早期自然流产患者绒毛KiSS-1、MMP-9和MMP-2基因及其蛋白表达

目的研究早期自然流产患者绒毛肿瘤转移抑制基因KiSS-1与基质金属蛋白酶(MMP-9、MMP-2)mRNA及蛋白的表达,探讨其与自然流产的关系。方法采用半定量RT-PCR、免疫印迹法检测30例正常早期妊娠和30例早期自然流产患者绒毛KiSS-1、MMP-9和MMP-2的mRNA及蛋白水平,用明胶酶谱分析法检测上述样本孵育液MMP-9、MMP-2的酶活性。结果(1)自然流产患者绒毛组织中MMP-9及MMP-2mRNA表达水平低于正常早期妊娠组(P<0.05),KiSS-1mRNA的表达高于正常早期妊娠组差异有统计学意义(P<0.05);(2)Westernblotting分析显示自然流产患者绒毛MMP-9、MMP-2蛋白表达低于正常早期妊娠差异有统计学意义(P<0.05),KiSS-1蛋白表达高于正常早期妊娠差异有统计学意义(P<0.05);(3)明胶酶谱分析结果显示,自然流产患者绒毛MMP-9、MMP-2酶活性低于正常早期妊娠者差异有统计学意义(P<0.05)。结论自然流产患者绒毛促浸润基因MMP-9、MMP-2mRNA及其蛋白表达水平降低,同时抑制浸润基因KiSS-1mRNA及其蛋白表达增加,造成滋养细胞浸润能力下降,可能与自然流产的发生有关。     

自然流产患者绒毛组织PAI-14G/5G多态性和uPA基因的表达及其意义

目的:探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)4G/5G多态性和纤溶酶原激活剂(uPA)与自然流产的关系及其在妊娠中的作用。方法:正常早孕(对照组)人工流产和自然流产(实验组)稽留流产的绒毛组织各30例,应用免疫组织化学PV法检测绒毛组织中PAI-1和uPA蛋白表达情况,等位基因特异性-PCR(AS-PCR)法检测PAI-1 4G/5G多态性的表达情况,RT-PCR法检测uPA mRNA表达情况。结果:①PAI-1蛋白主要在绒毛组织的滋养细胞质中表达,其表达对照组低于实验组(P<0.05)。uPA与PAI-1蛋白在细胞中分布一致,其表达水平对照组高于实验组(P<0.05)。②PAI-1 4G/4G基因型和4G等位基因表达水平对照组低于实验组(P<0.05),uPA mRNA表达水平对照组高于实验组(P<0.05)。③PAI-1和uPA蛋白在自然流产患者绒毛组织中的表达呈负相关(r=-0.639)。结论:PAI-1 4G/5G多态性和uPA异常表达可能与自然流产的发生有关。     

MMP-9在绒毛外滋养细胞诱导内皮细胞凋亡中作用的研究

目的:探讨绒毛外滋养细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达对血管内皮细胞凋亡的影响。方法:MMP-9的siRNA转染绒毛外滋养细胞株(TEV-1),利用实时定量逆转录-聚合酶链反应(real time RT-PCR)和ELISA法检测转染前后细胞中MMP-9、FasL基因及蛋白表达的变化;通过trans well共培养技术,研究滋养细胞对内皮细胞凋亡的影响。结果:(1)MMP-9 siRNA转染后24h,滋养细胞MMP-9 mRNA的表达较对照组明显降低(P0.05),而FasL mRNA表达与对照组无明显差异(P0.05);转染后48h,细胞培养液中MMP-9蛋白及FasL蛋白表达均较对照组显著降低(P0.05);(2)与未转染者比较,转染MMP-9 siRNA的滋养细胞与内皮细胞共培养48h后,内皮细胞凋亡率显著降低,差异有显著性(P0.05)。结论:绒毛外滋养细胞表达MMP-9的水平影响其诱导内皮细胞凋亡的作用,此作用可能与MMP-9调节FasL蛋白的分泌表达有关。     

sgp190与白血病抑制因子对滋养层细胞金属蛋白酶-9及抑制因子-1表达的影响

目的:探讨sgp190与白血病抑制因子(LIF)在妊娠维持中的作用。方法:体外培养滋养层细胞,分别施加LIF和/或sgp190处理后,用RT-PCR法检测金属蛋白酶-9(MMP-9)与金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)mRNA表达情况,免疫印迹法检测细胞MMP-9与TIMP-1蛋白表达水平,ELISA法测定培养上清中MMP-9与TIMP-1的浓度。结果:LIF抑制体外培养滋养层细胞中MMP-9与TIMP-1中mRNA和蛋白表达(P<0.05),而sgp190可抑制LIF的这种作用。sgp190促进MMP-9mRNA与蛋白的表达(P<0.05),但对TIMP-1mRNA与蛋白表达无影响。ELISA分析结果基本与RT-PCR和免疫印迹分析结果相同。结论:LIF和sgp190可能通过调节MMPs和TIMPs表达来影响滋养层细胞的侵袭,而sgp190在LIF功能活性调节中扮演着一定角色。     

同型半胱氨酸对滋养细胞基质金属蛋白酶2、9表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸（Hcy）对早孕期滋养细胞基质金属蛋白酶（MMP）2、9表达的影响及其在子病前期发病过程中的作用。方法分离培养早孕期滋养细胞,用Hcy刺激早孕期滋养细胞48h,对照组Hcy刺激浓度为0mmol／L,实验组的刺激浓度为1mmol／L;以实时荧光定量RT-PCR检测早孕期滋养细胞MMP-2、MMP-9mRNA的表达变化;明胶酶谱分析法测定早孕期滋养细胞MMP-2、MMP-9酶活性变化,以积分吸光度值表示。结果实验组与对照组比较,早孕期滋养细胞MMP-2mRNA表达降低21％,MMP-9mRNA表达降低11％;实验组与对照组比较,MMP-2蛋白表达降低14％,MMP-9蛋白表达降低52％。结论Hey能够抑制早孕期滋养细胞MMP02、MMP-9的表达,从而影响滋养细胞侵袭性。     

白血病抑制因子对人早孕滋养细胞MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的调节

目的:研究白血病抑制因子(LIF)对人早孕滋养细胞基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)和MMPs组织抑制物(TIMP-1)表达的影响。方法:以不同浓度的LIF作用于体外培养的细胞滋养细胞,于2h、4h、12h收集细胞。用RT-PCR方法检测MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA的表达。结果:LIF对人早孕滋养细胞MMP-2和TIMP-1 mRNA的表达无明显作用。LIF作用4h和12h,实验组MMP-9 mRNA明显上升(P<0.01),并呈明显剂量依赖关系。结论:LIF可以在一定的时间和剂量范围内促进滋养细胞MMP-9的表达。推测LIF可能通过节制性调节MMPs的表达,进而分解子宫内膜细胞外基质,介导滋养细胞的入侵。     

子痫前期患者滋养细胞浸润相关基因mRNA及蛋白表达的研究

目的研究子痫前期患者胎盘滋养细胞基质金属蛋白酶(MMP)9、2及其组织抑制物(TIMP)1、2,肿瘤转移抑制基因KiSS-1 mRNA、蛋白的表达变化及其与子痫前期发病的关系。方法采用RT-PCR、免疫印迹(western blot)法对30例正常足月妊娠妇女(正常妊娠组)和10例妊娠期高血压患者(高血压组)及27例子痫前期(子痫前期组)患者胎盘滋养细胞中MMP-9、MMP-2、KiSS-1、TIMP-1和TIMP-2基因mRNA及蛋白表达水平[均以相对吸光度(A)表示]进行检测;应用明胶酶谱分析法,检测3组妇女胎盘孵育液MMP-9、MMP-2活性。结果(1)胎盘滋养细胞浸润相关基因mRNA表达水平:子痫前期组MMP-9、MMP-2 mRNA表达水平分别为0．39±0．05和0．71±0．16,均明显低于正常妊娠组的0．78±0．11和1．63±0．31,两组分别比较,差异有统计学意义(P均<0．05)。高血压组MMP-9 mRNA的表达水平明显高于重度子痫前期患者,差异有统计学意义(P<0．05)。子痫前期组胎盘滋养细胞KiSS-1 mRNA和TIMP-1 mRNA的表达水平分别为1．97±0．21和1．11±0．18,均明显高于正常妊娠组的0．69±0．27和0．65±0．19,差异均有统计学意义(P<0．05);高血压组胎盘滋养细胞KiSS-1 mRNA表达水平低于子痫前期组,但与正常妊娠组比较,差异无统计学意义(P>0．05)。重度子痫前期患者胎盘滋养细胞TIMP-2 mRNA表达水平明显高于正常妊娠组,差异均有统计学意义(P<0．05)。(2)胎盘滋养细胞浸润相关基因的蛋白表达水平:子痫前期组MMP-9、MMP-2基因的蛋白表达水平分别为1．07±0．35和0．74±0．23,均明显低于正常妊娠组的2．43±0．92和1．48±0．78,差异均有统计学意义(P<0．05)。子痫前期组胎盘KISS-1和TIMP-1蛋白表达水平分别为2．46±0．39和1．51±0．40,均明显高于正常妊娠组的0．91±0．35和0．93±0．56,差异均有统计学意义(P<0．05)。子痫前期组胎盘滋养细胞TIMP-2蛋白表达水平与正常妊娠组及高血压组比较,差异均无统计学意义(P>0．05)。(3)胎盘MMP-9和MMP-2酶比活性:子痫前期组分别为(2．67±0．53)和(1．13±0．28)灰度·g-1·L-1,均明显低于正常妊娠组的(8．44±3．70)和(3．87±1．43)灰度·g-1·L-1,差异均有统计学意义(P<0．05)。结论子痫前期患者胎盘滋养细胞促进浸润基因。MMP-9、MMP-2表达降低和抑制浸润基因KiSS-1和TIMP-1表达升高,可能在子痫前期胎盘缺血缺氧中起重要作用。     

miR-18a对人正常滋养细胞中MMP-2、MMP-9表达的影响

目的:研究子痫前期(pre-eclapmpsia,PE)相关微小RNA-18a(miR-18a)对人正常滋养细胞(HTR-8细胞)中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9的影响。方法:按照HTR-8细胞中miR-18a的表达情况分为3组(每组重复5次):miR-18a过表达组、miR-18a抑制组、阴性对照组;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测转染后HTR-8细胞中miR-18amRNA的表达量;RT-qPCR和蛋白质印迹(Western blotting)检测转染后HTR-8细胞中MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达量。结果:miR-18a过表达组miR-18amRNA表达量比阴性对照组升高,miR-18a抑制组miR-18amRNA表达量比阴性对照组降低,差异均有统计学意义(均P<0.001)。miR-18a抑制组MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达量比阴性对照组降低,差异均有统计学意义(均P<0.001)。结论:miR-18a影响人正常滋养细胞中MMP-2、MMP-9在mRNA及蛋白水平的表达,可能通过该途径参与对滋养细胞浸润能力的调控。     

早期自然流产患者绒毛Notch受体mRNA和蛋白表达及与妊娠关系的初步探讨

目的:初步探讨早期自然流产患者绒毛Notch受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)mRNA及蛋白表达及对滋养细胞的调控作用。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术和免疫印迹法检测6例自然难免流产患者和12例正常早期妊娠妇女绒毛Notch1、Notch2、Notch3、Notch4的mRNA和蛋白的表达水平。结果:(1)自然流产组绒毛Notch1和Notch3 mRNA表达水平高于正常早期妊娠组(P<0.05);(2)Western-blot检测显示早期自然流产患者绒毛中Notch1、Notch2、Notch3受体蛋白的表达水平高于正常早期妊娠组(P<0.05)。结论:Notch受体蛋白在早期自然流产患者绒毛中表达上调,可能与自然流产的发病原因有关。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ及其配体对早期细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9表达的调控

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(PPARγ)及其配体(15-脱氧-前列腺素J2,15-d-PGJ2)对细胞滋养细胞表达基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的调控作用。方法:采用免疫荧光细胞化学方法检测细胞滋养细胞中PPARγ的表达;利用免疫荧光共聚焦技术观察15-d-PGJ2作用前后细胞滋养细胞MMP-2和MMP-9表达强度的变化;通过荧光定量PCR(Real-timePCR)和Westernblot方法定量检测MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表达变化。结果:在细胞滋养细胞中有PPARγ蛋白表达,且主要定位在细胞滋养细胞核中;15-d-PGJ2作用后细胞滋养细胞中MMP-2和MMP-9的表达明显下降,与对照组相比差异显著(P<0.01);15-d-PGJ2对MMP-2的作用强于MMP-9。结论:PPARγ及其配体15-d-PGJ2调节滋养细胞浸润作用可能是通过调节MMP-2和MMP-9的表达实现的。     

胎盘绒毛血管生成状况及VEGF、MMP-2和MMP-9表达与早期自然流产的关系

目的:探讨VEGF、MMP2和MMP9表达变化对胎盘绒毛血管生成的影响及与早期自然流产的关系。方法:选用CD34作为微血管标记物,应用免疫组化检测30例早期自然流产病例(自然流产组)和20例早期人工流产病例(人工流产组)胎盘绒毛微血管密度(MVD);RT-PCR检测胎盘绒毛VEGFmRNA的表达;酶谱分析法测定MMP-2和MMP-9的表达。结果:自然流产组VEGF121mRNA表达及MVD均明显低于人工流产组(P<0.01)。相关分析显示,两组中VEGF121mRNA相对表达量与MVD值均呈显著正相关(rθ=0.9794,rλ=0.9183)。自然流产组酶原型MMP-9的表达量显著低于人工流产组(P<0.01),激活型MMP-2的表达量显著高于人工流产组(P<0.01)。结论:孕期胎盘绒毛内VEGF121mRNA低表达所致的血管生成障碍以及MMP-2和MMP-9表达失调可能共同参与了早期自然流产的发生发展过程。     

KISS-1及MMP-9在子宫内膜异位症患者异位及在位内膜的表达及意义

目的:探讨KISS-1及MMP-9在子宫内膜异位症患者在位及异位内膜组织的表达及意义。方法:用免疫组化方法检测46例患者异位子宫内膜组织及其中16例在位内膜组织和33例正常子宫内膜组织中KISS-1及MMP-9的表达情况。结果:KISS-1在子宫内膜异位症患者异位/在位内膜及正常子宫内膜组织中阳性表达率分别为30.43%、31.25%和63.64%,差异有统计学意义(P<0.05);MMP-9表达率分别为60.87%、56.25%和27.27%,差异有统计学意义(P<0.05);进一步比较KISS-1及MMP-9表达的阳性强度,3组间差异亦有统计学意义(P<0.01)。结论:KISS-1在子宫内膜异位症的表达降低,MMP-9的表达增高可能与内异症的侵袭有关。     

GRIM-19在胚胎停育患者绒毛组织中表达及其作用机制的研究

目的:探讨干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(gene associated with retinoidinterferon-induced mortality-19,GRIM-19)与胚胎停育的关系及作用机制。方法:选择50例胚胎停育患者为实验组,50例非意愿妊娠要求行人工流产的正常早孕患者为对照组。用免疫组织化学法对绒毛组织中GRIM-19进行定位检测;采用Western blotting和Real-time PCR检测绒毛组织中GRIM-19蛋白和mRNA水平。应用荧光探针JC-1测定绒毛细胞线粒体跨膜电位,AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡率。采用GRIM-19-siRNA转染技术使HTR-8/SVneo细胞低表达GRIM-19,并测定转染后细胞线粒体跨膜电位与细胞凋亡率。结果:GRIM-19在所有患者绒毛中均有不同程度的表达,与对照组相比,实验组绒毛中GRIM-19蛋白和mRNA的表达量降低,差异有统计学意义(P0.01)。实验组绒毛细胞线粒体膜电位较对照组降低,细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。转染后HTR-8/SVneo细胞线粒体膜电位明显降低、细胞凋亡率升高,较转染前均有统计学差异(P0.05),且线粒体膜电位与细胞凋亡率之间存在着明显的负相关性(r=-0.754,P0.01)。结论:GRIM-19在早期妊娠中起重要作用,而GRIM-19的低表达可能通过影响线粒体功能,增加细胞凋亡参与了胚胎停育的发生、发展。     

不明原因复发性流产患者绒毛组织中miR-210表达及其与血管新生因子的关系

目的:探讨不明原因复发性流产(URSA)患者绒毛组织中miR-210表达及其与血管新生因子的关系。方法:选取2014年3月至2016年4月在潍坊市益都中心医院产科行清宫术的URSA患者53例,同期选取正常早孕而终止妊娠的40例患者为对照组。实时荧光定量PCR法检测绒毛组织中miR-210、HIF-1α和VEGF表达,Western blot法检测绒毛组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达,免疫组化法检测绒毛组织中MVD。结果:URSA患者绒毛组织中miR-210 mRNA相对表达量均低于对照组,且流产3次者的miR-210 mRNA相对表达量均低于流产≤3次的患者,差异均有统计学意义(P0.05)。URSA患者绒毛组织中HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组,且URSA患者中流产3次绒毛组织中HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白相对表达量均低于流产≤3次的患者,差异均有统计学意义(P0.05)。URSA患者绒毛组织中MVD数(26.8±4.4)个,显著低于对照组的(37.2±5.1)个,差异有统计学意义(t=15.394,P0.001)。Pearson相关分析显示,URSA患者绒毛组织中miR-210与HIF-1α和VEGF表达均呈正相关(r=0.418和0.507,P0.05),与绒毛组织中MVD数呈正相关(r=0.472,P0.05)。结论:miR-210在URSA患者绒毛组织中呈低表达,且与流产次数有关,可能通过与HIF-1α和VEGF相互作用而减少MVD数量,导致URSA发生。     

原因不明复发性流产患者蜕膜Foxp3 mRNA及蛋白质的表达

目的:探讨原因不明复发性流产(URSA)患者蜕膜Foxp3 mRNA及蛋白的表达。方法:分别采用免疫组化S-P法、半定量和实时定量PCR法和W estern B lot法检测25例URSA患者蜕膜组织Foxp3 mRNA及蛋白的表达与分布,并以32例正常早孕妇女为对照。结果:(1)免疫组化S-P法显示Foxp3表达于胞浆,妊娠后的蜕膜组织有Foxp3的表达;URSA患者蜕膜Foxp3的表达显著低于正常妊娠妇女(P<0.01);(2)半定量和实时定量RT-PCR法分析均显示,URSA患者蜕膜组织Foxp3 mRNA的表达显著低于正常早孕妇女(P<0.05);(3)W estern B lot法分析显示,URSA患者蜕膜组织Foxp3蛋白的表达显著低于正常早孕妇女(P<0.05)。结论:Foxp3可能在维持早期妊娠中起重要作用,其表达水平降低可能与URSA的发病有关。     

早孕绒毛滋养层细胞胰岛素生长因子-II mRNA表达与胚胎发育的关系

目的 :探讨早孕绒毛组织中IGF IImRNA表达水平的变化与胎盘、胚胎早期发育的关系。方法 :采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测 2 0例正常早孕妇女 (正常对照组 )、15例自然流产妇女 (自然流产组 )及 2 0例药物流产妇女 (药物流产组 )绒毛组织中IGF IImRNA的表达 ,同时用PAS染色法分别观测其绒毛组织中糖原储存水平的变化 ,并进行半定量分析和相关性分析。结果 :(1)IGF IImRNA在自然流产组、药物流产组绒毛组织中的表达水平分别为 1.19± 0 .6 7、1.4 2± 0 .6 4,明显低于正常早孕组的 2 .2 2± 0 .95 ,差异均具有显著性 (P <0 .0 5 ) ,药物流产组与自然流产组差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;(2 ) 3组绒毛组织中糖原灰度值分别为 10 6 .0 4± 12 .6 0、82 .85± 2 2 .79、85 .94± 16 .15 ,自然流产组、药物流产组与正常对照组相比差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;(3)绒毛组织中IGF IImRNA的表达强度与其糖原储存水平呈正相关 (P <0 .0 5 )。结论 :推测早孕绒毛组织IGF IImR NA的适量表达与胎盘、胚胎发育有关 ,IGF对胎盘糖原合成的调节可能是其重要作用机制之一。