恩度对不同状态内皮细胞表面标记物影响的实验研究

目的:检测恩度对不同生长状态的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用,以及对其表面分子标志物的影响,研究二者的内在联系,初步探讨恩度的作用机制.方法:制备3种生长状态的HUVEC细胞:刚贴壁细胞、对数生长期细胞及经TNF-α250IU/mL作用6h后HUVEC细胞.检测恩度作用于不同生长状态内皮细胞后的分子表面标志物CD105、CD62E变化.探讨各表面标记物与细胞生长的不同状态及其经恩度作用后的变化与其不同作用浓度和时间的关系.结果:恩度作用后HUVEC表面分子标志物的检测结果为:1)CD105变化:刚贴壁HUVEC细胞、对数生长期细胞的表达均随恩度的作用浓度及时间变化下调,有统计学意义(P<0.05).2)CD62E的变化:只在经TNF-α 250IU/mL作用6h后细胞组在恩度作用24h时间段内随恩度浓度增加下调,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组均无显著性差异(P>0.05).结论:一定浓度的恩度可能不足以诱导内皮细胞凋亡,却可以明显抑制其活化,使其转入"静止状态",其活化标记物也随之下调.     

人血管生成素-1对血管内皮细胞增殖及凋亡影响的研究

目的:探讨人血管生成素1（angiopoietin1, Ang1）对人脐静脉内皮细胞(human umbilican vein endothelia cell, HUVEC)增殖和凋亡的影响，以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制。方法构建pcDNA3.1 V5HisCAng1真核表达载体，并瞬时转染293细胞;取新生儿脐带经胶原酶消化等方法分离培养HUVEC;分别通过MTT比色和细胞计数法，分析Ang1瞬时转染上清对HUVEC增殖的影响;通过流式细胞仪分析在血浆饥饿实验条件下，Ang1对HUVEC凋亡的影响。结果： 成功克隆了Ang1基因，构建了其正义真核表达载体，并在293细胞中瞬时表达;成功进行了HUVEC的原代分离及传代培养；MTT法检测HUVEC增殖结果：只加培养液组、加空载体转染上清组、加Ang1转染上清组HUVEC OD490值分别为0.36±0.11， 0.40±0.03，0.68±0.10(P<0.05)；细胞计数法检测结果依次为：（10.13±2.06）×104，（8.7±1.73）×104，（15.03±1.98）×104(P<0.05)。流式细胞仪检测HUVEC凋亡率依次为： 21%，19%和6%。结论： Ang1能显著促进血管内皮细胞体外增殖，抑制血浆饥饿时HUVEC的凋亡。     

RhoC 过表达对人脐静脉内皮细胞体外迁移 及血管生成能力的影响

 目的　探讨RhoC 基因过量表达对内皮细胞体外迁移及血管生成过程的影响。方法　构建 RhoC 真核表达载体,以脂质体转染人脐静脉内皮细胞( HUVE) ,采用RT2PCR 和Western blot 检测 RhoC 的mRNA 及蛋白表达水平; 划痕实验检测细胞迁移能力; 胶原基质胶三维培养检测内皮细胞体 外血管生成能力。结果　转染RhoC 实验组与空载体对照组比较,RhoC mRNA 和蛋白表达明显增高; 细胞迁移能力和血管样结构生成能力明显增强。结论　RhoC 高表达能促进人脐静脉内皮细胞体外迁 移及血管生成。     

胆固醇诱导内皮细胞凋亡及抑制细胞增殖的实验研究

背景与目的:探讨胆固醇(cholesterin)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)凋亡及细胞增殖的影响,同时观察CuSO4溶液在其中所起的作用.材料与方法:实验分为8组:对照组(等体积溶剂)、胆固醇低剂量组(25 mg/L)、中剂量组(50 mg/L)和高剂量组(100 mg/L);另外4组分别为以上各组加入终浓度为10 μmol/L的CuSO4溶液.应用流式细胞仪检测不同浓度胆固醇对细胞凋亡率的影响;应用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT试验)检测细胞的生存率.结果:不同浓度的胆固醇可不同程度地诱导HUVEC细胞发生凋亡,可明显抑制HUVEC细胞增殖,且随浓度增高,其作用均明显增强.同时发现各组加入CuSO4溶液后可使其细胞凋亡率明显增加,生存率下降.结论:胆固醇可以诱导内皮细胞凋亡及抑制细胞增殖,CuSO4溶液可促进胆固醇对HUVEC的损伤作用.     

金雀异黄酮对同型半胱氨酸诱导的内皮细胞氧化损伤的保护作用

背景与目的:探讨同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)诱导的人脐静脉内皮细胞株ECV-304的氧化应激损伤及金雀异黄酮(genistein,GEN)对这种损伤的保护作用.材料与方法:以5.0 mmol/L的HCY作用于ECV-304细胞;同时设不同浓度的GEN(10、50、100 μmol/L)保护组,各保护组预先加入GEN孵育12 h后,再加入5.0 mmol/L的HCY.通过四噻氮唑盐(MTT)比色法观察细胞活性,使用流式细胞术检测胞浆活性氧(ROS)水平. 结果:HCY可降低ECV-304细胞的细胞活力,HCY处理后的细胞ROS水平与对照组相比明显升高(P<0.01);经不同浓度的GEN预处理后,细胞活性较单独HCY处理组显著增高(P<0.05),而50和100 μmol/L GEN处理组ROS水平较单独HCY处理组显著降低(P<0.05),且呈现剂量依赖性.结论:HCY可使ECV-304细胞氧化应激损伤,活力下降,而GEN具有抗氧化作用,能降低内皮细胞氧化损伤的程度.     

石见穿有效部位对血管内皮细胞生物学行为的影响

目的:探讨石见穿氯仿及乙酸乙酯部位在体外对血管内皮细胞生物学行为的影响。方法:培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)至3-6代,采用MTT实验、Transwell小室迁移实验、体外小管形成实验观察石见穿氯仿及乙酸乙酯部位对HUVECs体外增殖、迁移、小管形成能力的影响。结果:3.125-25μg/ml的石见穿氯仿部位及乙酸乙酯部位作用于HUVEC 48h,增殖抑制率分别为17.36%-53.08%、9.53%-31.36%,而作用于人肺癌细胞A549增殖抑制率分别为7.10%-31.18%、2.24%-21.69%,两者相比有明显差异细胞毒作用(P=0.001)。3.125-25μg/ml的石见穿氯仿及乙酸乙酯部位作用HUVECs 12h后,迁移抑制率分别为5.39%-57.38%、1.92%-37.37%。3.75-25μg/ml石见穿氯仿部位作用24h时HUVEC小管形成数目减少且管腔不完整,相同浓度石见穿乙酸乙酯部位抑制作用较弱。结论:石见穿氯仿部位抑制内皮细胞增殖、迁移和小管形成作用明显优于乙酸乙酯部位,为石见穿发挥抗血管生成的主要作用部位。     

重组人血管内皮抑制素抑制内皮细胞血管生成的实验研究

目的:观察国产重组人血管内皮抑制素(Endostar,恩度)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的抗血管生成作用,并对其机制进行初步探讨.方法:采用MTS/PMS系统测定不同浓度恩度对HUVECs和人肝癌细胞株HepG2的生长抑制作用;流式细胞术检测恩度在相同时间内诱导HUVECs和HepG2细胞早期凋亡和晚期凋亡情况;通过迁移/侵袭实验、体外管腔形成实验和鸡胚尿囊膜(CAM)实验观察恩度对HUVECs迁移/侵袭和体内外管腔形成及功能的影响.结果:不同浓度的恩度持续作用72h,对HUVECs具有抑制增殖,且在50～200ng/ml的剂量范围内呈现浓度依赖关系;而对HepG2细胞未见明显作用.药物处理方式的不同,恩度对HUVECs诱导凋亡和迁移/侵袭作用差异显著;对HepG2细胞的迁移/侵袭未见明显影响.高剂量的恩度对HUVECs体外管腔形成和鸡胚尿囊膜的血管发生及成熟具有显著影响.结论:重组人血管内皮抑制素(恩度)能够有效地抑制血管内皮细胞形成复杂的管腔,并显著影响血管的成熟;对人肝癌细胞系HepG2生长及迁移/侵袭未见明显影响.     

肿瘤血管靶向肽GX1的受体筛选

目的:筛选肿瘤血管靶向肽GX1(CGNSNPKSC)的受体.方法:化学合成生物素标记的GX1,分离培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs),培养并收集共培养人脐静脉内皮细胞(co-HUVECs)全蛋白;应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与GX1结合的蛋白质;采用银染检测,确定并获取特异性蛋白条带;利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)及生物信息学分析,对条带蛋白进行测序和分析.结果:免疫沉淀和银染法获得与GX1特异性结合的蛋白条带,其分子量在10-15KDa之间.利用MALDI-TOF-MS及生物信息学分析获得了一个有意义的候选蛋白核苷二磷酸激酶A(NDPKA).结论:利用免疫沉淀-质谱法筛选获得了GX1受体的候选蛋白,为研究GX1的作用机制奠定了基础.     

异鼠李素通过减轻氧化应激延缓D-半乳糖诱导的人脐静脉内皮细胞衰老

目的：探讨沙棘中的重要成分异鼠李素（ISO）对细胞衰老的影响及机制。方法：采用D-半乳糖（D-Gal）诱导细胞衰老模型，取20～23代的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分为4组：对照组、D-Gal组、D-Gal+ISO组（5 μmol/L）、D-Gal+ISO组（10 μmol/L）。其中D-Gal浓度为10 g/L，干预时间为72 h。采用CCK-8试剂盒检测各组细胞活力；衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色试剂盒检测细胞衰老状态；各相关试剂盒检测细胞总活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性。Western blot法检测衰老标志蛋白p21、p27和核因子NF-E2相关因子2（Nrf2）及其下游蛋白表达水平。结果：ISO浓度≤10 μmol/L时对HUVEC无明显毒性作用；与对照组比较，D-Gal能够诱导细胞衰老指标SA-β-Gal活性增加（P<0.05）；提高p21、p27表达水平，提高细胞总ROS水平和MDA含量，降低总SOD和CAT活性，降低Nrf2及下游蛋白表达水平（P<0.05）。与D-Gal组比较，ISO能够降低细胞SA-β-Gal活性，抑制p21、p27表达，降低细胞总ROS水平和MDA含量，提高总SOD和CAT活性，增强Nrf2及下游蛋白表达（P<0.05）。结论：ISO可以通过减轻氧化应激，延缓D-Gal诱导的HUVEC细胞衰老，在此过程中激活Nrf2通路可能是其发挥抗衰老作用的重要机制。     

canstatin基因转染对肺癌A549细胞和血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的　肿瘤的生长和转移需要大量新血管的生成,人血管能抑素(canstatin)是新近发现的高效内源性血管生成抑制剂,其抑制血管内皮细胞的作用已引起人们广泛关注。本研究的目的是探讨can statin基因在人肺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞HUV ECC中的表达及意义。方法　将canstatin基因通过电穿孔的方法转染人肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUV ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS PAGE电泳检测canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果　canstatin在转染组A549 细胞和ECC细胞表达并分泌至上清液中。canstatin基因转染组ECC的凋亡率(16.04%)显著高于空载体组(0.43%)和亲代细胞组(2.92%)(P<0.01),转染细胞生长明显受抑(P<0.01)。而转染组A549细胞的凋亡率(0.19%)与空载体组(0.13%)及亲代细胞组(0.07%)比较无显著性差异(P>0.05),细胞生长也未受明显影响。结论　canstatin能特异地抑制内皮细胞增殖,并诱导内皮细胞凋亡。     

血管内皮细胞生长因子在非小细胞肺癌中的表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肿瘤微血管密度(MVD)2项指标与非小细胞肺癌各临床病理因素之间的关系以及两者之间的联系。方法采用免疫组织化学SABC法检测经病理检查确诊的68例非小细胞肺癌、13例癌旁和13例正常肺上皮组织VEGF、FVⅢ因子相关抗原的表达,对FVⅢ因子相关抗原标记的血管计数MVD。结果肺癌组织VEGF阳性表达率和MVD值明显高于正常肺上皮组织和癌旁组织;肿瘤直径≥5.0cm者MVD值明显高于直径<5.0cm者;腺癌MVD值明显高于鳞癌;有远处器官转移的肺癌MVD值明显高于无远处器官转移者;Ⅳ期肺癌MVD值明显高于Ⅰ期和Ⅱ期者,Ⅲ期MVD明显高于Ⅰ期,MVD值随TNM分期增加有逐渐增高的趋势;VEGF表达阳性的肺癌MVD值明显高于表达阴性者,并且随着VEGF表达程度的加强,MVD值增加。结论血管生成与肺癌的生长、浸润、转移及疾病进展密切相关;肺癌组织VEGF阳性表达率明显增加,是肺癌血管形成和维持的重要因子之一;MVD可作为判断非小细胞肺癌生物学行为,预测其发生发展的1项指标。     

大肠癌组织血内皮生长因子表达与血管生成和细胞增殖关系的研究

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）在大肠癌组织中的表达及其与血管生成和细胞增殖的关系。方法：应用免疫组织化学方法检测98例大肠癌组织中VEGF表达及微血管密度（MVD）、PCNA标记指数（PCNA LI）,并分析VEGF与MVD、PCNA LI的相关性。结果：98例大肠癌中,VEGF表达阳性36例（３６．７％）;VEGF表达阳性的肿瘤其ＭＶＤ和ＰＣＮＡ ＬＩ显著高于VEGF阴性（Ｐ＜０．０５）。VEGF表达与ＭＶＤ、ＰＤＮＡ LI显示正相关（P＜0．05）。有转移组（有包淋结转移移和远处转移VEGF表达明显高于无转移,VEGF表达随肿瘤分期的升高而增高。结论：VEGF在大肠癌血管生成和细胞增殖中起重要作用。     

血管内皮生长因子在小细胞肺癌组织中的表达及其与预后的相关性研究

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)在小细胞肺癌(SCLC)肿瘤组织中的表达及对其预后的影响。方法采用polymer免疫组化方法检测64例SCLC患者肿瘤组织中VEGF水平。结果 64例SCLC患者中VEGF阳性表达率为43.3%,且所有患者均为弱阳性表达。57例获随访的患者中,VEGF表达阳性与阴性患者的中位生存期比较无统计学差异(14个月vs 21个月,P=0.539)。结论 VEGF表达与患者的预后无显著相关。     

紫龙金对人非小细胞肺癌A549细胞生长及VEGF表达的影响

观察紫龙金和顺铂对人非小细胞肺癌A549细胞增殖及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,探讨中药紫龙金抗癌机制。方法：体外培养A549细胞,采用MTT法检测紫龙金和顺铂对细胞生长的影响,RT-PCR定量检测细胞VEGF的表达,ELISA法检测细胞上清液中VEGF含量变化。结果：紫龙金和顺铂均可抑制A549细胞的增殖,细胞存活率随药物浓度的升高而下降（F紫龙金=4 996.216,P紫龙金<0.001;F顺铂=6 834.121,P顺铂<0.001）。同一药物浓度,细胞存活率随处理天数的增加而下降（F紫龙金=13.366,P紫龙金<0.001;F顺铂=1 471.067,P顺铂<0.001）。紫龙金作用24 h和72 h,A549细胞VEGF mRNA的表达随药物浓度提高而下降（F=216.826,P<0.001）;而顺铂作用24 h,VEGF表达反而随浓度升高而上升。顺铂与紫龙金配伍后,随药物浓度的提高对VEGF表达均表现出抑制作用（F=4.318,P<0.05）。结论：紫龙金能抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖,下调细胞VEGF表达,体现出多靶点抗癌作用;顺铂通过抑制细胞周期抑制A549细胞增殖,未见抑制VEGF转录水平的表达。     

肺癌患者血清VEGF含量检测的临床意义

目的　探讨肺癌患者血清血管内皮生长因子 (VEGF)含量变化的意义及其影响肺癌生长及转移的作用机制。方法原发性支气管肺癌 63例 ,采用免疫组化染色检测肺癌组织VEGF表达情况 ,酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定血清VEGF含量 ,采用Kaplan Meier方法比较不同血清VEGF含量者的生存情况。 结果　肺癌患者血清VEGF含量明显高于正常对照组 ,不同性别、年龄、组织学类型、分化程度及T分期 (肿瘤原发状态 )血清VEGF含量无显著性差异 ,不同N分期 (淋巴结转移 )及临床分期间血清VEGF含量有显著性差异。肺癌患者血清VEGF含量与肺癌组织VEGF表达呈正相关。血清VEGF高含量患者生存时间明显短于血清VEGF低含量者。结论　血清VEGF与肺癌淋巴结转移及临床分期进展密切相关 ,血清VEGF含量可作为判断肺癌淋巴结转移潜能及预后评价的可靠参考指标。肺癌细胞分泌VEGF进入血液循环 ,从而促进肺癌的生长及转移     

康艾注射液辅助化疗对晚期非小细胞肺癌患者血清VEGF表达的干预作用

 目的探讨康艾注射液辅助化疗对晚期非小细胞肺癌患者血清VEGF（sVEGF）表达的干预作用。方法将入组的46例晚期非小细胞肺癌患者随机分为实验组（康艾注射液联合化疗组,23例）和对照组（单纯化疗组23例）,应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者治疗前后sVEGF表达水平,并加以比较。结果肺癌患者sVEGF水平明显高于健康对照者（P＜0.05）。鳞癌组sVEGF高于腺癌、大细胞癌和腺鳞癌组（P＜0.05）,而腺癌、大细胞癌和腺鳞癌组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。中低分化组sVEGF较高分化组有增高但差异无统计学意义（P＞0.05）。和治疗前比较,康艾注射液联合化疗组和单纯化疗组治疗后sVEGF水平均明显降低（P＜0.05）。和单纯化疗组比较,康艾注射液联合化疗组治疗后sVEGF下降更为显著（P＜0.05）。结论康艾注射液辅助化疗可降低晚期非小细胞肺癌患者血清VEGF水平,对抑制肿瘤血管形成有一定的作用。血清VEGF有望作为肿瘤标志物用于肺癌患者的诊断和化疗或生物治疗等的疗效评价。     

肾癌组织中血管内皮生长因子表达的意义

目的 探讨肾癌组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达及与临床病理的关系。方法 应用免疫组织化学方法,对6例肾癌组织中的VEGF进行检测。结果 肾癌组织中VEGF阳性表达率为73．9％,阳性着色于细胞质和细胞膜,VEGF表达与肿瘤大小、细胞类型和病理分级均无关（P＞0．05）,Ⅲ＋Ⅳ期强阳性表达率明显高于Ⅰ Ⅱ期（P＜0．05）,VEGF阳性表达者5年生存率明显低于阴性表达者。结论 VEGF表达与肾癌生物行为有重要影响,其可能成为预测肾癌转移和预后的指标。     

血管内皮生长因子在大肠癌诊治中的应用研究

目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）在结直肠癌的诊断、良恶性鉴别以及在复发中的意义。方法 收集85例结直肠癌患者术前（其中13例有术后1周对照）及21例术后半年到4年结直肠癌患者的静脉血,对照组30例,采用酶联免疫夹心法检测血清中VEGF浓度。结果 结直肠癌早期患者（Duke＇sA期）血清VEGF浓度较对照组显著升高（P＜0．01）。Duke＇sA、B期间血清VEGF浓度有显著性差异（P＜0．05）,有淋巴结转移组（Duke＇sC期）较无淋巴结转移组（Duke＇sB期）的血清VEGF浓度显著升高（P＜0．01）,有远处脏器转移组血清VEGF较淋巴结转移5组亦显著升高（P＜0．01）。高分化腺癌组（含Duke＇sA期5例和B期3例）血清VEGF与对照组比较,无显著性差异（P＞0．05）。术后半年到4年的患者,复发组血清VEGF与末复发组比较,有非常显著性差异（P＜0．01）。结论 血清VEGF水平的检测对结直肠癌的诊断有一定的临床意义,可反映疾病的进展对肿瘤恶性程度的判断有一定的帮助。血清VEGF浓度变化还可监测癌症患者术后肿瘤复发和转移。     

手术前后血清血管内皮生长因子水平与非小细胞肺癌的关系

目的探讨非小细胞肺癌患者手术前、后血清血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的动态变化规律及其与非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer.,NSCLC)的关系。方法采用ELISA法检测120例非小细胞肺癌患者手术前、后血清VEGF水平和60例健康体检者血清VEGF水平。结果①NSCLC患者手术前、术后第1天及术后第7天血清VEGF水平显著高于正常对照组(P<0.01),分别为:(270.8±82.4)pg/ml、(302.7±85.6)pg/ml、(523.8±91.3)pg/ml和(91.4±40.7)pg/ml;②NSCLC患者术后第7天血清VEGF水平显著高于术前和术后第1天血清VEGF水平(P<0.01),分别为:(523.8±91.3)pg/ml、(270.8±82.4)pg/ml和(302.7±85.6)pg/ml;③NSCLC患者手术前、后血清VEGF水平与肺癌原发肿瘤大小、淋巴结转移和分期呈正相关(P<0.05),与肺癌细胞分化程度、组织学类型、患者性别和年龄无关(P>0.05)。结论NSCLC患者血清VEGF水平升高,且与NSCLC的发生、发展和淋巴结转移呈正相关,NSCLC患者血清VEGF水平可作为检测NSCLC患者病情进展、判断预后的参考指标。     

人脑胶质细胞瘤中血管内皮生长因子基因的表达研究

目的　研究血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor ,VEGF)在脑胶质细胞瘤中的表达及其与肿瘤病理分级、新生血管形成的关系。方法　采用Northern杂交和免疫组织化学染色检测 3 0例脑胶质瘤标本 ,2例脑胶质瘤细胞株 ,4例正常脑组织的VEGFmRNA和蛋白表达水平。结果　正常脑组织中VEGFmRNA的表达水平极低 ,而脑胶质瘤组织和细胞系中VEGFmRNA的表达水平高 ,P <0 .0 5。在正常脑组织中未见VEGF免疫组化染色阳性细胞 ,脑胶质瘤组织和细胞系中VEGF高表达 ,P <0 .0 5。随着脑胶质瘤恶性程度的增加 ,VEGFmRNA的表达增高 (γ =0 .85 ,P <0 .0 1)。VEGF的表达还与肿瘤的血管密度相关 (γ =0 .88,P <0 .0 1)。结论　脑胶质瘤中VEGF的异常表达 ,是判断脑胶质细胞瘤恶性程度和血管丰富程度的 1项客观指标。