的定位。结论:PIPPH557A在小鼠1-细胞期受精卵中可以通过改变PIPP的活性,影响pAkt Ser473的表达、定位以及活性。     

Plk1通过调节CDC2 Tyr15磷酸化参与小鼠受精卵G_2/M期的转换

目的:探讨在小鼠受精卵中Plk1是如何通过CDC2蛋白影响小鼠受精卵的发育。方法:采用Westernblotting方法和RNAi干涉方法,检测经Plk1抑制剂和siRNA处理后CDC2Tyr15磷酸化水平变化及对受精卵分裂的影响。结果:经Plk1抑制剂和siRNA处理后CDC2Tyr15磷酸化水平提高,同时受精卵分裂受到明显的抑制。结论:在小鼠受精卵中Plk1通过磷酸化CDC2Tyr15来调节小鼠受精卵的早期发育.     

蛋白激酶B(AKT)抑制剂对小鼠1-细胞期胚胎分裂的影响

目的:研究蛋白激酶B(AKT)在小鼠1-细胞期受精卵中的作用。方法:激酶活性分析检测2种AKT的抑制剂在小鼠1-细胞期胚胎中对MPF活性的调节;G2/M期的细胞计数检测AKT抑制剂对小鼠1-细胞期胚胎细胞分裂的影响;Western blotting检测AKT抑制剂对小鼠1-细胞期胚胎中pCDC2Tyr15的去磷酸化状态的改变。结果:AKT抑制剂抑制了MPF活性、G2/M期的转换,pCDC2Tyr15的去磷酸化状态。结论:AKT存在于小鼠1-细胞期胚胎中并通过调节MPF活性和pCDC2Tyr15的去磷酸化状态调节细胞分裂的进程。     

14-3-3蛋白在小鼠受精卵及2-细胞期胚胎中的表达与定位

目的:研究小鼠受精卵及2-细胞期胚胎中14-3-3蛋白的表达及亚细胞定位。方法:采用Western blot方法鉴定小鼠受精卵和2-细胞期胚胎14-3-3蛋白的表达,利用间接免疫荧光技术观察其在细胞中的定位。结果:在小鼠受精卵和2-细胞期胚胎中,全部表达14-3-3蛋白,并且为同一亚型;14-3-3蛋白主要定位于受精卵的细胞质及2-细胞期胚胎中的细胞质和细胞核。结论:14-3-3蛋白正常表达于小鼠受精卵及2-细胞期胚胎中,其定位可能影响胚胎的早期发育。     

抑制VEGF-B表达对人绒毛膜癌裸鼠移植瘤影响的研究

目的:研究RNA干扰下调血管内皮生长因子-B(VEGF-B)表达对人绒毛膜癌裸鼠移植瘤生长、侵袭转移及血管生成的影响。方法:将构建的含VEGF-B shRNA的质粒转染人绒毛膜癌细胞JEG-3,建立裸鼠皮下移植瘤模型。观察shRNA干扰VEGF-B表达对JEG-3裸鼠移植瘤生长及侵袭转移能力的影响,并采用免疫组化技术检测移植瘤组织中VEGF-B的表达变化及其所含CD34标记的肿瘤微血管密度(MVD)的差异。结果:(1)抑制VEGF-B表达可减小裸鼠皮下肿瘤大小(P0.05),并降低肿瘤细胞肺转移的发生率(P0.05);(2)免疫组化结果提示,VEGF-B shRNA转染组移植瘤中VEGF-B表达及MVD均低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);(3)相关性分析显示,VEGF-B蛋白表达水平与绒毛膜癌MVD高低成正相关。结论:VEGF-B基因在绒毛膜癌的体内生长、侵袭转移中起重要作用,shRNA下调其表达能抑制绒毛膜癌细胞的体内生长、侵袭转移,可能与其调控瘤组织内的微血管形成有关。     

HLA-G短干扰RNA真核表达载体的构建及其在JEG-3细胞株中抑制HLA-G表达的研究

目的:构建HLA-G短干扰RNA表达质粒及探讨HLA-G的功能。方法:根据siRNA设计的原则,结合pSilencer2.1-U6-neo质粒的特点,针对HLA-G基因设计并合成两对寡聚DNA片段,退火后将其克隆入pSilencer2.1-U6-neo,将重组真核表达质粒pSi-lencer2.1-U6-neo-HLA-G采用脂质体法转染JEG-3绒癌细胞株。应用RT-PCR、W estern-blot等方法检测转染的JEG-3细胞中HLA-G基因的表达水平;MTT法检测转染后JEG-3细胞增殖的变化。结果:RT-PCR和W estern-blot结果均表明瞬时转染重组pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒明显抑制了JEG-3细胞中HLA-G基因的表达。实验组JEG-3细胞生长较对照组明显受到抑制。结论:pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒构建成功,可下调JEG-3细胞中HLG的表达,抑制绒癌细胞生长。     

靶向Akt1的siRNA抑制卵巢癌细胞系生长的体外研究

目的:探讨靶向Akt1的siRNA抑制人卵巢癌细胞系SKOV3的Akt1表达后,对细胞增殖和侵袭的抑制作用。方法:将Akt1特异性siRNA转染人卵巢癌细胞系SKOV3,Real-time PCR检测Akt1 mRNA表达,Western blot和免疫荧光技术检测Akt1、Akt2、PI3Kp85α和Ki-67的蛋白表达;MTT法和Annexin V标记评价其对细胞增殖活性和凋亡的影响,流式细胞法分析细胞周期变化,Transwell法分析对侵袭能力的影响。结果:转染Akt1 siRNA后可明显下调Akt1 mRNA表达;Akt1、PI3Kp85α、Akt2和Ki-67蛋白的表达水平均明显降低(P<0.01);卵巢癌细胞增殖活性明显降低,细胞周期出现G0/G1阻滞,并诱发细胞凋亡,细胞侵袭能力减弱(P<0.01)。结论:靶向Akt1的siRNA可显著抑制卵巢癌细胞Akt1的表达,进而抑制肿瘤细胞的生长和侵袭,有望成为卵巢癌基因治疗的分子靶点。     

雌激素通过FTO基因调控子宫内膜癌细胞的增殖活性

目的:探讨雌激素对子宫内膜癌细胞系ishikawa细胞中肥胖相关基因FTO表达的调控机制以及对增殖的影响。方法:RT-PCR及细胞免疫荧光法检测不同浓度雌激素处理后ishikawa细胞中FTO表达水平的变化,PCR方法检测雌激素是否通过PI3K/AKT和MAPK信号通路对FTO进行调控,应用siRNA干扰法和MTT分析法检测FTO基因对细胞增殖的影响。结果:(1)不同浓度雌激素均可上调ishkawa细胞中FTO mRNA的表达,以10-9mol/L作用最明显,与对照组的差异有统计学意义(P<0.05);(2)E2+LY294002、E2+U0126组FTO mRNA表达水平比单独加雌激素组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),E2+LY294002+U0126联合加通路抑制剂组比E2+LY294002、E2+U0126单独加通路抑制剂组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);(3)siFTO干扰组FTO mRNA表达水平比阴性对照组明显降低,干扰效率达40%(P<0.05),FTO被干扰后,细胞的增殖活性受到明显的抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:雌激素通过受PI3K/AKT和MAPK信号通路调控的FTO基因调控细胞的增殖活性。     

RNA干扰技术抑制卵巢癌细胞系SKOV3.ip1细胞内Her-2/neu基因表达的研究

目的 探讨卵巢癌细胞株SKOV3．ip1细胞转染表达短发卡状RNA（shRNA）的质粒后，SKOV3．ip1细胞中Her-2／neu基因表达的变化，和对SKOV3．ip1细胞凋亡的影响。方法 将针对Her-2／neu基因的shRNA表达载体转染SKOV3．ip1细胞，从mRNA水平、蛋白表达水平和细胞凋亡的变化三个方面评价shRNA表达载体对Her-2／neu基因表达的抑制作用。结果shRNA表达载体可以有效的抑制SKOV3．ip1细胞Her-2／neu基因的表达，使Her-2／neu基因的mRNA和蛋白表达量明显下降，细胞凋亡增多。结论靶向Her-2／neu的shRNA表达载体可以有效抑制Her-2／neu基因的表达。     

针对ATM的短发夹RNA增强宫颈癌细胞放疗敏感性的实验研究

目的:观察人宫颈癌SiHa细胞ATM基因沉默对放疗敏感性的影响。方法:电穿孔法将针对ATM的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的重组真核表达质粒pSuppressorNeo-ATM转染宫颈癌SiHa细胞,G418筛选建立稳定转染株;RT-PCR、Western- blot检测ATM基因表达抑制情况。用FCM分析细胞凋亡率,细胞集落形成实验检测肿瘤细胞集落形成能力,观察细胞对放疗的敏感性。结果:ATM基因在稳定转染靶细胞中的表达受到明显抑制,成功的建立了ATM低表达宫颈癌细胞模型。与亲代细胞相比,放疗作用下SiHa~(ATM)细胞凋亡率明显增加(P<0.05),克隆形成率显著减少(P<0.01)。结论:针对ATM的shRNA能显著增强宫颈癌细胞对放疗的敏感性,两者联合作用能更大程度地杀灭肿瘤细胞。     

稳定转染短发夹状RNA后子宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因表达的变化

目的探讨宫颈癌细胞株HeLa细胞稳定转染表达短发夹状RNA(shRNA)的质粒后,HeLa细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因(HPV18E6)表达的变化。方法实验组将本实验室前期构建的可遗传性表达HPV18E6shRNA的pE6-1shRNA质粒和含E6基因突变点的pE6-2shRNA质粒分别转染HeLa细胞,对照组以空质粒pSUPER和不加质粒的脂质体分别转染HeLa细胞。稳定转染后,氨基糖苷抗生素(G418)筛选阳性细胞克隆,RT-PCR技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法分别检测HeLa细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达的变化。结果稳定转染后,G418筛选,实验组HeLa细胞有新的阳性细胞克隆形成,而对照组HeLa细胞最终全部死亡。实验组转染pE6-1shRNA质粒的HeLa细胞中HPV18E6mRNA表达水平为0·76±0·28,明显低于对照组转染脂质体者(1·14±0·45)和转染pSUPER质粒者(1·12±0·23,P<0·05);HeLa细胞中HPV18E6蛋白阳性表达强度较对照组转染脂质体者弱。实验组转染pE6-2shRNA质粒的HeLa细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达水平分别与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0·05)。结论稳定转染表达HPV18E6shRNA的质粒后,宫颈癌细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达明显受到抑制。     

14-3-3蛋白在小鼠受精卯及2-细胞期胚胎中的表达与定位

目的：研究小鼠受精卵及2-细胞期胚胎中14-3-3蛋白的表达及亚细胞定位。方法：采用Western blot方法鉴定小鼠受精卵和2-细胞期胚胎14-3-3蛋白的表达，利用间接免疫荧光技术观察其在细胞中的定位。结果：在小鼠受精卵和2-细胞期胚胎中，全部表达14-3-3蛋白，并且为同一亚型：14-3-3蛋白主要定位于受精卵的细胞质及2-细胞期胚胎中的细胞质和细胞核。结论：14-3-3蛋白正常表达于小鼠受精卵及2-细胞期胚胎中，其定位可能影响胚胎的早期发育。