微波炉快速制备琼脂糖凝胶板

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定、纯化DNA片段的标准方法。常用制备琼脂糖凝胶的是煮沸法,我们则将琼脂糖置于三角烧瓶中,加入一定量的TBE缓冲液放入微波炉中,开满档定时为60s即可完全溶解,取出后即可制备凝胶板。全过程仅用5min。用此     

制备电泳分离回收DNA片断

从凝胶中回收DNA片断已有不少报导:机械破碎凝胶和从凝胶基质扩散DNA,电洗脱;玻璃粉法和DEAE—纤维素纸法。这些方法各有利弊。我们基本上参照Strongin等的电洗脱法,从凝胶中回收DNA,其回收率达到80％左右,不含有凝胶基质的污染,所得DNA是均一的,可用作同位素标记探针,酶切分析和重组克隆。     

用离心法从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

借助离心式层析柱，成功地从琼脂糖凝胶中分离０．２８７～２３．１３ｋｂ范围的ＤＮＡ片段；所得片段经乙醇沉淀、溶解后可有效地用于酶切、连接与转化。此法设备要求简单，操作省时简便，得率在５０％以上。     

一种染琼脂糖凝胶中DNA的新方法

琼脂糖凝胶电泳是分离DNA分子的一种主要方法,应用很广。目前观察琼脂糖凝胶中DNA的最普遍的方法,是利用荧光染料溴化乙锭(ethidium bromide)进行染色,在紫外灯下检测呈现荧光的DNA带型。虽然此方法很简便,也具有较好的灵敏度(可测到10ng的DNA含量),但溴化乙锭是一种强的致突、致癌剂,并有中度毒性,长期广泛使用,将污染环境、损害人体。本文将以往用来染细胞核的染料亮甲酚蓝(brilliant krecy blue),直接用于DNA分子的染色,建立了一种新     

温度和二甲亚砜对放射诱导哺乳动物DNA双链断裂的影响

目的 :研究放射引起人乳腺癌细胞株 (MCF- 7)和完整细胞的染色体 DNA双链断裂 (DSB)时 ,亚生理辐射温度 (2℃～ 2 8℃ )的效应和自由基清除剂二甲亚砜 (DMSO)的影响 ,以及细胞在 2℃或 37℃照射后 DSB的重接。方法 :1MCF- 7细胞用含 10 %胎牛血清的 EME培养液于 37℃、5 % CO2 培养 ,传 12～ 2 0代后用 1 4 C胸腺嘧啶核苷(1k Bq/ m L )标记 DNA 7d;2染色体 DNA制备 :制细胞数为0 .5× 10 6 / m L～ 1.0× 10 6 / m L的琼脂糖凝胶块 ,EDTA- NL S-蛋白酶 K缓冲液于 37℃裂解凝胶块中的细胞 48h,冷藏10 d;3染色体 DNA照射 :…     

用改进的探针杂交法检测免疫球蛋白重链基因重排

对传统的Southern杂交法进行了改进:用碱变性和酚抽提法提取重组质粒,省去氯化铯梯度离心;用随机引物合成法代替缺口翻译,直接标记质粒,不进行限制性内切酶消化和琼脂糖电泳分离探针DNA片段;用酒精沉淀法代替柱层析收集标记的放射性探针.用低熔点琼脂糖法提取细胞染色体DNA,经酶切电泳,将凝胶板干燥,进行原位杂交;杂交液采用0.5%脱脂奶粉,以代替Danhardt's溶液和鲑鱼精子DNA.用此法检测了4株急性淋巴细胞白血病细胞株,发现只有1株T细胞未发生免疫球蛋白重链基因重排,其余3株B细胞两条重链均已发生重排.此法简便、灵敏,可用于白血病临床诊断.     

限制性内切核酸酶BglⅡ的分离纯化

据文献报告,由球芽孢杆菌(Bacillus globigii)分离纯化限制性内切核酸酶BglⅡ的方法有:离子交换层析法,即通过磷酸纤维素(pll)柱和羟基磷灰石柱二步层析纯化(3),亲合层析法,即通过肝素-琼脂糖凝胶柱层析或汽巴蓝(cibacron blue)-琼脂糖凝胶柱层析纯化(1、2)。我们依据Bickle等人(1977)方法,采用肝素-琼脂糖凝胶层析法纯化了BglⅡ酶。     

两种全血基因组DNA提取方法的比较

目的比较两种不同的DNA提取方法提取人全血基因组DNA,对DNA提取率、纯度以及PCR扩增的效果影响.方法分别用传统的酚、氯抽提法和改良法两种不同的方法,提取人全血基因组DNA.结果两种方法提取的DNA纯度用光吸收比值为指标检测A280/260值为:1.45和1.82,提取DNA总量分别为187μg/ml和260 μg/ml.用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定改良法制备的DNA效果较好,PCR扩增效果有差异.结论用改良法提取的DNA总量明显较高,提取效率高,PGR扩增的效果好,是全血基因组DNA提取中首选考虑的方法.     

绞股蓝皂甙诱导人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞凋亡的研究

 目的 探讨绞股蓝皂甙诱导人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌GNM细胞凋亡的发生机制.方法 采用活细胞观察、超微结构观察、流式细胞仪及DNA琼脂糖凝胶电泳进行观察和检测.结果 50μg/ml的绞股蓝皂甙作用于GNM细胞后,细胞出现典型的核染色质凝集、核固缩、破裂;用FCM检测到G1峰前出现亚二倍体核型峰,DNA琼脂糖凝胶电泳带呈现DNA断裂损伤.结论 绞股蓝皂甙可诱导人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞发生凋亡.诱导细胞凋亡可能是其抑癌机理之一.     

随机扩增多态性DNA最佳模板提取方法的探讨

目的　获得最佳模板提取方法用于随机扩增多态性DNA(RAPD)。方法　对 4种方法 (挑丝法、沉淀法、水清法和裂清法 )提取的模板DNA进行琼脂糖电泳、紫外线扫描及随机扩增多态性DNA ,比较其片段大小、纯度及RAPD指纹图差异。结果　挑丝法和沉淀法均可提取出大于 2 3kb且纯度较高的模板DNA ,二者指纹图完全一致且均有 2～ 4kb的较大片段。水清法和裂清法提取的模板有弥散、碎裂的DNA并纯度较差 ,指纹图上仅有 6 0 0～ 2 0 0 0bp的较小片段。 结论　用挑丝法或沉淀法提取的模板DNA最适于进行RAPD。     

传统DNA探针实验方法的简化及应用

本文报告一种适于普通实验室开展DNA探针工作的实验方法.我们用酚-氯仿抽提法制备探针供体菌重组质粒DNA,用透析袋电泳洗脱法从凝胶中回收酶切目的片段,用缺口翻译技术制备α-~(32)PdNTP标记探针,用低脂奶粉和6SSC(1×SSC:0.15M NaCl,0.015M柠檬酸三钠,pH7.0)代替Denhardt试剂等获得了满意的菌落原位杂交和Southern blot杂交结果.此外,我们将传统实验方法规定的时间相应缩短,从而有可能在15～24h内对痢疾腹泻患者标本作出明确诊断.这些方法可供基层实验室应用DNA探针开展传染病诊断和流行病学调查.     

λDNA的分离纯化

报道了λ噬菌体在大肠杆菌Ｗ１４８５中增殖，裂解的条件。用５’－磷酸二酯酶与Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００凝胶过滤纯化的λＤＮＡ，在琼脂糖凝胶呈一条带。经自行纯化的ＥｃｏＲⅠ限制性内切酶切割后，琼脂糖凝胶电泳出现了６个片段，证明了该酶对它具有５个切点。     

PB231诱导K562细胞凋亡的初步研究

 目的研究PB231诱导K 562细胞凋亡作用,探讨PB231的抗肿瘤机制.方法采用荧光显微镜观察细胞形态学变化,MTT法测定PB231对K 562细胞生长抑制作用,琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA裂解.结果K562细胞经PB31处理后,在倒置光显微镜下可见细胞变形和凋亡小体形成;荧光显微镜下可见染色质凝集.MTT法检测其IC50值为5×10-5M.琼脂糖凝胶电泳呈典型的"DNA Ladder".结论PB231可诱导K562细胞发生凋亡.这可能是其抑制K562细胞生长的作用机理之一.     

藻酸盐凝胶三维培养条件下牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠对兔关节软骨细胞表型的影响

目的 探讨牛胰岛素一转铁蛋白-硒钠(ITS)对藻酸盐凝胶三维培养条件下兔关节软骨细胞表型的影响. 方法 分离培养兔关节软骨细胞,将单层培养的P2代细胞接种于藻酸盐凝胶中,分别在DMEM培养液中加入10%胎牛血清(FBS).0.2%FBS+1%ITS、1%ITS即设为FBS组、ITS/FBS组,ITS组行DNA、蛋白聚糖(GAG)含量测定及组织化学检测. 结果 软骨细胞在藻酸盐凝胶中始终保持球形样外观,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性.3组GAG合成无显著性差异(P＞0.05).培养的第6天ITS组DNA含量低于FBS组(P＜0.05),第12天低于ITS/FBS组和FBS组(P＜0.05). 结论 ITS可促进藻酸盐凝胶中软骨细胞的增殖,并保持其表型.     

胶原酶溶解术治疗腰椎间盘突出症疗效分析

目的 评价胶原酶溶解术的近、中、远期疗效.方法 对1279例行胶原酶溶解术、资料完整的腰椎间盘突出症患者进行随访观察,随访时间和例数分别为:0.5～1年(近期)1011例,2～4年(中期)967例,6～8年(远期)661例,按统一的疗效标准评价胶原酶溶解术的近、中、远期疗效.结果 最佳适应证近期、中期、远期优良率分别为89.5%、82.4%、80.4%.结论 在最佳适应证范围内,胶原酶溶解术是腰椎间盘突出症的一种有效的微创治疗方法.     

人血浆前白蛋白的纯化及其抗血清制备

为建立免疫学方法测定人体血清前白蛋白(PA)水平,进行了人体血浆PA纯化及其抗血清制备,并测定了部分健康人血清PA水平。 材料与方法 一、PA的纯化 参照Cowley等[Clin ChimActa.1983;134(1～2)69.]介绍的方法,按下列步骤进行:(1)二乙氨乙基纤维素(DEAE)层析。(2)制备电泳(1g/d1琼脂糖凝胶)。(3)Sepharose6B柱层析。(4)再次制备电泳。     

聚合酶链反应检测嗜肺军团菌的实验研究

 目的探讨并建立聚合酶链反应(PCR)用于检测嗜肺军团菌的方法.方法用PCR方法扩增嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子基因(mip)片段,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;分析其特异性和敏感性.结果在嗜肺军团菌14个血清型参考株均扩增出特异的340bp片段,而三株非嗜肺军团菌及其他需鉴别诊断的常见病原菌均未扩增出此特异条带.检测灵敏度为2.6 pg/ul基因组DNA.结论依据mip基因建立的嗜肺军团菌PCR检测方法具有高度的敏感性和特异性,是诊断与鉴别诊断嗜肺军团菌感染的一种有效手段.     

t-PA突变体乳腺表达载体的构建及其在乳腺中的瞬时表达

目的 :探索建立乳腺瞬时性表达系统 ,用于快速检测所构建的乳腺表达载体的有效性 ,为进行转基因动物实验奠定基础。方法 :DNA常规操作 ;孕小鼠乳腺注射 ;纤维蛋白琼脂糖平板法检测Mut PA。结果 :构建了含有Mut PA基因的乳腺表达载体pB3mt PA ,将此载体直接注射到孕小鼠乳腺中进行暂时性表达 ,产仔后第 4天采乳汁 ,用纤维蛋白琼脂糖平板法检测t PA的活性 ,表达活性可达 2 0～ 4 0U/ml,其活性能被天然的t PA多克隆抗体所中和 ,表达持续期 8d。结论 :所克隆的牛BLG基因 70 5bp的 5′端调控序列包含了必需的调控元件 ,并具有调控外源基因的表达的功能 ,克隆的 3′端序列是适合的。构建的表达载体可用于制备转基因动物。     

用ФОР-ТВЗКС放化分离~(90)Y

直接从溶解的样品中分离~(90)Y的方法是萃取分析法。众所周知,这种分离方法是用Мцомф萃取样品中所含的~(90)Y,并测量其在有机相中的活度。但在此条件下,若测定钇的产额则往往是困难的。现工作是验证从溶解的样品中,析出钇和用ФОР-ТВЗКС分离掉其杂质的可行性。将鳕鱼和黑背鲱鱼的骨骼放在105°～110℃烘干,然后在400～450℃下灰化2小时。取50～75克灰样用浓硝酸浸湿.加入准确量放射性活度的~(90)Sr+~(90)Y。样品在尽最少的浓硝酸中加热溶解,往溶液中加入一定量的锶和钇的稳定性同位素作载体。钇量按下述计算加入:其流入到交换柱中的含量不超过5mg/cm~3 ТВКС。所得的溶液用NH_4OH将酸度调节到0.2mol/l。将100ml体积的试液流经装有     

一种快速鉴定核糖核酸质量的方法

目的：建立一种快速鉴定RNA完整性的方法。方法：在常规琼脂糖电泳的基础上,结合甲醛变性琼脂糖凝胶电泳加以改进而成。结果：提取的总RNA用此方法电泳后可得到28S、18S、5.8s(5s)三条清晰的RNA条带。结论：此方法可用于对RNA完整性进行快速鉴定。