2-甲氧基雌二醇对白血病K562细胞凋亡相关基因表达的影响及其机制

 目的　探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对白血病K562细胞凋亡的影响及其作用机制。方法　实验分为3组,对照组：培养基中不含2-ME;实验组：分别用1、2、4、8、16μmol／L的2-ME处理K562细胞36 h后观察各项指标的变化;阴性对照组：培养液中以无RNase蒸馏水代替K562细胞。应用原位细胞凋亡法（TUNEL）、流式细胞术（FCM）、半定量RT-PCR及黄嘌呤氧化酶法分别检测K562细胞凋亡率、Caspase-3、性连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）及其基因表达、超氧化物歧化酶（SOD）与活性氧（ROS）水平。结果　不同浓度的2-ME与K562细胞作用36 h后,2-ME在一定的浓度范围内以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡;2-ME通过上调促凋亡因子Caspase-3和（或）下调抗凋亡因子XIAP的表达,降低SOD及增加ROS水平等途径促进K562细胞凋亡,这可能是2-ME诱导K562细胞凋亡的机制之一。结论　2-ME能够以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡,显示了其在慢性粒细胞白血病（CML）治疗中的潜在价值。     

2-甲氧基雌二醇对白血病细胞K562增生、凋亡及细胞周期的影响

 目的 探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对体外培养的慢性粒细胞白血病（CML）急变期细胞系bcr-abl（+）K562细胞增生、凋亡及细胞周期的影响。方法 将不同浓度和作用时间的2-ME与K562细胞共同培养，采用相差显微镜观察细胞的形态学变化；四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测2-ME对K562细胞增生的抑制作用；流式细胞术分析2-ME对K562细胞凋亡及细胞周期的影响。结果 1~ 16μmol／L浓度的2-ME在24、36、48及60 h均可明显抑制K562细胞增生，并在一定范围内呈时间和剂量依赖性；2-ME作用后G0／G1期细胞增加，并伴随细胞凋亡峰和凋亡率的升高。结论 2-ME可抑制K562细胞增生，诱导其凋亡，为2-ME的临床应用提供实验依据。     

盐酸千金藤素逆转K562/ADR细胞的多药耐药性及其与bcl-2的关系

目的　研究盐酸千金藤素(CEP)对K5 62 /ADR细胞多药耐药性的逆转作用及逆转机制。方法　采用MTT法测定阿霉素(ADR)单用及与CEP ,维拉帕米(VER)合用对K5 62 ,K5 62 /ADR细胞的直接细胞毒作用;采用免疫组织化学(IHC)法测定K5 62细胞,K5 62 /ADR细胞内bcl 2的表达,以及药物对bcl 2表达水平的影响。结果　联合应用ADR和4μmol/LCEP使K5 62 /ADR细胞对ADR的IC50 由13 5 μmol/L降至1 73 μmol/L ,其逆转倍数为7 8倍,但对K5 62细胞无明显影响;联合应用ADR和4μmol/LVER使K5 62 /ADR细胞对ADR的IC50 降至7 5 0 μmol/L ,其逆转倍数为1 8倍,但对K5 62细胞也无明显影响。用IHC法检测bcl 2的表达,K5 62 /ADR细胞中bcl 2的表达量为2 6 79% ,远高于K5 62细胞中表达量4 98% ,而联合应用ADR和4μmol/LCEP使K5 62 /ADR细胞中bcl 2的表达量降至13 16%。结论　CEP可部分逆转K5 62 /ADR细胞的耐药性,其机制可能与降低bcl 2的表达有关。     

苦参碱对K562及其多药耐药细胞K562/vin、K562/dox的诱导凋亡作用

目的　明确中药苦参碱对化疗敏感和耐药细胞的诱导凋亡作用。方法　采用MTT法测定苦参碱对各细胞的IC5 0值。K 5 6 2、K 5 6 2 /vin、K 5 6 2 /dox细胞与适宜浓度苦参碱共同孵育于 16 40培养液中 ,一定时间后对细胞行Wright′s Giemsa染色 ,做形态学观察 ,同时行DNA凝胶电泳、流式细胞仪DNA含量分析以检测凋亡。结果　细胞形态学观察可见 0 .2 5～ 1.0 0mg/ml浓度苦参碱作用后的细胞体积缩小、核固缩深染、细胞质空泡化、核碎裂等 ;DNA电泳可见阶梯状条带 ;流式细胞仪检测可见有低G1期细胞出现 ,并S期细胞比例增高。在试验范围内凋亡比率与药物浓度呈一定相关。苦参碱对敏感和耐药细胞的诱导凋亡作用无明显差异。结论　苦参碱可诱导K 5 6 2细胞凋亡 ,对其多药耐药细胞K 5 6 2 /vin、K 5 6 2 /dox亦有诱导凋亡作用 ,其作用与药物浓度呈一定相关性。苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡可能与其S期阻滞有关。     

As2S2诱导K562细胞凋亡的分子机制初步研究

目的　探索As2 S2 对K5 6 2细胞的诱导凋亡作用及其机制。方法　细胞凋亡的检测用流式细胞分析、基因组DNA电泳、细胞形态学观察等方法 ,Westernblot方法用于蛋白表达的检测 ,基因表达的变化用半定量RT PCR方法。结果　 3～ 5 μmol L的As2 S2 作用 4 8～ 72h即可诱导K5 6 2细胞凋亡。 3μmol LAs2 S2 作用 72h时 ,细胞凋亡率达 (34.4± 3.3) % ;5 μmol LAs2 S2 作用 4 8,72h时 ,细胞凋亡率分别为 (2 1.8± 3.6 ) %和 (4 6 .0± 5 .2 ) %。 5 μmol LAs2 S2 作用下 ,As2 S2 可降低Bcr Abl和JAK2的蛋白含量。As2 S2 从基因水平上调bax表达 ,下调c myc表达。As2 S2 作用后 ,Caspase 3被激活。As2 S2 也能诱导慢性粒细胞性白血病 (CML)患者单个核细胞凋亡。结论　As2 S2 可诱导CML细胞凋亡 ,Bcr Abl含量的降低可能起了很重要的作用。bax表达的增加、c myc表达的减少、JAK2蛋白含量的降低以及Caspase 3激活也可能参与了该细胞凋亡机制。     

Survivin反义寡核苷酸逆转K562/A02细胞的耐药研究

目的:探讨Survivin反义寡核苷酸(an-tisenseoligodeoxynucleotide,ASODN)对K562/A02细胞耐药的作用和机制。方法:以脂质体转染SurvivinASODN,以MTT法检测多柔比星(adriamycin,ADM)和SurvivinASODN ADM对K562/A02细胞的IC50,以RT-PCR、蛋白印迹、荧光分光光度计和流式细胞术分别检测SurvivinmRNA、蛋白表达及半胱氨蛋白水解酶-3(Caspase-3)的活性和细胞凋亡的变化。结果:ADM和ASODN ADM对K562/A02细胞的IC50分别为45·56和19·01mg/L,SurvivinmRNA和蛋白水平表达分别降低36·2%和71·5%,Caspase-3活性增加67·5%,凋亡率较对照组增加[(14·5±5·6)%vs(2·4±1·0%),P<0·05]。结论:SurvivinASODN通过抑制Survivin表达激活Caspase-3,诱导凋亡,逆转耐药。     

藏药金腰草中黄酮诱导K562细胞凋亡及其分子机制研究

目的研究藏药金腰草中6，7，3’-三甲氧基-3，5，4’-三羟基黄酮对人红白血病细胞株K562的凋亡诱导效应及其可能的作用机制。方法采用四氮唑蓝（MTT）比色法、透射电镜、细胞周期分析法和DNA琼脂糖凝胶电泳检测K562细胞凋亡；采用流式细胞术（FCM）测定细胞Bcl-2、Fas蛋白表达水平。结果6，7，3＇-三甲氧基．3，5，4’-三羟基黄酮可以抑制K562细胞增殖，并呈观典型的凋亡形态改变；细胞周期分析显示S期细胞数明显增多，出现S期阻滞；DNA琼脂糖凝胶电泳可见明显的梯状条带；6，7，3’-三甲氧基-3，5，4’-三羟基黄酮作用72h后，Bcl-2蛋白阳性表达率由36．10％下降到27．78％，Fas蛋白阳性表达率由11．33％上升到32．76％。结论6，7，3’-三甲氧基-3，5，4’-三羟基黄酮对K562细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用。其诱导凋亡可能与下调Bcl-2和E调Fas有关。     

木黄酮作用于K562细胞机制的初步研究

目的：探讨酪氨酸激酶抑制剂木黄酮（Genistein)作用于慢性粒细胞性白血病（CML）的机制。方法：通过细胞增殖、活力检测、形态学观察、半固体集落培养及DNA凝胶电泳和流式细胞术,观察木黄酮对K562细胞生长的影响。结果：（1）经≥5mg/L木黄酮处理2d的K562细胞,增殖抑制率达到50％以上,且与作用剂量和时间呈正相关;形态渐趋向凋亡但体积涨大;(2)K562细胞集落抑制达50％时的木黄酮浓度为10mg/L,也与时间和剂量呈正相关;（3）K562细胞经10mg/L木黄酮处理4d,DNA凝胶电泳可见清晰的梯状条带;（4）K562细胞分别经2．5mg/L、5mg/L和10mg/L木黄酮处理1d和2d后,流式细胞术检测细胞凋亡率分别为0．62％、1．64％、2．71％和0．68％、4．09％、8．4％;2d后G2期细胞分别占总细胞数的17％、34．5％和79．5％,而G1期和S期细胞逐渐明显减少。结论：木黄酮对K562细胞具有显的抑制增殖作用,其机制与诱导凋亡有关。     

盐酸千金藤素逆转K562／ADR细胞的多药耐药性及其与bcl-2的关系

目的 研究盐酸千金藤素(CEP)对K562／ADR细胞多药耐药性的逆转作用及逆转机制。方法 采用MTT法测定阿霉素(ADR)单用及与CEP，维拉帕米(VER)合用对K562，K562／ADR细胞的直接细胞毒作用；采用免疫组织化学(IHC)法测定K562细胞，K562／ADR细胞内bcl-2的表达，以及药物对bcl-2表达水平的影响。结果 联合应用ADR和4μmol／LCEP使K562／ADR细胞对ADR的IC50由13．5μmol／L降至1．73μmol／L，其逆转倍数为7．8倍，但对K562细胞无明显影响；联合应用ADR和4μmol／LVER使K562／ADR细胞对ADR的IC50降至7．50／μmol／L，其逆转倍数为1．8倍，但对K562细胞也无明显影响。用IHC法检测bcl-2的表达，K562／ADR细胞中bcl-2的表达量为26．79％，远高于K562细胞中表达量4．98％，而联合应用ADR和4μmol／LCEP使K562／ADR细胞中bcl-2的表达量降至13．16％。结论 CEP可部分逆转K562／ADR细胞的耐药性，其机制可能与降低bcl-2的表达有关。     

二甲亚砜对K562/ADM耐药细胞株耐药性的逆转作用

目的：研究二甲亚砜对K562／ADM耐药细胞的逆转作用。方法：通过加入二甲亚砜后耐药细胞的生长情况，逆转倍数的计算，细胞内过氧化物染色的阳性程度以及电镜下观察耐药细胞诱导前后的变化。结果：二甲亚砜诱导K562／ADM耐药细胞前后生长情况有显著差异且逆转借故为4．0，Pox染色阳性程度明显递增，电镜下可观察诱导后K562／ADM耐药细胞有向成熟分化趋势。结论：二甲亚砜对逆转K562／ADM的耐药性是有益的。     

补骨脂素逆转K562/ADM多药耐药细胞系耐药性研究

目的:研究补骨脂素对白血病细胞阿霉素耐药株(K562/ADM)多药耐药(multidrug resistance,MDR)性的逆转作用及其机制.方法:采用MTT法检测药物细胞毒性作用,计算其逆转倍数.结果:补骨脂素在1～20μmol·L-1范围内,对K562和K562/ADM无明显细胞毒作用,但与ADM联合用药可使ADM对K562/ADM的IC50明显下降,补骨脂素(1～20μmol·L-1)能不同程度地降低ADM对K562/ADM细胞的IC50值.结论:补骨脂素能逆转K562/ADM细胞的多药耐药.     

氧化苦参碱逆转多药耐药细胞系K562/A02耐药性的研究

目的: 观察非细胞毒性浓度(生长率>95%)氧化苦参碱对耐阿霉素的人白血病细胞系K562/A02多药耐药性的逆转作用,并探讨其逆转机制。 方法: 采用MTT法测定氧化苦参碱的细胞毒性及其对K562/A02细胞敏感性的影响,用流式细胞仪检测非细胞毒性浓度的氧化苦参碱处理后K562/A02细胞膜表面糖蛋白P170表达的变化与细胞内柔红霉素的浓度,应用SPSS13.0软件包对实验结果进行统计学处理。 结果: 氧化苦参碱对K562/A02细胞有一定的细胞毒作用,其非细胞毒性浓度为50μg/ml,低细胞毒性浓度(生长率为85%～90%)为135μg/ml,把非细胞毒性剂量的氧化苦参碱作为最佳逆转浓度,非细胞毒性浓度氧化苦参碱可显著降低阿霉素对K562/A02细胞的IC₅₀,使K562/A02细胞的IC₅₀由原来的(34.9±0.21)μg/ml降低至(13.3±0.21)μg/ml,其逆转倍数为2.62倍;氧化苦参碱作用于K562/A02细胞后,细胞膜糖蛋白P170的表达从90.22%下调至44.24%(P<0.01);柔红霉素外渗试验显示,氧化苦参碱作用于K562/A02细胞后,细胞内化疗药物的浓度明显增加。 结论: 氧化苦参碱可部分逆转人白血病K562/A02细胞对阿霉素的耐药性,氧化苦参碱通过下调K562/A02细胞膜糖蛋白P170的表达,使其将化疗药物泵出细胞外的功能受到了抑制,使化疗药物在白血病细胞内能达到有效浓度,从而可以杀灭耐药的白血病细胞,达到逆转白血病细胞耐药性的目的。     

环腺苷酸对人白血病多药耐药 K562/ADM 细胞的诱导分化作用

目的：研究环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP)对人白血病多药耐药K562／ADM细胞的诱导分化作用。方法：K562／ADM细胞经0.25-2.0mmol/L cAMP处理后,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术（flow cytometry,FCM)检测细胞周期和P－糖蛋白（P－glycoprotein,P-gp)的表达,免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白cyclin D1和转录因子E2F的表达;同时观察细胞形态学变化和血红蛋白合成功能。结果：cAMP呈浓度和时间依赖性地抑制K562／ADM细胞的增殖（P＜0．01）,细胞形态学上出现红系细胞的形态特征;被诱导的细胞能够合成血红蛋白、cyclinD1和E2F的表达减低。cAMP(0.25mmol/L和1.0mmol/L)诱导24h,多数细胞被阻滞在G1期,S期和G2＋M期细胞显著降低,诱导72h后K562／ADM细胞P－gp表达的阳性率无明显变化（99．8％－99．9％）,但P－gp的表达量显著增加,平均荧光强度分别增高1．24倍和1．28倍。结论：K562／ADM细胞仍保留了分化成熟的潜能,可被cAMP诱导向正常血细胞分化,但在分化诱导过程中,化学诱导剂可导致耐药细胞发生P－gp的应激性表达增强而可能阻抑后续的化学治疗,或对诱导剂产生耐受性。     

汉防己甲素逆转白血病细胞株K562/ADM多药耐药性机制研究

目的 研究汉防己甲素(TTD)对慢性粒细胞白血病急性变白血病细胞株K562／ADM多药耐药(MDR)逆转的机理。方法 采用流式细胞仪检测细胞内化疗药物的浓度及细胞表面P糖蛋白(P-gp)的表达；荧光定量PCR法检测MDR1 mRNA；通过流式细胞仪检测Anexin—V判断凋亡细胞的数量。结果 10μmol/L的TTD处理K562／ADM细胞后，细胞内阿霉素(ADM)的浓度明显提高；K562／ADM细胞MDR1 mRNA／P-gp的表达下降；TTD能增强ADM致细胞凋亡的作用。结论 汉防己甲素的耐药逆转机制除了下调MDR1 mRNA／P-gp的表达引起细胞内抗癌药物的积聚外，增加抗癌药物致细胞凋亡也是耐药逆转的重要原因。．     

马钱子碱对白血病K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用

目的：研究马钱子碱（vauqueline）对人白血病K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用。方法：采用噻唑蓝（MTT）法检测马钱子碱的细胞毒作用;采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）分别检测非细胞毒浓度（IC10）的马钱子碱对K562/A02细胞MDR1 （multidrug resistance gene 1）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein,MRP）、拓扑异构酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ,TopoⅡ）、谷胱苷肽-S-转移酶（glutathione s-transferase,GST-π）mRNA及其蛋白表达的影响。结果：非细胞毒浓度（IC10）的马钱子碱作用后,K562/A02细胞中MDR1mRNA及P-gp表达降低（P<0.01）。而MRP、TopoⅡ、GST-π mRNA及其蛋白的表达无明显变化（P>0.05）,同时马钱子碱能增加化疗药物在白血病细胞内的积累。结论：马钱子碱能部分逆转K562/A02细胞的耐药性,其作用机制可能与下调K562/A02细胞MDR1 mRNA的表达,导致细胞膜上P-gp的表达量减少,化疗药物从细胞内溢出减少有关。     

紫杉醇联合INF-α-2b对K562细胞的诱导凋亡作用

目的 研究紫杉醇联合INF-α-2b对K562细胞的诱导凋亡作用。方法 应用体外培养的K562细胞株，经不同浓度的紫杉醇及INF-α-2b培养48h后，采用MTT法检测细胞杀伤活性变化，应用流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞DNA，采用Annexin—V法检测凋亡细胞，并设立对照组。结果 经紫杉醇联合INF-α-2b处理后的K562细胞生长抑制率及凋亡率，较单用紫杉醇或单用INF-α-2b处理的K562细胞明显增高。结论 紫杉醇联合INF—α-2b后诱导K562细胞凋亡的作用明显增强。