bcr／abl反义RNA片段启动人ph^＋白血病细胞凋亡过程

为探讨ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因对维持细胞生存方面的作用，通过脂质体介导的方法将表达ｂｃｒ／ａｂｌ融合区反义ＲＮＡ片段的重组质粒导入Ｋ５６２和ＢＶ１７３细胞系，对细胞的超微结构、细胞大小的改变以及核ＤＮＡ降解等进行观察。结果：表达ｂｃｒ／ａｂｌ反义ＲＮＡ片段的细胞呈典型的细胞凋亡形态，细胞核ＤＮＡ降解。证实ｂｃｒ／ａｂｌ反义ＲＮＡ片段启动人Ｐｈ＋白血病细胞系凋亡过程。提示ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因是Ｐｈ＋白血病细胞存活能力增强的重要因素，也为慢性髓系白血病的治疗指出了新的方向     

反义bcr／abl寡核苷酸诱导K562细胞凋亡的研究

反义ｂｃｒ／ａｂｌ寡核苷酸诱导Ｋ５６２细胞凋亡的研究戴木水罗绍凯戴丽君洪文德彭爱华慢性髓细胞白血病（ＣＭＬ）细胞表达ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因，其引起ＣＭＬ发病的机制可能是抑制髓系细胞的凋亡，因而如何抑制ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ的表达，诱导髓系细胞的凋亡是...     

bcr/abl反义RNA片段对Ph~ 人白血病细胞系致瘤性和存活的影响(英文)

构建了表达2、3和4个相同241bp b3/a2型bcr/abl融合基因的反义RNA片段的重组质粒,酶切电泳和以241bp bcr/abl基因片段为探针进行的菌落原位杂交证实各目的片段已插入逆转录病毒表达载体,分别命名为pDAB2、pDAB3和pDAB4。用脂质体介导的方法将pDAB3导入Ph~ 人白血病细胞系(K562和BV173细胞),48小时后用G418进行抗性筛选,观察了对靶细胞增殖的影响。结果表明,外源质粒在靶细胞内表达的反义RNA片段,使细胞致瘤性消失及诱发凋亡。探讨了可能的作用机理。     

bcr/abl mRNA反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病Ph~ 细胞的作用

Ph~ 慢性粒细胞白血病(CML)的bcr/abl融合基因在其发病机制中具有重要作用。为研究bcr/abl反义寡核苷酸对CML细胞的作用,将合成两种18个碱基的bcr/abl硫代反义寡核苷酸与相应CML细胞系(K562细胞)及患者细胞共同孵育。结果发现,bcr/abl反义寡核苷酸可明显抑制K562细胞生长;对CML细胞CFU-GM抑制率为54％—91％,部分病例CFU-GM可有bcr/abl mRNA消失而PCR检测为阴性。上述抑制都是序列特异性的,与剂量呈正相关关系。通过流式细胞仪PI染色分析DNA含量,检测具有凋亡间接特征的亚二倍体细胞数量,发现反义寡核苷酸诱导细胞凋亡是其主要作用机制。本实验为bcr/abl反义寡核苷酸CML基因治疗及体外骨髓净化提供了依据。     

RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr／abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr／abl融合基因的小干扰RNA(siRNA)，并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株，以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照；同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照，流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率；实时定量RT—PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应。MTT法检测细胞增殖抑制率。膜联蛋白V(Annexin V)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率。结果电穿孔的转染效率可达70％；化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达；特异性siRNA可以抑制细胞增殖，转染24h细胞增殖抑制率达47％，48h达56％；特异性siRNA转染细胞24h组凋亡率为15．05％．48h组为19．47％，与对照组(1．00％)比较明显提高。结论在细胞水平上，化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因的表达，为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础。     

bcr／abl mRNA融合转录本水平与慢性粒细胞白血病演变关系

目的检测不同病程慢性粒细胞白血病（CML）bcr／abl mRNA融合转录本表达水平．评价其在推断CML病情演变价值。方法利用定量聚合酶链反应（PCR）检测患者不同病期骨髓单个核细胞bcr／abl mRNA融合转录本水平。结果健康对照组0，CML慢性期0．34±0．03．慢性期治疗后0．10±0．（33，加速期0．35±0．02，急变期为0．35±0．03，慢性期治疗前后差异无统计学意义，慢性期明显低于加速期和急变期。结论bcr／abl mRNA表达水平的改变与疾病演变关系密切。     

反义bcr／ab1 RNA真核表达载体的构建

利用ＤＮＡ重组技术，将分离到的ｂｃｒ／ａｂｌｃＤＮＡ片段克隆到质粒ｐＳＰ７２中。在这个中间克隆载体中，此ｃＤＮＡ片段两端的酶切点已被调整。利用此中间克隆载体和逆转录病毒载体ＢＡＧ，组装了反义ｂｃｒ／ａｂｌＲＮＡ的真核表达载体，此重组表达载体将应用在细胞水平研究反义ＲＮＡ对ｂｃｒ／ａｂｌ基因携带细胞的作用，探索基因治疗。     

bcr/abl基因b3-a2型接合区cDNA的分离和序列分析

利用分子生物学方法,我们将K562细胞林bcr/abl mRNA 0.3kb的接合区cDNA片段用聚合酶链反应扩增并插入到质粒pGEM-4-Z载体中。经限制酶切分析和荧光标记M13引物法DNA序列测定,证实重组质粒pB3A2中有0.3kb的插入片段与K562 mRNA接合区序列完全一致。我们分离到的接合区DNA可用于bcr/abl基因的检测及其反义核酸抑制的研究。     

Bcr／abl特异性RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建特异性的抗慢性髓细胞白血病融合基因bcr／abl mRNA的siRNA真核细胞表达载体，探索RNA干扰(RNAi)分子靶向治疗慢性髓细胞性白血病(CML)的作用。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列，按照Tusehl设计原则，选择设计双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，再转化为能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs，shRNA)的DNA序列，并与pTER质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER／shRNA1、pTER／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果：构建慢性粒细胞白细胞bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER／shRNA1、pTER／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论：抗慢性粒细胞白细胞bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体的构建成功。     

格列卫对慢性粒细胞白血病病人Ph染色体和bcr／abl融合基因表达影响

目的探讨格列卫治疗Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病病人后骨髓Ph染色体及bcr／abl融合基因表达的变化。方法采用R显带和半定量RTPCR分别检测11例慢性粒细胞白血病病人服用格列卫前后骨髓标本中Ph染色体和bcr／abl基因的表达。结果用药后9例慢性期慢性粒细胞白血病病人,7例分别在用药3～24个月后染色体检查为Ph染色体阴性,1例用药1个月后其Ph染色体仍为阳性,后失访;1例用药2个月后Ph染色体阳性率为30％;1例急变期慢性粒细胞白血病病人用药6个月后其Ph染色体阳性率为70％;1例加速期慢性粒细胞白血病病人用药12个月后Ph染色体阳性率为60％。服用格列卫的CML病人Ph染色体转阴后仍能检测到bcr／abl基因的表达,但其表达水平较用药前明显降低,差异有显著性（t=3．77、5．13,P〈0．01）,随着用药时间的延长bcr／abl基因表达逐渐降低。结论格列卫能有效治疗Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病病人,并且对其预后具有重要的意义。     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体构建及其对K562细胞的影响

目的：研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中的作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法：合成针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头状”核酶的ｃＤＮＡ序列，定向克隆于逆转录病毒载体内，通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将核酶基因导入Ｋ５６２细胞，并通过克隆分析法、流式细胞术（ＦＣＭ）、逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果：①核酶转染Ｋ５６２细胞后４８小时克隆形成抑制率达８５％；②细胞内Ｐ２１０蛋白合成受到明显抑制；③ＲＴＰＣＲ半定量检测ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平明显下降；④核酶处理组Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为：在ＦＣＭ图谱上可见明显的凋亡峰；ＤＮＡ电泳分析出现典型的梯状ＤＮＡ带；电镜观察呈现凋亡早期形态学改变。结论：核酶基因通过逆转录病毒载体导入Ｋ５６２细胞后可成功表达，使Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ及Ｐ２１０蛋白表达水平下降，抑制Ｋ５６２细胞增殖，同时诱导Ｋ５６２细胞发生凋亡。     

慢性髓系白血病Ph染色体分析与bcr/abl mRNA检测

目的 为进一步明确慢性髓系白血病（ＣＭＬ）患者中Ｐｈ染色体阳性细胞与ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因表达之间的关系和比较细胞遗传学分的与聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法在ＣＭＬ应用中的优缺点,方法 用热变性姬姆萨Ｒ显带（ＲＨＧ）技术和逆转录筑巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔ－ＰＣＲ）对３３例ＣＭＬ患者的骨髓或外周血进行了分析,对其中１１例异基因骨髓移植（Ａｌｌｏ－ＢＭＴ）或α干扰素（ＩＦＮ－α）＋小剂量羟基脲（Ｈ     

慢病毒介导shRNA稳定干扰P210bcr/abl基因表达的体内外研究

P210bcr/abl融合基因在慢性髓系白血病(CML)发生、发展中起重要作用。针对P210bcr/abl融合基因的小分子抑制剂(如伊马替尼)治疗CML非常有效,但容易产生耐药性。P210bcr/abl基因的融合区为RNA干扰其表达提供了一个特异性靶点。本研究通过病毒载体建立能同时表达P210bcr/ablshRNA和P210bcr/abl基因的BaF3细胞系,并探讨慢病毒介导的shRNA对P210bcr/abl基因表达的作用。用荧光显微镜检测慢病毒对BaF3细胞的感染率,用台盼蓝拒染法检测细胞的增殖能力;用RT-PCR和Western blot分别检测P210bcr/ablmRNA和蛋白的表达。结果发现,P210bcr/ablshRNA能使BaF3-P210bcr/abl细胞中的P210bcr/ablmRNA及蛋白表达明显下降,并且能增强BaF3-P210bcr/abl细胞对伊马替尼的敏感性,与不表达P210bcr/ablshRNA的BaF3-P210bcr/abl细胞相比,伊马替尼对该细胞系的IC50下降50%以上。将该细胞由尾静脉移植到受致死剂量照射的裸小鼠体内,移植该细胞的小鼠生存期较移植BaF3-P210bcr/abl细胞的小鼠生存期明显延长。结论:稳定表达针对P210bcr/abl基因融合区的shRNA可能增强CML常规治疗的效果。     

bcr／abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建bcr／abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr／abl mRNA和P210蛋白的影响。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列,按照Tusch 1设计原则,选择设计双链小干扰RNA（siRNA）,再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅱ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT—PCR分析bcr／abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果：构建bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117使bcr／abl mRNA的相对水平下降50％,使P210蛋白下降47％。结论：bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr／abl的表达。