铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组测序

目的 对新分离的铜绿假单胞菌dsDNA溶原性噬菌体PaP3进行基因组测序。方法 用CsCl梯度离心纯化噬菌体PaP3颗粒，撮噬菌体基因组DNA，建立shot-gun随机文库，从文库中随机挑取克隆进行测序并完成序列组装，同时通过限制性内切酶图谱结合酶切片段的变性、复性实验分析基因组末端。结果 共进行了778条序列的测定与拼接，测序量达到13.5倍覆盖率，得到一条长为44249bp的重叠群，此重叠群错误率为9.46ERR/10KB，测序结果和酶切图谱分析表明该PaP3基因组是一44249kp长的线笥平端dsDNA分子。其碱基组成为A＝24.24%，G＝26.18%，T＝23.63%，C＝25.94%；稀有碱基＝0；A＋T＝47.87%，C＋G＝52.13%。结论 噬菌体PaP3基因组是由44249bp组成的线性平端双链DNA分子。测序完成为生物信息学分析和功能基因研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的密码使用偏嗜性与tRNA基因

目的 检索分析铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的遗传密码使用偏嗜性及其tRNA基因的关系。方法 利用生物信息学软件和网上生物信息学工具，检索分析PaP3的遗传密码使用偏嗜性；并与铜绿假单胞菌PAO1的遗传密码使用偏嗜性进行对比分析；检索PaP3基因组中tRNA基因并分析其与遗传密码使用偏嗜性的关系。结果 传密码偏嗜性分析发现噬菌体PaP3和铜绿假单胞菌优势码一致的氨基酸有F－uuc,I-auc,V-guc,A-gcc,Y-uac,H-cac,N-aac,K-aag和T-acc；PaP3单独具有偏嗜性密码的氨基酸有A－gcu,G-ggu,T－acu和V-gua；铜绿假单胞菌PAO1单独具有偏嗜性密码的氨基酸有L－cug,V-gug,P-ccg,V-gcg,Q-cag,D-gac,E-gag,C-ugc,R-cgc,S-agc和G-ggc。tRNA基因查询发现了PaP3基因组中存在三段tRNA编码序列，分别编码tRNA^Asp,tRNA^Pro；它们的反密码子分别为“gtt”，“gtc”和“tgg”，分析结果没有表明这三个tRNA基因与优势转运氨基酸有关。结论 铜绿假单胞菌PAO1的遗传密码偏嗜性更为明显，而PaP3的遗传密码偏嗜性相对较弱，两者在遗传密码偏嗜性方面并未表现出一致性；噬菌体编码的tRNA基因与遗传密码偏嗜性之间有直接联系。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组电转化宿主菌的条件初探

目的:研究将铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组DNA电转入其宿主菌并获得噬斑的基本条件。方法:以铜绿假单胞菌PA3作受体菌,将噬菌体PaP3基因组DNA通过电转化导入受体菌中,研究细胞生长状态、感受态细胞的制备方式、电场强度、DNA浓度和细胞密度等条件对转化效率的影响。结果:在含50μg/ml红霉素的LB培养液中培养宿主菌14~16 h,以100 mmol/L蔗糖溶液为介质,在25℃条件下制备感受态并使其浓度达到1011/ml,电转参数为12 kV/cm,300Ω,25μF,在此组条件下能获得较高的转化效率,最高可达2.1×103pfu/μg的DNA。结论:确定了一组电转条件,成功地将铜绿假单胞菌噬菌体完整基因组导入PA3中,并形成噬斑,为铜绿假单胞菌噬菌体的深入研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组的初步注释

目的 对已完成测序的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组进行初步注释。方法 利用生物信息学软件和网上工具对噬菌体PaP3进行开发阅读框（Open reading frame,ORFs）检索；编码序列鉴定；对公共数据库进行BLAST查询，分析基因的可能功能；对存在高度同源性序列的推定蛋白进行多重序列比对和系统发生树分析。结果 利用生物信息学软件在PaP3基因组中检索到252个大于100bp的ORFs，其中有699个ORFs可确认为推定基因；核苷酸对核苷酸的BLASTn分析未发现有意义的同源性核苷酸序列；核苷酸对蛋白质的BLASTx分析共发现了4个在公共数据库中有高度同源性序列的ORFs，根据其同源性蛋白的功能推定ORF13052－14761编码产物为引物酶／解旋酶，ORF40280－41728编码产物为末端酶大亚单位，ORF41728－42225编码产物为溶菌酶，ORF16912－18549编码产物为DNA聚合酶；绘制出了上述这四种蛋白的系统发生树。结论 噬菌体PaP3具有252个大于100bp的ORFs，其中69个为推定基因，有4个推定基因的功能被确认为分别编码引物酶／解旋酶，末端酶大亚单位，溶菌酶及DNA聚合酶。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3整合位点的鉴定

目的：确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3在宿主菌基因组中的整合位点.方法：利用在噬菌体PaP3基因组中无酶切位点的Pst Ⅰ对溶原性细菌全基因组进行酶切,获得含有噬菌体PaP3全基因组及部分宿主菌DNA序列的大片段;然后进行第二次酶切,获得噬菌体基因组与宿主菌基因组的交界点序列,并进行克隆、测序,鉴定出杂合位点attR.根据λ噬菌体的整合机制,利用PCR反应扩增出另一杂合位点attL,根据测序结果及Blast检索确定attP与attB的位置和DNA序列.结果：经序列比对发现,attP及attB的核心位点分别位于噬菌体PaP3基因组中的t-RNAPro基因及铜绿假单胞菌PA3基因组中的t-RNALys基因中,其核心位点的DNA序列为21 bp（5＇-GGTCGTAGGT-TCGAATCCTAC-3.）.在核心位点的两侧存在正向重复序列及反向重复序列.结论：该研究为铜绿假单胞菌噬菌体的整合酶及整合机制的研究奠定了基础.     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性的研究

目的　确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的形态与大小、裂菌特性、最佳感染复数、一步生长特性等基本的生物学特性。方法　电镜观察纯化噬菌体颗粒 ;制备PaP2噬斑 ,观察其特点 ;提取噬菌体感染的细菌基因组 ,用SmaⅠ酶切 ,通过脉冲场电泳观察酶切产物的带型特点 ;测定不同感染复数 ,培养 3 5h后细菌 噬菌体液中的噬菌体滴度 ;加入宿主菌及噬菌体使MOI =10 ,进行一步生长实验 ,在 0时刻和每隔 15min测定噬菌体滴度。结果　噬菌体PaP2头部直径约为 5 2nm ,无囊膜 ,有一短尾 ;噬斑雾状半透明 ,直径约 1～ 2mm ;被噬菌体感染的宿主菌基因组的SmaⅠ酶切产物带型 ,比未感染宿主菌的多出了 1条大于噬菌体基因组的片段 ;当MOI =10时宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高 ;绘制出了一步生长曲线。结论　PaP2属短尾噬菌体科 ,是溶原性噬菌体 ;最佳感染复数是 10 ;感染宿主菌的潜伏期是 75min ,裂解期是 90min ,平均裂解量是 3 4     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1生物学特性的研究

目的确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的形态大小、核酸类型、裂菌特性、最佳感染复数和一步生长曲线等基本生物学特性.方法对CsC1梯度离心纯化后的噬菌体PaP1颗粒进行电镜观察;提取PaP1基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;制备PaP1的单个噬斑,观察噬斑特点;按照感染复数(MOI)分别为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,37℃160 r/min培养3.5 h后测定噬菌体滴度;加入噬菌体及宿主菌使MOI=10,37℃温育15 min后进行一步生长实验,于0时刻和每隔10min取样50 μl测定上清中噬菌体滴度.结果PaP1噬菌体头部呈多面体立体对称,直径约70 nm ,无囊膜,有一个约60 nm长的尾;PaP1噬斑直径约2mm,圆形透明;当MOI为0.01时PaP1感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;根据一步生长实验结果绘制出了一步生长曲线.结论PaP1属于肌尾科裂菌性噬菌体,其基因组为双链DNA分子;最佳感染复数为0.01,感染宿主菌的潜伏期是20 min,爆发期是40 min,平均爆发量约为65.     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的结构蛋白及其编码基因的研究

目的：确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2结构蛋白的构成及其编码基因。方法：CsCl梯度离心纯化噬菌体PaP2颗粒，SDS-PAGE电泳，确定结构蛋白条带及其相对分子质量；然后电转印于PVDF膜上，用Edman降解法进行N端测序。根据所测的N端氨基酸残基序列在PaP2预测基因编码的蛋白质中检索，从而逆推其编码基因。结果：SDS-PAGE显示PaP2含有10条带，其中1、3、4,5、8、9等6条带的含量足以回收进行N端测序，测得N端氨基酸残基分别依次为：Met-Ile-Glu-Leu-Gly、Ala-Ile-Ser-Pro、Ala-Arg-Phe-Ile-Asp、Ser-Val-Tyr-Ala-Gly、Ala-Ile-Ser-Arg-Asn-和Ser-Phe-Ser-Leu-Gly。据此推论出它们的编码基因分别是ORF18340-23889、ORF4419-6419、ORF16589-18322、ORF8274-9530、ORF15708-16625、ORF7563-8309。结论：噬菌体PaP2含有10个结构蛋白，其中6个主要结构蛋白的编码基因分别是orf 24、orf8、orf23、orf12、orf 22、orf11。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3一个结构蛋白的N-端测序及编码基因的确定

目的 确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的主要结构蛋白基因。方法 将噬菌体PaP3颗粒用CsCl梯度离心纯化，SDS-PAGE电泳其结构蛋白后，电转印于PVDF膜上，再用Edman降解法对主要结构蛋白作N端测序，根据蛋白N端5个氨基酸残基序列逆推其编码读框。结果 PaP3主要结构蛋白的N端5个氨基酸残基顺序为：Ala-Thr-Pro-Thr-Asn。结论 据此推定其编码基因为ORF36．354～37 307(负链)编码的蛋白，该蛋白共有318氨基酸，其等电点为7．70，分子质量为35 024．46。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1主要结构蛋白编码基因的确定

目的：确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP1主要结构蛋白的编码基因.方法：CsCl梯度离心纯化噬菌体PaP1颗粒,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离该噬菌体的结构蛋白,转印PVDF膜后,对主要结构蛋白进行N-端测序,根据测序结果和实测分子量,在PaP1基因组序列中检索推定基因表达产物分子量相近、N-端氨基酸残基序列相同的蛋白质所对应的编码基因.结果：SDS-PAGE显示PaP1至少含有7种结构蛋白,其中相对分子质量为38 400的蛋白是主要的结构蛋白,其N-端5个氨基酸残基顺序为：Ala-Asn-Thr-Arg-Ser.结论：噬菌体PaP1至少含有7个结构蛋白,其中相对分子质量为38 400的蛋白系主要结构蛋白,其编码基因为ORF6841-7875.     

PaP3噬菌体53×103蛋白编码基因的确定

目的确认PaP3噬菌体53×103蛋白的编码基因.方法用PEG沉淀结合CsCl梯度密度离心分离、纯化噬菌体颗粒,通过SDS-PAGE电泳分析该噬菌体的结构性蛋白带,转印PVDF膜后,对53×103蛋白进行N-端氨基酸测序,进而从PaP3全基因组的252个ORFs中确认该蛋白质的编码基因及其对应的氨基酸序列.结果PaP3噬菌体的结构性蛋白共发现有8个,其中53×103蛋白是由ORF29893编码的.53×103蛋白编码基因全长1 524 bp,G c=54.92%,编码508个氨基酸.该蛋白分子质量为53.7×103,等电点(PI)为7.207.结论53×103蛋白是由噬菌体基因组中0RF29893编码的,共由508个氨基酸组成.该蛋白可能是一种结构性蛋白.