血管内皮生长因子与细胞支架复合物修复大鼠股骨缺损

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)与骨髓间充质干细胞(MSCs)、纳米晶胶原基骨(nHAC)复合物对大鼠股骨缺损的修复作用.方法:将20只SD大鼠制成股骨缺损模型后分2组:对照组植入MSCs/nHAC复合物,实验组植入VEGF/MSCs/nHAC复合物.术后第2,4,8周行影像学和组织学观察;术后第8周行新生骨痂环境扫描电镜(ESEM)检查.结果:术后第2,4,8周实验组与对照组放射学检查评价骨生成差异有统计学意义(P<0.05).组织学观察发现实验组较对照组能更快更有效地促进大鼠股骨缺损处的骨痂生长.结论:VEGF/MSCs/nHAC支架较MSCs/nHAC支架对骨缺损的修复有更好的效果.     

骨髓间充质干细胞复合音猬因子/纳米晶胶原基骨修复骨缺损

目的:探讨骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells)复合音猬因子(sonic hedgehog,Shh)修饰的纳米晶胶原基骨(nano Hydroxyapatite/collagen, nHAC)修复大鼠股骨缺损的效果.方法:SD大鼠 MSCs经成骨诱导后,种植于支架材料形成细胞支架复合物.SD大鼠30只制成股骨干5 mm节段性缺损,分为空白对照组:骨缺损处不植植入物,MSCs/nHAC组:植入MSCs/nHAC复合物,MSCs/Shh-nHAC组:植入MSCs/Shh-nHAC复合物.通过大体观察、X线放射学、组织学对比各组骨缺损修复情况.结果:SD大鼠MSCs在体外与nHAC,Shh-nHAC复合培养第7天,电镜扫描证实Shh-nHAC更有利于MSCs黏附、增殖.术后第6、12周放射学检查评价新骨生成各组间差异有统计学意义(P<0.05).术后组织学检查各组新骨生成速度、生成量差异有统计学意义(P<0.05).结论:MSCs/Shh-nHAC复合物能够修复SD大鼠股骨缺损, 修复效果明显优于MSCs/nHAC复合物.     

联合应用成骨诱导后骨髓间充质干细胞与PLGA支架材料修复免桡骨缺损的实验研究

目的研究聚乳酸聚乙醇酸复合物（ Po （ yclactic - co - glycolic acid ）, PLGA ）支架作为组织工程骨支架修复骨缺损的可行性。方法体外培养兔骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）,在成骨诱导荆地塞米松等的诱导下,向成骨细胞转化,并使之与修饰后PLGA支架复合,植入兔桡骨缺损模型,作为实验组。对照组a为PLGA材料对照,对照组b为空白对照,通过影像学观察骨缺损的修复情况。结果地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,碱性磷酸酶表达明显增高,并表达I型胶原。应用多聚赖氨酸修饰的PLGA与成骨诱导的BMSCs复合植入骨缺损后,与对照组相比影像学显示明显促进骨缺损的愈合。结论适当浓度成骨诱导剂可成功的将免骨髓间充质细胞向成骨细胞诱导,诱导后细胞与PLGA支架联合应用可较好修复兔桡骨缺损。     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7（BMP-7）的骨髓基质干细胞（BMSCs）,并与纳米羟基磷灰石胶原（nHAC）材料复合培养体外构建组织工程骨。方法用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养。荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;以四唑盐（MTT）实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶（ALP）活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况。结果慢病毒24h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异（P〉0.05）;RT-PCR检测到BMP-7表达,在1300bp处出现特异性条带;ELISA检测24hBMP-7蛋白含量为（150.2±18.3）pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好。结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨。     

联合应用成骨诱导后骨髓间充质干细胞与PLGA支架材料修复兔桡骨缺损的实验研究

目的研究聚乳酸聚乙醇酸复合物（ Po （ yclactic - co - glycolic acid ）, PLGA ）支架作为组织工程骨支架修复骨缺损的可行性。方法体外培养兔骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）,在成骨诱导荆地塞米松等的诱导下,向成骨细胞转化,并使之与修饰后PLGA支架复合,植入兔桡骨缺损模型,作为实验组。对照组a为PLGA材料对照,对照组b为空白对照,通过影像学观察骨缺损的修复情况。结果地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,碱性磷酸酶表达明显增高,并表达I型胶原。应用多聚赖氨酸修饰的PLGA与成骨诱导的BMSCs复合植入骨缺损后,与对照组相比影像学显示明显促进骨缺损的愈合。结论适当浓度成骨诱导剂可成功的将免骨髓间充质细胞向成骨细胞诱导,诱导后细胞与PLGA支架联合应用可较好修复兔桡骨缺损。     

BMP-2及VEGF双基因骨髓干细胞复合磷酸钙支架生物相容性的体外实验研究

目的制备BMP-2及VEGF双基因骨髓干细胞复合磷酸钙支架,探讨所制备支架材料的生物相容性。方法以磷酸钙粉为原料制备多孔磷酸钙支架材料(CPC),对所得支架材料采用双基因转染的鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)复合共制备成双基因修饰磷酸钙支架材料,采用扫描电子显微镜及万能测试机对材料的表征及物理性能进行评价;复合共培养2周后计算细胞在支架材料上的黏附率,利用倒置相差显微镜及扫描电镜下观察细胞在材料内的黏附和生长情况,分别采用MTT法、碱性磷酸酶活性测定(ALP)及茜素红染色检测MSCs在支架材料上的增殖、分化及矿化情况。结果制备的双基因修饰磷酸钙支架材料具有良好孔隙结构和一定强度;双基因转染的MSCs在支架表面附着良好,细胞增殖测定、细胞ALP及茜素红染色检测显示该材料对MSCs生长和功能表达未见明显抑制作用,生物相容性良好。结论双基因修饰磷酸钙支架材料具有良好孔隙结构和较好力学强度;双基因转染的MSCs可以在其上进行良好的黏附、生长、增殖、分化以及矿化,具有良好的生物相容性。     

兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外构建组织工程骨的实验研究

目的:研究兔骨髓间充质干细胞(marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)与纳米晶胶原基骨修复材料(nano-hydroxyapatite/collagen,NHAC)体外复合培养的结合程度,以及构建组织工程骨的可行性.方法:分离兔MSCs体外培养、纯化,取第3代MSCs与NHAC体外复合培养,第5,10 d后扫描电镜(SEM)观察二者复合程度.结果:兔MSCs贴壁生长,增殖速度快,生长曲线符合Logistic生长曲线;兔MSCs与NHAC体外复合培养,在第5,10 d进行扫描电镜观察,发现10 d时粘附于NHAC上的MSCs细胞数(38.52±7.21)明显高于5 d时粘附的细胞数(21.28±4.70),P＜0.01.结论:兔MSCs与NHAC体外复合培养结合程度较高,可以用来构建组织工程骨,为进一步的动物实验奠定基础.     

万古霉素藻酸盐微球对共培养的间充质干细胞成骨分化的影响

目的 检测纤维蛋白凝胶包裹的万古霉素藻酸盐微球对骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化的影响,探讨其在骨组织工程中可能的应用.方法 应用滴注法制备万古霉素藻酸盐微球,然后用纤维蛋白凝胶包裹,通过检测碱性磷酸酶的活性以及成骨基因的表达来评价不同浓度的微球对共培养的MSCs诱导成骨的影响.结果 MSCs可在不同浓度微球溶液中生长,浓度为0.02、0.2和2.0g/L的藻酸盐微球溶液中的MSCs的碱性磷酸酶的活性依次增强,在成骨诱导的18d内,0、0.02、0.2和2.0g/L相应的最高值分别为(0.809 4±0.028 5、0.803 2±0.023 4、1.236 7±0.028 0、1.562 1±0.059 7)pg·min-1·cell-1.成骨分化的调控基因转录因子核心结合因子1以及Ⅰ型胶原基因在各实验组均有表达. 结论纤维蛋白凝胶包裹的万古霉素藻酸盐微球可促进共培养的MSCs的碱性磷酸酶活性增加,转录因子核心结合因子1和Ⅰ型胶原基因的表达并未被影响.     

体外诱导骨髓间充质干细胞构建纤维蛋白胶软骨模块

目的:探讨体外构建骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性。方法:分离兔骨髓间充质干细胞,种植在改良纤维蛋白胶支架内。实验组培养液中加入TGF-β1和BMP-6,对照组未加入诱导因子。体外进行形态组织学观察。1、2、3和4周取材作Masson染色、Ⅱ型胶原染色和扫描电镜观察。结果:细胞在支架上贴附,增殖。实验组中Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论:TGF-β1和BMP-6可诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化,在改良纤维蛋白胶支架内体外成功构建组织工程软骨模块。     

丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石骨组织工程支架材料的体外细胞毒性评价

目的 探讨丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架与兔骨髓间充质干细胞的体外细胞毒性.方法 采用丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的生物支架与兔骨髓间充质干细胞体外共培养,用材料的细胞毒性、细胞黏附率、细胞增殖活力指标以MTT法、倒置显微镜及电镜观察来评价.结果 细胞在支架材料上黏附、生长良好,分裂增殖活跃,细胞毒性检测CTG均为0级,实验组与时照组细胞黏附率比较无统计学差异（P＞0.05）,实验组与对照组细胞增殖活力随着时间增加,细胞在支架增殖速度增快.第1、3、5、7天实验组与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）.扫描电镜观察发现细胞培养7天后生长良好,分裂正常,与支架材料黏附紧密.结论 支架材料对细胞无毒性,具有很好的细胞相容性.     

曲古抑菌素A对大鼠脂肪干细胞在二维及三维培养下早期骨向分化的影响

目的:研究曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在二维培养板(TCP)和三维复合纳米羟基磷灰石/胶原(nano-hydroxyapatite/collagen,nHAC)支架上早期骨向分化的影响?方法:处理组分别在含75 nmol/L TSA的二维培养板和三维 nHAC上培养ADSCs(TCPT组和nHACT组),未添加TSA的两组(TCP组和nHAC组)为对照组?使用扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)对接种ADSCs 1?3 d后nHAC和nHACT组细胞的生长情况进行表征,以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,分别检测3?5?7 d时的ALP活性,用Western blot检测成骨指标Runx2?骨桥蛋白(OPN)?骨形态发生蛋白2(BMP2)的表达?结果:ADSCs在三维培养中均表现出良好的粘附?铺展,其中经TSA诱导的细胞对支架的黏附?铺展更好;ALP值在3?5?7 d持续增高,其中以nHACT组最高,组间差异显著(P < 0.05);Western blot结果显示Runx2?OPN?BMP2在 nHACT组表达最高,与ALP结果一致?结论:TSA对ADSCs早期骨向分化有促进作用,复合三维支架共培养后促进作用显著?     

全骨髓贴壁法分离培养rBMSCs及成骨诱导探讨

[摘要]　目的 通过研究在体外培养大鼠骨髓基质干细胞(rBMSCs)及其成骨生物学特性,探讨构建骨组织工程种子细胞的方法。方法 通过全骨髓贴壁培养法分离大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、维生素C、β2甘油磷酸钠的诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测碱性磷酸酶活性及钙结节茜素红染色反应,进行成骨细胞鉴定。结果 全骨髓贴壁培养下,骨髓基质干细胞增殖能力强,生长迅速,呈成纤维细胞样生长。诱导条件下细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,并且钙结节茜素红染色反应阳性。结论 采用全骨髓贴壁培养法,骨髓基质干细胞分离培养及体外扩增更为简便迅速,诱导条件下成骨能力肯定,可为骨组织工程构建提供大量种子细胞。     

Biocompatibility Studies on Fibrin Glue Cultured with Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Vitro

By culturing bone marrow mesenchymal stem cells of rabbits with fibrin glue in vitro,the biocompatibility of fibrin glue was investigated to study whether this material can be used as scaffolds in bone tissue engineering. After 2-months old New Zealand rabbits had been anesthetized, about 4--6 ml of bone marrow were aspirated from rabbit femoral trochanter. The monocytes suspension was aspirated after bone marrow was centrifuged with lymphocyte separating medium and cultured primarily. Then the cells were divided into two groups: one was cultured with complete medium and the other with induced medium. The cells of the two groups were collected and inoculated to the culture plate containing fibrin glue. In the control group, cells were inoculated without fibrin glue. The implanted cells and materials were observed at different stages under a phase-contrast microscope and scanning electron microscope. MTT and alkaline phosphatase (ALP) were measured. Bone marrow mesenchymal stem cells grew on the surface of fibrin glue and adhered to it gradually. Cells light absorption value (A value) and the ALP content showed no significant difference. Fibrin glue had no inhibitory effect on cell morphology, growth, proliferation and differentiation. It has good biocompatibility and can be used as scaffold materials for bone marrow mesenchvmal stem cells in bone tissue engineering.     

多肽水凝胶复合支架对大鼠脂肪干细胞体外增殖和分化的影响

目的:研究多肽水凝胶复合骼金(nano-hydroxyapatite/collagen, nHAC)对大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外增殖和早期骨向分化的作用?方法:用1%的多肽水凝胶与nHAC制备复合支架,未复合水凝胶的nHAC为对照组,使用扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)和共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)进行表征,将ADSCs接种到两种支架材料上,以CCK-8检测1?3?5?7 d的增殖情况,以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,检测其3?5?7 d 的活性?结果:多肽水凝胶在nHAC表面形成涂层,ADSCs在有涂层的nHAC上黏附?铺展得更好,两种支架上的ADSCs在1?3?5?7 d都持续增殖,其中两组间在1?3 d无差异,5?7 d有差异,实验组增殖更快(P < 0.05);ALP值在3?5?7 d都持续增高,实验组更高,两组间有差异(P < 0.05),但在3?5?7 d时两两比较差异不显著(P > 0.05)?结论:多肽水凝胶复合支架材料能显著促进ADSCs的黏附增殖,对细胞早期骨向分化有一定的促进作用,但不如对细胞增殖的促进作用显著?     

Biocompatibility studies on fibrin glue cultured with bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Summary By culturing bone marrow mesenchymal stem cells of rabbits with fibrin gluein vitro, the biocompatibility of fibrin glue was investigated to study whether this material can be used as scaffolds in bone tissue engineering. After 2-months old New Zealand rabbits had been anesthetized, about 4–6 ml of bone marrow were aspirated from rabbit femoral trochanter. The monocytes suspension was aspirated after bone marrow was centrifuged with lymphocyte separating medium and cultured primarily. Then the cells were divided into two groups: one was cultured with complete medium and the other with induced medium. The cells of the two groups were collected and inoculated to the culture plate containing fibrin glue. In the control group, cells were inoculated without fibrin glue. The implanted cells and materials were observed at different stages under a phase-contrast microscope and scanning electron microscope. MTT and alkaline phosphatase (ALP) were measured. Bone marrow mesenchymal stem cells grew on the surface of fibrin glue and adhered to it gradually. Cells light absorption value (A value) and the ALP content showed no significant difference. Fibrin glue had no inhibitory effect on cell morphology, growth, proliferation and differentiation. It has good biocompatibility and can be used as scaffold materials for bone marrow mesenchymal stem cells in bone tissue engineering. FANG Huang, male, born in 1962, Associate Professor     

多孔β-磷酸三钙/胶原支架与犬牙周膜细胞三维复合体的构建

目的:探索用多孔β-磷酸三钙/胶原(β-TCP/col)支架与犬牙周膜细胞(PDLCs)在体外构建三维复合体.方法:分离培养犬PDLCs,并对其来源进行鉴定;利用甲基噻唑基四唑法检测β-TCP/col浸提液对PDLCs增殖的影响;并将第3代PDLCs以2×10⁵/mL的浓度接种于β-TCP/col支架上进行三维复合体的体外构建,用扫描电镜观察.结果:β-TCP/col浸提液对犬PDLCs增殖无不良影响;PDLCs可在材料的三维结构上贴附生长,细胞充分伸展,且表面可见明显分泌物. 结论:多孔β-磷酸三钙/胶原支架与犬牙周膜细胞具有良好的生物相容性,二者可在体外构建成三维复合体,提示该材料具有成为牙周组织工程理想支架材料的潜力.     

特种肽支架材料对骨髓基质干细胞黏附、增殖及成骨分化的影响

目的 探讨新型含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽K16RGDSPC修饰聚丙交酯-CO-乙交酯（PLGA）-[ASP-PEG]支架材料对骨髓基质干细胞（BMSCs）在其表面黏附、增殖及成骨分化的影响。方法 固相合成法合成K16GRGDSPC并通过质谱仪和高压液相色谱进行鉴定。用交联剂Sulfo-LC-SPDP将K16GRGDSPC接枝到PLGA-[ASP-PEG]支架材料上,通过XPS图谱检测接枝反应的发生。将改性后的PLGA-[ASP-PEG]支架材料与兔BMSCs在成骨诱导培养基中复合培养,以未改性的支架材料作对照。通过沉淀法、微管吮吸法、MTT法和考马斯亮蓝法分别检测BMSCs的黏附和增殖性能的变化;应用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测BMSCs的ALP表达水平并通过RT-PCR检测细胞ALP、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）和Ⅰ型胶原的表达,通过免疫荧光染色检测核心结合因子a1（Cbfal）表达,观察BMSCs向成骨细胞方向分化的情况。结果 XPS图谱证实含RGD肽K16GRGDSPC被成功地接枝到PLGA-[ASP-PEG]表面。复合BMSCs培养结果表明,改性后的PLGA-[ASP-PEG]表面BMSCs的黏附性能和增殖能力明显提高,而且其成骨标志物（ALP、OCN、OPN、Ⅰ型胶原和Cfba1）的表达均显著高于对照组（P〈0．05）。结论 含RGD肽K16GRGDSPC能促进BMSCs在骨基质材料表面的黏附、增殖并诱导其向成骨方向分化。     

转化生长因子β1基因修饰的间充质干细胞／仿生基质材料的体外复合培养

目的 探讨转化生长因子β1（TGF－β1)基因转染对间充质干细胞（MSCs)增殖分化的影响,评价涂覆多聚赖氨酸（PLYS）的聚DL乳酸（PDLIA）仿生基质材料能否作为关节软骨组织工程学研究的支架材料。方法 将组织工程学与分子生物学有机结合,体外将具有多重生物学效应的TGF－β1基因转入关节软骨组织工程首选种子细胞－－间充质干细胞（MSCs）,并与表面涂覆PLYS的PDLLA可降解三维多孔基质材料体外复合培养。以单纯空载体转染MSCs为对照,通过扫描电镜等方法观察种子细胞的粘附、增殖及分化等情况。结果 基质材料孔隙率为88％,其中孔径为150－200μm的有效孔占80％。所有细胞增能很好地粘附于基质材料上,其中TGF－β1基因修饰的MSCs增殖分化活性明显优于对照组。结论 利用扮子组织工程学原理可使TGF－β1持续高效发挥作用,使提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。涂覆PLYS的PDLLA仿生基质材料不仅具有良好的生物相容性和结构相容性,而且具有更好的表面相容性和生物学活性,在一定程度上解决了细胞－－基质材料之间非的界面不相容问题,是关节软骨缺损修复的良好基质材料。     

Wild-type Smad3 Gene Enhances the Osteoblastic Differentiation of Rat Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells in Vitro

This study examined the effect of wild-type Smad3 gene on the osteoblastic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells （MSCs） were stably transfected with the complexes of PeDNA3.0-Myc-Smad3 or PeDNA3.0- Mye-Smad3△C and Lipofectamine reagent. Immunofluorescence staining was performed to evaluate the c- Myc signal in MSCs. The cell proliferation was detected by MTT method. To clarify the osteoblastic characteristics in stably transfected MSCs, alkaline phosphatase （ALP） mRNA and core binding factor α1 （Cbfal） mRNA were investigated by RT-PCR, and ALP activity and mineralization were examined by p-nitrophenolphosphate method and alizarin red staining respectively. PD98059, a specific inhibitor of the ERK signaling pathway, was used to determine the role of ERK in Smad3MSCs osteoblastic differentiation, c-Myc signal was detected in Smad3-MSCs and Smad3△C- MSCs. The proliferation of Smad3-MSCs was slower than that of Smad3/△C-MSCs or V-MSCs. The relative levels of ALP mRNA and Chfal mRNA in Smad3-MSCs, as well as ALP activity and mineralization, were markedly higher than those in Smad3/△C-MSCs or V-MSCs. Although ALP activity and mineralization were slightly lower in Smad3-MSCs.treated with PD98059 than in those without PD98059 treatment, no significant difference was found between them （P〉0.05）. It is concluded that the wild-type Smad3 gene, which is a crucial component promoting bone formation, can inhibit the proliferation of MSCs and enhance the osteoblastic differentiation of uncommitted MSCs and the maturation of committed MSCs independent of the ERK signaling pathway.