骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景：目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确。 目的：观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化。 方法：抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10-8 mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录-聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定。 结果与结论：经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%。提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞已具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据。     

层粘连蛋白促脐带间充质干细胞向成骨细胞分化与黏着斑激酶表达

背景：目前对脐带间充质干细胞的研究集中在分离纯化及药物作用下诱导分化。分化过程中细胞外基质成分的作用及信号通路的关系的研究报道很少。 目的：研究层粘连蛋白在脐带间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用与黏着斑激酶表达之间的关系。 方法：取对数生长脐带间充质干细胞分为4组：层粘连蛋白诱导组：层粘连蛋白质量浓度分别为50,25,5,1 mg/L;成骨诱导组：用成骨诱导液处理;复合诱导组：用层粘连蛋白和成骨诱导液处理。对照组：未用层粘连蛋白和成骨诱导液处理。连续培养4周。观察细胞形态、茜素红染色分析钙盐沉积,检测碱性磷酸酶活性,组织化学组化与Westen blot检测ERK1/2、P-ERK、黏着斑激酶的表达。 结果与结论：①倒置显微镜下对照组比诱导组细胞胞体呈矮柱状、有短突起彼此相连,核圆形。②茜素红染色细胞形成红色,表现为阳性。复合诱导组比其他组要高、不同时间点比21 d钙盐沉积明显增多(P < 0.05)。③层粘连蛋白组碱性磷酸酶活性比对照组高、其诱导第7天后作用显著(P < 0.05)。层粘连蛋白不同质量浓度组之间碱性磷酸酶活性,差异无显著性意义(P > 0.05)。④组织化学组化鉴定ERK、P-ERK、黏着斑激酶表达均与对照比层粘连蛋白组表达增强(P < 0.05)。⑤Westen Blot检测成骨诱导组与复合诱导组有ERK、P-ERK、黏着斑激酶蛋白表达,层粘连蛋白组与对照组无表达。结果提示,脐带间充质干细胞向成骨细胞分化过程中层粘连蛋白有促分化作用,层粘连蛋白上调信号转导蛋白黏着斑激酶、ERK、P-ERK表达。     

体外诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞

背景：脐血间充质干细胞在特定的诱导条件下可以分化成为多种类型的细胞,易于体外培养扩增,但脐血中间充质干细胞的建立时间长、频率低是其主要缺点。 目的：体外分离培养脐血间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞方向分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-06/2009-01在青岛大学医学院试验室完成。 材料：脐血取自足月正常分娩的产妇,由青岛市立医院妇产科提供。 方法：采用percoll密度梯度法体外分离培养人脐血间充质干细胞,当细胞汇合90%单层细胞后胰蛋白酶消化传代。取第3代脐血间充质干细胞,以1×106密度接种,当细胞达50%~60%融合时,加入含0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的DMEM成骨细胞诱导液;对照组加入普通低糖DMEM培养液培养。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,细胞生长曲线分析,透射电镜观察细胞超微结构,von Kossa染色和碱性磷酸酶染色检测向成骨细胞诱导分化情况。 结果：原代培养的脐血间充质干细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,传代后细胞形态均一,呈梭形旋涡状排列。第3代脐血间充质干细胞高表达CD29,CD44,CD13,不表达CD34。生长潜伏期为两三天,第三四天进入对数增殖期,1个月后进入平台期。胞核呈类圆形或不规则形,核膜清晰,有一两个核仁,染色质较粗,胞质中细胞器丰富,细胞表面有微绒毛。第3代脐血间充质干细胞成骨诱导7 d后逐渐汇合呈铺路石状,14 d后von Kossa染色出现钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阳性;对照组未见钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阴性。 结论：采用percoll密度梯度法可成功从人脐血中分离出间充质干细胞,并在体外诱导分化为成骨细胞。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向

背景：在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有显著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果。骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想。 目的：观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成。 材料：清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供。腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增。 方法：胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组。各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100。 主要观察指标：转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达。 结果：与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明显增高（P < 0.01）,且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著。Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达。Western blotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达。 结论：大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞。     

杜仲叶提取物诱导羊骨髓间充质干细胞成骨及抑制其成脂肪分化

背景：传统诱导剂只具有单纯诱导成骨或成脂的分化作用，应用较为局限。杜仲叶提取物具有提高骨密度、抑制骨吸收、调节骨代谢功能的药效作用，可促进成骨细胞增殖和碱性磷酸酶分泌。 目的：探讨杜仲叶提取物诱导羊骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的同时，是否具有抑制成脂肪分化的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-02/10在南昌大学第二附属医院分子中心实验室完成。 材料：健康12月龄羊6只，由南昌大学提供。杜仲叶提取物由江西师大生物技术公司制备。 方法：采用全骨髓法体外分离培养羊骨髓间充质干细胞，取第3代细胞，设立6组：空白对照组，加入DMEM+胎牛血清；传统成骨诱导剂组，加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸的DMEM高糖培养基；传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组，在传统诱导剂组基础上加入10-5 g/mL杜仲叶提取物；10-4，10-5，10-6 g/mL杜仲叶提取物组分别加入对应质量浓度的杜仲叶提取物。同时另取第3代细胞行成脂肪诱导，分组同上，仅将传统成骨诱导剂更换为传统成脂诱导剂。 主要观察指标：成骨诱导后，钙钴法检测碱性磷酸酶活性，Von Kossa法观察矿化结节的形成，RT-PCR法检测成骨细胞中Cbfa1 mRNA基因的表达；成脂诱导后，油红O染色观察骨髓间充质干细胞成脂分化情况。 结果：与空白对照组比较，各成骨诱导组细胞内碱性磷酸酶合成增多，形成矿化结节，且传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组、10-4，10-5 g/mL杜仲叶提取物组诱导成骨情况优于传统成骨诱导剂组、10-6 g/mL杜仲叶提取物组；RT-PCR显示各成骨诱导组均能高效扩增出171 bp的Cbfa1基因转录片段，且成骨细胞中Cbfa1 mRNA表达水平差异无显著性意义（P > 0.05）。油红O染色结果显示，加入杜仲叶提取物的各成脂诱导组，其脂滴数量明显少于传统成脂诱导剂组。 结论：杜仲叶提取物能诱导体外分离纯化培养的羊骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化增殖，同时抑制其向脂肪细胞分化，实现双向调节作用。     

骨形态发生蛋白9诱导骨骼肌源性干细胞的成骨分化***

背景：已有实验报道部分骨形态发生蛋白能够诱导间充质干细胞等向成骨细胞的分化。 目的：评估骨形态发生蛋白9定向诱导骨骼肌源性干细胞成骨分化的能力。 方法：采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法提取兔骨骼肌源性干细胞,用重组腺病毒的方法将骨形态发生蛋白9导入细胞,通过碱性磷酸酶定量测定、钙盐沉积实验观察骨形态发生蛋白9对于骨骼肌源性干细胞成骨分化的定向诱导作用。 结果与结论：成功分离培养兔骨骼肌源性干细胞,免疫细胞化学染色80%以上的细胞呈Sca-1 阳性。骨形态发生蛋白9能诱导骨骼肌源性干细胞碱性磷酸酶的表达,且能够促进细胞的钙盐沉积。提示,骨形态发生蛋白9具有定向诱导骨骼肌源性干细胞分化成骨的能力。     

电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景：目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法。但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚。 目的：尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性。 方法：从患者髂后上棘抽取骨髓,分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养。当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中。实验随机分为3组：空白对照组：加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组：每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%~70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组：加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液,电针刺激,采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d。相差倒置显微镜观察细胞形态变化;茜素红染色结果;细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性;RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达;Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达。 结果与结论：①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5~7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象;电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状。②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到有矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应。③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P < 0.05);且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P < 0.05),但28 d时差异无显著性意义(P > 0.05)。④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P < 0.05)。提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变*

背景：目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察。 目的：采用全骨髓培养-贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞方向分化,利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点。 设计、时间及地点：观察实验,于2007-03/2008-04在河北医科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成。 材料：成年新西兰大白兔由白求恩国际和平医院实验动物中心提供。Hitachi S-3500N型扫描电镜和Hitachi-7500型透射电镜。 方法：从新西兰大白兔髂后上嵴处抽取骨髓。经原代及传代培养后,取部分第3代细胞加入诱导剂,诱导剂为10 mmol/L β-甘油磷酸钠,10-8 mmol/L地塞米松,50 mg/L维生素C。培养2周后,诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测。 主要观察指标：光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征;电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点。 结果：培养的第3代骨髓间充质干细胞,其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应;钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阴性结果。经向成骨细胞诱导分化后,其碱性磷酸酶染色,钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阳性反应。光镜和扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形,少量呈星形;经向成骨细胞诱导分化后,细胞体积增大,更加饱满,似鱼群样排列。透射电镜观察显示,骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富,向成骨细胞诱导分化后,其线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。 结论：骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。     

重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的

背景：碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比。 设计、时间及地点：对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成。 材料：2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导。5周龄Wistar大鼠用于移植实验。牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选。稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况。 主要观察指标：碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较。 结果：利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况。从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性。重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达。转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达。转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化。转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P > 0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P < 0.01)。骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录。转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多。 结论：稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想。外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因。     

人脂肪源干细胞分离培养及向成骨细胞的诱导分化

背景：脂肪源干细胞可分泌众多的免疫调节因子,不引起T细胞的细胞毒作用,并可通过调整T淋巴细胞的种类和数量。 目的：探讨人脂肪源干细胞在体外分离培养扩增的方法及向成骨细胞诱导分化的能力。 方法：以0.1%的Ⅰ型胶原酶通过组织消化的方法分离人脂肪组织中的干细胞,体外扩增培养至第2代后检测其表面抗原的表达,并在成骨诱导液中促进其向成骨细胞的分化,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色及对碱性磷酸酶的RT-PCR检测来明确其分化能力。 结果与结论：体外分离培养的脂肪源干细胞生长稳定,扩增速度快。流式细胞仪检测结果显示其高表达干细胞相关抗原。向成骨细胞诱导后经免疫组化染色可见矿化结节形成,RT-PCR检测发现碱性磷酸酶表达阳性。提示脂肪源干细胞在体外分离培养方法简单,扩增速度快,并具有定向分化的能力,是可靠的组织修复和细胞治疗的种子细胞来源。     

组织块培养法扩增人脂肪源性干细胞的生物学特征鉴定

背景：组织块培养法分离人脂肪源性干细胞并进行体外培养,培养体系简单,节约时间,较好地保持了干细胞的生物学特性,并据此向多方向诱导分化,为组织工程学种子细胞的临床应用提供理论依据和参考路线。 目的：观察组织块培养法分离的人脂肪源性干细胞的基本生物学特性、表面抗原特点及其向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化潜能。 方法：取健康人腹部皮下脂肪组织,组织块培养法分离出脂肪源性干细胞,进行体外培养,观察其形态特征。流式细胞仪检测第3代脂肪干细胞的细胞周期及表面抗原。取第3代人脂肪干细胞,分别用成骨和成脂诱导培养液诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,Von Kossa染色、油红O染色定性鉴定。 结果与结论：原代及传代的人脂肪干细胞形态均类似成纤维细胞,生长能力旺盛。第3代人脂肪干细胞中,超过88%的细胞都处于G0/G1期。第3代脂肪干细胞表面抗原表达：CD29、CD44、CD90、CD105表达阳性,CD34、CD45、CD106表达阴性。人脂肪干细胞经成脂诱导后21 d,油红O染色阳性;成骨诱导培养后,茜素红染色和Von Kossa染色阳性。因此,实验证实人脂肪源性干细胞能向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化。     

富血小板血浆促进脂肪间充质干细胞的体内外成骨****☆

背景：添加富血小板血浆可促进细胞体外成骨表型的快速转化,从而有效成骨。 目的：观察富血小板血浆对脂肪间充质干细胞体内和体外成骨能力的影响。 方法：第3代兔脂肪间充质干细胞进行成骨诱导培养,分为对照组和富血小板血浆组。细胞接种到钙磷陶瓷支架上后,体内外观察细胞/载体复合物的成骨情况。 结果与结论：两组细胞随着诱导时间的延长碱性磷酸酶活性增高,达到高峰值后随后逐渐下降,诱导后14 d时,富血小板血浆组即达到高峰值,对照组18 d达到高峰值。细胞/载体复合体切片Von Kossa染色显示两组载体的孔隙内衬面呈多层黑染状,有大量钙盐沉积。甲苯胺蓝染色显示载体的孔隙中可见成熟的骨质存在,周边区域较中心多。体外钙盐沉积对照组多,体内成骨面积富血小板血浆组多(P < 0.05)。说明,富血小板血浆可有效诱导脂肪间充质干细胞体内和体外成骨。     

缺血再灌注大鼠脑组织提取液体外诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞的分化*

背景：骨髓基质细胞最终成为神经元需要经历定向及分化两个过程,定向及分化是含有相同基因库的细胞不同基因表达的结果,基因表达需要一定的条件,胞外基质的变化可引起细胞形态学及基因表达方式的改变。 目的：观察骨髓基质细胞在损伤大鼠脑组织提取液诱导下,向神经元样细胞分化的可能性。 方法：取第5代转染绿色荧光蛋白的骨髓基质细胞,分别用缺血再灌注/正常大鼠脑组织提取液进行诱导分化培养,并设立空白对照。相差显微镜下观察细胞形态变化,并行免疫组织化学染色鉴定。 结果与结论：原代培养的骨髓基质细胞纯化、扩增后呈均匀一致的长梭形,第3代细胞均一表达CD44,CD106,不表达CD34。荧光显微镜下,绿色荧光蛋白转染后24 h可观察到骨髓基质细胞有荧光表达,但强度稍弱;48 h后大多数细胞发出明显绿色荧光。加入缺血再灌注大鼠脑组织提取液后,诱导细胞不仅在形态上表现为神经元样特征,而且神经元特异性烯醇化酶特异性抗体呈阳性表达。与空白对照组比较,缺血再灌注大鼠脑组织提取液组和正常大鼠脑组织提取液组骨髓基质细胞分化率均明显升高(P < 0.05),且前组升高幅度明显大于后组(P < 0.05)。提示缺血再灌注大鼠脑组织提取液能将骨髓基质细胞成功诱导为神经元样细胞。     

大鼠脐带源间充质干细胞的分离及生物学性状**☆

背景：关于大鼠骨髓来源的间充质干细胞用于移植免疫耐受及进行组织修复的研究很多,但尚无脐带来源间充质干细胞的相关研究。 目的：建立从大鼠脐带分离间充质干细胞的方法,并观察其生物学性状。 方法：大鼠脐带经酶消化和组织块培养两种方法进行分离培养,于DMEM-LG培养基中培养,倒置显微镜观察细胞形态,细胞计数绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及细胞表型,免疫组织化学染色检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力。 结果与结论：两种方法均能成功地从大鼠脐带中获得大量的间充质干细胞：原代培养显示,胶原酶消化法比组织块培养法的效率更高,大约10 d就可以进行传代,而组织块培养法要14 d才能传代;传代扩增两者之间没有差别。免疫表型分析显示,大鼠脐带源细胞表达黏附分子和基质细胞标记CD90、CD106,不表达造血细胞标记CD34、CD45。体外诱导实验证实,大鼠脐带间充质干细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。     

辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖分化的影响**

背景：辛伐他汀对正常大鼠骨代谢及骨髓基质干细胞增殖分化影响的报道目前不多。 目的：观察辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖、分化的影响,及其在此过程中Smad1,2,7 mRNA表达水平的变化。 方法：16只6周龄雌性SD大鼠按体质量随机均分成2组,对照组每天灌胃蒸馏水,实验组灌胃辛伐他汀20 mg/(kg•d),持续9周。于最后一次灌胃的第2天取左侧股骨行骨密度和骨组织形态计量学测定;取右侧股骨和胫骨骨髓基质细胞向成骨方向诱导培养,并采用CCK-8法检测定向成骨分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第16,28天检测碱性磷酸酶比活性、碱性磷酸酶染色阳性细胞比;细胞培养第21天,提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测Smad1,2,7的mRNA表达。 结果与结论：辛伐他汀体内给药干预9周后,大鼠骨量和骨密度无显著变化,体外培养骨髓基质干细胞所有检测基因mRNA水平、细胞增殖能力、细胞外基质矿化能力、碱性磷酸酶比活性、碱性磷酸酶染色阳性细胞比两组间差异均无显著性意义 (P > 0.05)。结果显示20 mg/(kg•d)辛伐他汀体内给药9周对大鼠骨量及骨髓基质干细胞的增殖和分化及Smad1,2,7的表达无显著作用。     

低氧增强骨髓间充质干细胞对缺氧诱导心肌细胞凋亡的可能性

背景：骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后存活率低,而低氧有可能增强骨髓间充质干细胞的增殖,促进其存活。 目的：体外模拟心肌细胞缺血微环境,探索低氧预处理后,骨髓间充质干细胞对持续缺氧诱导的心肌细胞凋亡的保护作用。 方法：取第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞用于制备条件培养液。取胚胎大鼠心肌细胞株,随机分成4组：对照组：心肌细胞正常培养组;模型组：心肌细胞单纯缺氧;骨髓间充质干细胞组：心肌细胞与骨髓间充质干细胞条件培养液共缺氧;低氧组：心肌细胞与骨髓间充质干细胞低氧条件培养液共缺氧。MTT检测各组细胞活力变化,Annexin V-FITC双染标记心肌细胞凋亡,免疫组化检测各组Bax和Bcl-2蛋白的表达。 结果与结论：免疫组化显示,低氧组的Bcl-2表达较其他各组增强,而Bax的表达比模型组和骨髓间充质干细胞组减弱,Bcl-2/Bax比值最大。与对照组和骨髓间充质干细胞组相比,低氧组的细胞活力高(P < 0.05),凋亡率降低(P < 0.05)。提示低氧可能是通过增强旁分泌机制,从而对Bax和Bcl-2进行调节,对心肌细胞凋亡有保护效应。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化

背景：骨髓中的间充质干细胞含量极少,每1×104~1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞,需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求。 目的：观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成。 材料：清洁级雄性近交系SD大鼠30只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞融合至80%~90%胰蛋白酶消化传代。取传至第3代细胞,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标记,茜素红染色检测其成骨能力,油红O染色检测其成脂能力。 结果：原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样,连续传代10代以上,细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力。第3代骨髓间充质干细胞CD90,CD44,CD106均呈阳性表达,而CD34,CD45,CD11b呈阴性。成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成。成脂诱导2周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。 结论：全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。     

hTERT介导脐带间充质干细胞实现永生化的研究

目的 通过转染人端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT)建立永生化脐带间充质干细胞(UCMSCs),用以获得足够多的UCMSCs满足体外研究与临床需要. 方法 原代分离培养人UCMSCs,取第4代UCMSCs行流式细胞术检测UCMSCs表面特异标志物表达:利用脂质体介导pLXSN-hTERT正义表达质粒转染UCMSCs,建立永生化UCMSCs:RT-PCR检测转染前后hTERTmRNA表达水平,细胞免疫荧光方法检测hTERT蛋白表达,流式细胞术观察hTERT转染后细胞周期改变. 结果 流式细胞术结果显示UCMSCs强表达CD29、CD44、CDl05,极低表达CD31、CD34、CD45,检测结果符合人UCMSCs特征;RT-PCR检测单纯UCMSCs低表达hTERT mRNA,pLXSN-hTERT正义表达质粒转染后hTERT mRNA表达明显增高;细胞免疫荧光显示hTERT全部表达于细胞核,转染后胞核荧光强度明显增强;细胞周期检测结果显示转染后处于S期UCMSCs数目明显增多,细胞可获得长期稳定传代(＞35代). 结论 以hTERT转染UCMSCs在体外可获得长期稳定传代培养细胞,可基本满足体外研究与临床需要.     

4002/动态机械力刺激对幼鼠前脂肪细胞活力、增殖与凋亡影响的研究（英文发表

背景：幼年动物脂肪组织中前脂肪细胞的生物学行为与肥胖的发病和防治关系密切,而采用细胞生物力学实验方法直接观测力学振荡对前脂肪细胞生物力学行为变化可为推拿按摩治疗单纯性肥胖原理研究提供更直接的实验证据。 目的：通过对体外培养的幼鼠前脂肪细胞实施不同频率的机械力刺激,观测细胞活力、增殖与细胞凋亡的变化。 方法：体外培养SD幼鼠前脂肪细胞,对细胞进行鉴定后,通过细胞恒温培养振荡器对前脂肪细胞实施动态机械力学刺激。根据不同处理频率分别分为0(空白对照),1.5和 3 Hz共3个组,每组振荡时间均为30 min,每12 h振荡1次,共处理3 d。观察细胞活力、增殖与凋亡率的变化。 结果与结论：培养初期细胞形态似成纤维细胞,油红O染色后,细胞内出现红染颗粒,证明体外培养的幼鼠细胞经鉴定为前脂肪细胞。随实验振荡力的刺激,前脂肪细胞的活力和增殖有显著抑制(P < 0.05或P < 0.01),但力学振荡刺激对前脂肪细胞的凋亡与空白对照组比较差异无显著性意义 (P > 0.05)。结果提示推拿防治青少年单纯性肥胖的细胞生物学机制可能主要是通过抑制前脂肪细胞的活力和增殖而作用的。     

永生化人骨髓基质细胞的表面抗原及多向分化研究

目的研究本所转入人端粒酶逆转录酶基因的人骨髓基质细胞（hMSC—TERT细胞）的生物学特性。方法复苏hMSC—TERT细胞第30代，扩增，流式细胞仪检测细胞表面抗原；进行体外脂肪细胞、成骨细胞定向诱导，并分别进行油红O染色、碱性磷酸酶染色及von Kossa染色。结果hMSC—TERT细胞表面抗原检测CD34、CD5、CD44、CD106、CD166均为阴性；脂肪细胞定向诱导后油红O染色见胞浆内有红色脂肪颗粒，成骨细胞定向诱导后见胞浆内有碱性磷酸酶染色阳性黑褐色颗粒，von Kossa染色见有钙结节形成。结论hMSC—TERT细胞依然保留骨髓基质干细胞的自我更新特性及多向分化潜能。