人肝细胞癌差异表达基因TCTP的克隆和分析

目的 筛选和鉴定在人肝细胞癌中差异表达的基因。方法 采用抑制性消减杂交技术建立人肝细胞癌eDNA消减文库，通过DNA测序分析、Northern印迹、cDNA末端快速扩增和RT-PCR等方法对其中一个克隆基因加以分析。结果 从所建eDNA消减文库中分离到一个插人子长度为479bp的克隆，该片段含有3’端Poly(A)结构，Northern杂交证明其表达水平在癌组织和肝癌细胞株均显著升高，同时经5’末端快速扩增获得一个长度为865bp的全长cDNA序列，具有一个编码172个氨基酸的完整开放阅读框，与GenBank数据库作同源性分析显示其为已报道的TCTP基因。RT-PCR分析表明TCTP基因在癌组织样本中的扩增水平高于癌旁非癌组织样本。结论‘I'CTP基因的差异表达可能在肝癌发生机制中扮演重要角色。     

VEGF165b在肝细胞癌中的表达及其作用机制

目的:研究血管内皮生长因子165b(vascular endothelial growth factor 165b,VEGF165b)在肝细胞癌和正常肝组织中的表达情况,初步探讨其与肝细胞癌的关系和作用机制.方法:用免疫组织化学法检测28例肝细胞癌组织和30例正常肝组织中VEGF165b蛋白的表达情况;用RT-PCR法分别检测肝细胞癌和正常肝组织中VEGF165b和VEGF165 mRNA的表达情况.用Western blot法检测上述肝细胞癌组织和正常肝组织中VEGF165b和VEGF165蛋白的表达情况.用Western blot法检测上述肝细胞癌和正常肝组织中FAK和P-Akt蛋白的表达情况.结果:正常肝脏组织中VEGF165b蛋白表达率为96.67%(29/30),肝细胞癌组织中VEGF165b蛋白的表达率为21.4%(6/28),表达差异有统计学意义(P0.05).VEGF165b mRNA和蛋白在肝癌组织中的表达明显低于正常肝脏组织的表达(P0.01).VEGF165 mRNA和蛋白在肝癌组织中的表达明显高于正常肝脏组织的表达(P0.01).FAK和P-Akt蛋白在肝癌组织中的表达明显高于正常肝脏组织的表达(P0.01).结论:VEGF165b在肝细胞癌组织中的表达明显低于正常肝组织的表达,而VEGF165和FAK、P-Akt在肝细胞癌组织中的表达明显高于正常肝组织的表达.提示VEGF165b与肝癌发生、发展有关,其机制可能是VEGF165b抑制VEGF165、FAK和P-Akt表达及他们的促进血管生成、肿瘤生长作用.     

胃癌中高表达ATP/GTP结合蛋白1基因的筛选及验证

目的:探讨胃癌中差异表达的基因在胃癌发生和发展的分子机制中的作用.方法:提取胃癌组织样本的总RNA,通过荧光差异显示技术(DD-PCR)获得胃癌样品中差异的片段,对这些片段进行克隆和测序,通过在GenBank中同源性检索,查找与差异片段相对应的同源基因.利用半定量PCR及定量PCR方法验证该基因表达的差异性.结果:通过DD-PCR得到差异片段中的一个片段对应与人ATP/GTP结合蛋白1基因(A/GTPBP1).半定量PCR及荧光定量PCR技术检测结果表明,A/GTPBP1基因在胃癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织.该基因的读码框长3561 bp,编码1186个氨基酸,分子质量为84.4 kDa,蛋白质相似性分析表明该蛋白为G蛋白家族成员.结论:A/GTPBP1在胃癌组织中异常高表达,可能在胃癌发生过程中起调节作用.     

人肝癌父系表达基因10的遗传印记状态

目的 研究人肝癌组织及肝癌细胞株中父系表达基因10(PEG10)的遗传印记状态.方法 从40例肝癌及其癌旁组织、15例正常肝组织、5株肝癌细胞(PLC/PRF/5、SMMC 7721、HepG2、Hep3B、SK-HEP-1)、2株正常肝细胞(changliver、HL7702)中提取基因组DNA,针对PEG10基因单核苷酸多态性位点设计引物进行PCR,扩增片段经测序分析基因型;从杂合样本中提取总RNA进行RT-PCR,对扩增产物测序以检测等位基因表达状态,同时进行实时荧光定量RT-PCR检测PEG10表达水平.计量资料以均数±标准差(-x±s)表示,组间比较用t检验与方差分析;两组率的比较用x2检验.结果 40例肝癌及其癌旁组织中16例呈杂合状态,15例正常肝组织中3例呈杂合状态,肝癌细胞HepG2扩增片段测序检测到一杂合突变位点,其余组织及细胞株均为纯合状态.杂合样本中,82.4%(14/17)肝癌样本(包括组织及肝癌细胞株)中PEG10基因呈双等位基因表达,发生印记丢失;17.6%(3/17)肝癌样本呈单等位基因表达,提示印记存在.PEG10在癌旁及正常肝组织中几乎不表达.发生印记丢失的肝癌组织与印记存在的肝癌组织相比,PEG10表达水平的差异无统计学意义(t=1.311,P＞0.05).结论 大多数肝癌组织中存在PEG10印记丢失现象,PEG 10印记状态与其在肝癌组织中的表达水平无明确关系.     

Piwil2基因在肝癌组织中mRNA及蛋白的表达

目的:检测肝癌组织中Piwil2基因mRNA和蛋白的表达,进而探讨Piwil2基因在临床诊断中的意义.方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot印迹技术,检测了70例肝癌及其对应癌旁组织中PiWil2基因mRNA及其蛋白的表达并结合临床资料进行分析.结果:PiWil2 mRNA在肝癌中的表达量相对值高于癌旁的肝脏组织的表达量(0.91±0.04vs0.32±0.04,P<0.05).Piwil2基因mRNA的表达与患者的肝内转移、分化程度及癌栓等病理因素方面的差异有统计学意义(P<0.05).蛋白在肝癌中的表达均高于对应的癌旁组织.Piwil2的蛋白质表达与患者的肝内转移及癌栓等病理因素方面的差异有统计学意义(P<0.05).Piwil2基因mRNA的表达与Piwil2的蛋白质的表达有相关性(P<0.05).结论:Piwil2有可能成为肝癌的检测及治疗的一种分子标志物.     

乙肝相关性肝癌及癌旁组织p73基因表达及突变的研究

目的　探讨p73基因在人乙肝相关性肝癌组织中的表达及其意义。方法　采用RT PCR方法检测p73基因mRNA在癌组织、癌旁组织及正常肝组织中的表达差异 ;采用SSCP检测方法比较分析p73基因在肝癌发生中的变异情况。结果　癌组织中p73基因mRNA的转录水平明显高于癌旁组织及正常组织 (P <0 0 5 ) ;然而 ,肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织中p73基因PCR扩增片段的多态性是一致的 ,电泳未见异常条带 (P >0 0 5 )。结论　新近发现的肿瘤抑制基因p73基因在乙肝相关性肝癌组织中末见明显的基因突变 ,相反表达水平明显增高 ,可见 ,p73基因以一种高表达形式参与乙肝相关性肝癌的发生     

肝癌组织中14-3-3基因差异表达的意义

目的:检测肝癌组织中,4-3-3基因家族成员表达差异的临床意义.方法:用TRIzol一步法提取肝癌组织、硬化肝组织及正常肝组织的总RNA并纯化mRNA.逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针与含有14-3-3基因家族成员的基因芯片杂交,用GenePix Pro3.0图像分析软件分析不同病变肝组织中该基因家族成员的表达差异,行半定量RT-PCR对结果进行验证并探讨差异表达基因的临床意义.结果:在肝癌组织中14-3-3基因家族成员呈差异表达,其中14-3-3γ在肝癌组织中明显下调,与肿瘤包膜的完整性相关.14-3-3η在肝癌组织中明显上调,与肿瘤患者的临床分期相关.14-3-3γ与14-3-3ηmRNA的表达强度呈负相关(γ=-0.403,P<0.05).结论:14-3-3基因家族调控机制的紊乱参与肝癌的发生、发展,其中14-3-3γ和14-3-3η与肝癌的关系最为密切.     

mRNA差异表达片段与肺血栓栓塞的相关性研究

目的探讨mRNA差异表达片段与肺血栓栓塞症的关系。方法提取于2001年9月至2002年4月首都医科大学附属北京安贞医院呼吸内科收治的肺血栓栓塞症患者11例和健康对照者11名外周血单个核细胞总RNA,筛选肺动脉血栓栓塞患者差异表达的mRNA片段,并进行表达量鉴定和同源性比较。结果共分离、筛选出55条差异表达条带,选择其中10条(与对照组相比,上调或下调3倍以上)进行克隆测序分析,与GenBank进行读框分析比较,从中得到2个同源性低的未知基因,证实为新基因片段,分别命名为g44、g48;以g44为探针,进行Northern杂交,发现此片段在对照组及疾病组均有杂交信号,但疾病组杂交信号明显强于对照组的杂交信号。结论g44、g88,此片段在肺动脉血栓栓塞疾病组有较强的表达,提示其表达可能与疾病的发生发展密切相关。     

正常肝组织与肝癌组织差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的 构建人正常肝组织与肝癌组织差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交技术,以癌旁正常肝组织及肝癌组织作为对比材料,分离肝癌组织中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆进行酶切鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得4000余个白色阳性克隆,随机挑取的100个白色克隆进行酶切鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得4000余个白色阳性克隆,随机挑取的100个白色克隆经酶切后均有200-600bp的插入片段。结论 用SSH法及T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝癌组织差异表达基因的消减cDNA文库,该文库的建立为进一步筛选、克隆肝癌组织中失活或低表达的新的抑癌基因奠定了基因。     

采用改进的差示PCR技术分离胃癌差异表达基因的研究

目的建立优化的mRNA差示PCR条件;运用建立的条件及GQS-9600分离胃癌GC7901与胃粘膜GES-1细胞株之间的差异表达基因片段;根据获取的序列,设计引物并运用于胃癌组织、血、活检胃粘膜标本检测,拟从中筛选出检出率与符合率高的数对引物,建立胃癌基因诊断方法.方法以胃癌GC7901与胃粘膜GES-1细胞株为研究对象,探索mRNA差示PCR的最佳反应条件,运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因片段;以回收的片段作探针,打点杂交证实为真正的差异片段后,对纯化产物进行直接序列分析及GenBank同源性检索,同源性低的序列递交给GenBank;设计引物,采用RT-PCR方法对胃癌组织、血、活检胃粘膜进行检测,筛选出检出率与符合率高的5对引物建立多重PCR诊断胃癌方法.结果①优化的差示PCR条件为:前5轮PCR循环采用94℃ 35s,40℃ 2min,72℃ 30s,后35轮PCR循环采用94℃ 45s,55℃ 2min,72℃ 1min,最后在72℃延伸7min;②确认并分离出差异条带154条,胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株泳道中缺失的有82条,胃粘膜细胞株泳道中存在而胃癌细胞株泳道中缺失的有35条,胃癌细胞株泳道中表达高于胃粘膜细胞株泳道中的有23条,胃粘膜细胞株泳道中表达高于胃癌细胞株泳道中的有14条,分别来自于H-T11G,H-T11A,H-T11C锚定引物的差异条带为61条,47条及46条;③从胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株泳道中缺失的82条带中随机挑选出17个差异片段作探针,进行打点杂交,证实在两细胞株之间呈差异表达;④对17个片段进行直接测序及同源性检索分析,其中7个新序列被GenBank接受,接受号为AF071052至AF071058;⑤GCYS-1,GCYS-4,GCYS-8,GCYS-10,GCYS-11号序列引物在26例胃癌标本中检出覆盖率为100%,在9例病理确诊的胃癌患者活检胃粘膜中检出率为100%,在17例病理确诊为胃癌患者血标本中检出率为53%,在其他组织中检出率较低.结论①建立了优化的mRNA差示PCR技术的条件;②分离出了154个差异表达的基因片段;③对17个差异片段进行了测序及分析,其中7个新序列被GenBank接受;④建立多重PCR诊断胃癌方法.