湖北省不同年份汉坦病毒的RT-PCR检测及分型

目的：探讨湖北省不同年份引起肾综合征出血热的汉坦病毒的主要型别，为进一步研究该型汉坦病毒的基因变异打下基础。方法：根据汉坦病毒M基因片段G1编码区核苷酸序列设计I型和Ⅱ型分型引物，利用RT—PCR对105份不同年份的病程在7日以内的肾综合征出血热(HFRS)患(经临床诊断和ELISA确诊)血清标本进行检测及基因分型，并对扩增出的基因片段选用3种限制性内切酶AluI、RsaI、MboI进行酶切分析。结果：用I型引物通过：RT—PCR检测75份血清标本(1996～2000年)和30份血清标本(1986～1987年)的阳性率分别为77．3％和10％，而用Ⅱ型引物检测前阳性率为8．0％，后均为阴性。对4份I型引物扩增产物用3种限制性内切酶进行酶切分析，发现4份阳性产物其限制性片段长度多态性均与I型汉坦病毒标准株76～118完全不同，但其中3份与I型汉坦病毒湖北地方株HV114相同，1份与HV114不完全相同。结论：不同年份引起湖北地区HFRS的主要毒株均为I型汉坦病毒(HTN)湖北地方株。     

肾综合征出血热汉坦病毒分型及序列特征的研究

目的 分析黑龙江省肾综合征出血热（HFRS）患者携带汉坦病毒的基因型别及序列特征.方法 采集临床诊断为肾综合征出血热病人的全血60例,其中通过金标法检测出血热特异性抗体阳性40例、阴性20例,血凝块提取汉坦病毒RNA,应用RT-Nest-PCR及核苷酸序列测定分型技术对黑龙江地区的汉坦病毒进行分型研究,设计汉坦病毒M片段通用引物（MOF,MOR）及HTNV和SEOV的M片段特异性引物（HTNMF、HTNMR,SEOMF、SEOMR）,应用Nest-PCR进行扩增,回收阳性扩增产物进行基因序列测定,将所测基因序列与国内外HV病毒株序列进行核苷酸同源性分析,构建M基因种系进化树.结果 出血热特异性抗体阳性的病例中扩增出HTN型19份,抗体阴性的病例中扩增出HTN型1份、SEO型l份.总体来看黑龙江省流行的汉坦病毒毒株主要为HTN型和SEO型,以HTN型为主.经核苷酸及氨基酸同源性和种系进化分析表明其黑龙江地区的病毒株同源性较高,其中HTN型与76 ～ 118株同源性较高,SEO型与Z37株的同源性较高.结论 黑龙江省的HV感染病例多为HTN型,与其他GenBank中的各地标准株的核苷酸及推导的氨基酸序列均有一定差异,在系统进化树中分析HTN型与76-118株较为接近.SEO型与国内Z37较为接近.结合临床症状发现其临床症状较为相似的在系统进化发生树中较为接近.     

雌激素受体β基因多态性与帕金森病的相关性

目的 探讨中国汉族人群雌激素受体(ER)β基因Alu Ⅰ、Rsa Ⅰ酶切多态性与帕金森病(PD)和帕金森病痴呆(PDD)的相关性.方法 采用病例-对照研究和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性.方法,对115例PD患者(包括26例PDD)和116名健康对照进行ERl3基因多态性分析,经卡方检验,分析各基因型、等位基因频率与PD、PDD患病的相关性.结果 (1)ERl3基因Alu Ⅰ、Rsa Ⅰ的酶切多态性在PD组和对照组问差异无统计学意义(均P>0.05).(2)PDD组与对照组相比,Erβ基因的Alu Ⅰ、Rsa Ⅰ的酶切多态性差异也无统计学意义(均P>0.05).结论 Erβ基因AluⅠ、Rsa Ⅰ的酶切多态性不影响PD和PDD的患病风险.     

丙型肝炎病毒2a型E2区基因cDNA的变异分析

目的 了解丙型肝炎病毒2a型基因组E2区序列的一级结构及变异特征，为进一步研究HCV包膜蛋白的生物学功能打下基础。方法 用逆转录套式多聚酶链反应(RT-nPR)法从1例NANB型肝炎患者血清中扩增出一条约1100bp的片段，以限制性内切酶EcoRI、HindⅢ双酶切后连入pUC19载体中，转化感受态细胞，经限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)和PCR法证实为阳性克隆后，用全自动序列分析仪测序。结果 测得约1100bp的核苷酸序列，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别与HCV-1、HC-C2、HCV-BK、HC-J6、HC-J8相应序列作比较，显示分离株HCV在核苷酸水平上与以上分离株的同源性分别为63．1％、64．2％、64．1％、86．9％、69．3％，在氨基酸水平上的同源性分别为69．6％、70．7％、69．6％、86．2％、83．1％。结论 分离株(HCV-JF)与HC-J6同属2a型。     

不同血清型汉坦病毒基因重排的研究

目的探明汉坦病毒HTN型与SEO型、HTN型与PHV型之间基因重排的频率和特点。方法分别用相同滴度的汉坦病毒HTN型与SEO型(76-118株与SR-11株),及汉坦病毒HTN型与PHV型(76-118株与PHV株)毒株分别混合感染VeroE6细胞,用空斑形成试验挑选子代病毒克隆,挑得的单个病毒克隆在VeroE6细胞上扩增。分别用分型引物对子代病毒进行RT-PCR实验,以确定子代病毒L、M、S片段核酸的来源,鉴定子代病毒基因型。结果发现76-118株与SR-11株混种的子代病毒株基因30/44株来源于亲代病毒,9/44株子代病毒发生了基因片段重排。76-118株与PHV株混种的子代病毒株基因26/36株来源于亲代病毒,3/36株子代病毒发生了基因片段重排。76-118株与SR-11株混种的子代病毒株的基因重排率(20.45%)明显高于76-118株与PHV株混种的子代病毒株(8.33%)。结论这种重排率的差异可能是由于HTN型与SEO型HV基因核酸序列之间的同源性较高,而更容易发生基因重排。而HTN型与PHV型HV基因核酸序列之间的同源性较低,发生基因重排的机会显著降低。     

汉滩病毒西安分离84FLi的M片段全基因序列测定及分析

目的 测定我国肾综合征出血热患者流产胎儿肝脏分离病毒84FLi株的全M片段基因序列，了解其分子基础。方法 采用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），分节段扩增M基因片段的cDNA，直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果 84FLi株的全M基因序列组成为：M片段基因共由3616个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A30．92％，C18．03％，G21．18％，T29．87％。GC含量为39．21％，AT含量为60．79％，最大开放读码框为41－3448，共编码1135个氨基酸。核苷酸序列同源性分析表明84FLi株与HTN型同源性高于与其他型汉坦病毒的同源性，其中与中国株的同源性较高，与HV114株的同源性为85．5％。与HTNV的国际标准毒株76－118的核苷酸同源性分别为84．0％，氨基酸的同源性为96．0％。结论 84FLi株属于汉滩型病毒，并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高。     

汉滩病毒西安分离株84 FLi的S片段全基因序列测定及分析

目的：测定我国陕西西安出血热肾病综合征(HFRS)患者流产胎儿肝分离的病毒84FLi株的全S片段基因序列，了解其分子特征，并确定其在汉坦病毒(HV)种系发生中的位置。方法：采用逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增出S基因的cDNA，直接用PCR产物或克隆入pMD18-T载体中测序。结果：84FLi株的全S基因共由1688个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A31．39％、C19．25％、G23．04％和T26．30％，GC含量为42．29％，AT含量为57．71％。最大开放读码框为37～1326，共编码429个氨基酸。核苷酸序列同源性分析表明，84FLi株与汉滩病毒(HTN)型同源性高于与其他型HTV的同源性。84FLi株与中国毒株Chen4和RG9同属于一个进化分支，而与HTN型国外毒株距离较远，属于不同的进化分支。结论：84FLi株属于HTN，并与国内分离的HTN同源性较高。     

中国湖北地区汉坦病毒M片断基因变异的研究

目的:了解中国湖北地区汉坦病毒的遗传学特征。方法:采集2000~2001年肾综合征出血热(HFRS)患者的血液标本,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增汉坦病毒M片断基因。22例IgM阳性患者中,从5例患者的血凝块中扩增得到特异性PCR产物。结果:对550bp和403bp扩增产物进行的系统进化分析揭示汉坦病毒至少存在3个不同分支。W613株和W1141株与原型株HTN76-118,CUMC-B11(韩国),cl-l和cl-2(日本)同一分支;W1219株和H8205同一分支;另外两株与A9和HV114同一分支。结论:首次发现湖北地区人类汉坦病毒株与韩国和日本的HTN型具有高度序列同源性。     

肾综合征出血热患者流产胎儿分离毒株84FLi的全基因序列分析

目的：克隆和测定汉滩病毒疫苗生产株84FLi的全基因组序列,了解其分子基础。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）,分节段扩增84FLi株L、M和S基因片段的cDNA,直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果：84FLi株L、M、S3个片段的全基因组序列为6533,3616和1688个核苷酸,分别编码2151,1135,429个氨基酸。A、C、G、T4种核苷酸分别为3830,2050,2510和3447个,GC含量为38．52％,AT含量为61．48％。序列同源性分析表明84FLi株与分离自广州的RG9株和分离自安徽的Chen4株高度同源。S片段核苷酸的同源性99．6％。与HTNV的国际标准毒株76－118的3个片段核苷酸同源性分别为83．7％、84．0％和87．2％,氨基酸同源性分别为97．5％、96．0％和97．9％。结论：84FLi株属于汉滩型病毒,并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高,与中国株Chen4株和RG9株属于同一亚型。     

黑龙江省1株汉滩型汉坦病毒的分离及基因鉴定

目的从鼠肺中获得汉坦病毒分离株并进行基因鉴定与分型。方法用组织培养法分离病毒，并进行RT—PCR鉴定，之后对目的片段进行序列测定和序列分析。结果从黑线姬鼠鼠肺中分离到一株汉坦病毒，编号HL83。用汉滩型（HTN）汉坦病毒M基因特异性引物检测得到预计大小的片段，此片段的核苷酸序列分析表明，HL83与HTN型参考毒株的同源性较高，与汉城型（SEO）参考毒株的同源性较低，进化树分析表明HL83位于HTN型所在的支系。结论HL83为HTN型汉坦病毒。     

聚合酶链反应检测汉坦病毒感染的实验研究

目的 早期诊断汉坦病毒感染。方法 根据国际标准株（７６－１１８,３９）Ｍ基因Ｇ１区设计两对公有引物和一条探针,按异硫酸氰胍－酚一步法提取汉坦病毒ＲＮＡ,采用ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ检测病毒细胞培养上清原液及稀释液、１６份对照组血清、４０份ＨＦＲＳ急性期（１～５天）血清标本中的汉坦病毒ＲＡＮ,所有扩增产物采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ或Ｄｏｔ ｂｌｏｔ证实其特异性。结果 汉坦病毒细胞培养液和４０份     

江苏省2009—2013年汉坦病毒分离株全基因序列测定及分析

目的:从分子水平分析2009—2013年江苏省分离汉坦病毒(Hantavirus,HV)的型别及变化,为疾病的预防控制提供实验依据?方法:采集2009—2013年江苏省肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)急性期患者血清及监测点鼠肺标本?采用胶体金法检测血清样本中汉坦病毒的IgM?IgG抗体,采用免疫荧光检测鼠肺样本中汉坦病毒抗原,并用VERO E6细胞分离病毒,RT-PCR检测标本培养物中病毒M片段以鉴定HV病毒,采用高通量测序技术对分离株进行全基因组测序,MEGA6.0软件对其进行序列比对和进化分析?结果:分离到的11株病毒与陕西分离株LR1?四川分离株S85-46以及汉坦病毒原型株76-118遗传距离最为接近,属于汉滩(Hantean,HTN)型病毒?分离株与2002年分离的江苏(A9?HTN型)株以及浙江株?安徽株处于不同的进化分支上,表明遗传关系较远?结论:江苏的汉坦病毒优势株发生了变化,而且发生了宿主转换?目前疫苗仍具有保护效力,但需加强监测?     

肾综合征出血热患者血清样本中汉坦病毒RNA检测及其临床意义

目的观察病毒血症在病程各期的变化。方法根据汉坦病毒血清Ⅰ型76-118株及血清Ⅱ型80-39株M基因G1区设计两对公有引物及一条探针,应用RT-nestedPCR方法对57例96份肾综合征出血热(HFRS)患者血清中HV-RNA检测,所有PCR产物用DOT-Blot证实。结果96份样本中68份阳性,阳性率70.8%;在病程第1、2、3周,HV-RNA检测率分别为94.7%、47.5%、25%,P<0.05;重型病人持续2周HV?RNA阳性检测率100%,而轻、中型分别为12.5%及42.8%,P<0.05。结论在HFRS病程中,病毒血症是一个急性过程,与发热期相平行,病毒血症持续时间与病情轻重密切相关。     

青岛地区2000～2003年肾综合征出血热的病毒基因分型

①目的 调查山东省青岛地区2000～2003年汉坦病毒的流行情况，研究病毒在该地区的分子流行病学特征。②方法 采集肾综合征出血热(HFRS)急性期病人血清标本64份，提取血清中病毒RNA作为模板，根据GenBank中汉坦病毒基因序列，设计HTN型和SEO型的通用外套引物，同时分别设计HTN型特异性引物和SEO型的特异性引物作为内套引物，RT—nest—PCR扩增汉坦病毒基因组M片段G1区基因序列并测序。测序结果利用DNA Star软件进行核苷酸序列分析。③结果 在64例标本中用HTN型特异性引物扩增阳性6例，占9％；用SEO型特异性引物扩增阳性25例，占39％；总阳性率为48％。总体来看青岛地区流行的汉坦毒株以SEO型为主。SEO型汉坦病毒间核苷酸序列的差异相对较小，在核苷酸序列水平其基因的离散度为0．3％～8．9％。HTN型汉坦病毒的变异率较高，其基因的离散度为2．6％～11．2％。④结论 青岛地区汉坦病毒的流行以SEO型为主，HTN型并存，其中HTN型主要发生在胶南市。     

丙型肝炎病毒山东分离株核衣壳蛋白区cDNA的序列测定

①目的　通过核衣壳蛋白区（ Ｃ区）基因序列分析,对丙型肝炎病毒（ Ｈ Ｃ Ｖ）山东分离株进行定型。②方法　应用反转录套式聚合酶链反应（ Ｒ Ｔｎｅｓｔｅｄ Ｐ Ｃ Ｒ）方法,从山东省 Ｈ Ｃ Ｖ 抗体阳性血清中扩增出 Ｈ Ｃ Ｖ Ｃ区基因的一个片段（４３２ｂｐ）,对其进行 Ｔ Ａ 克隆及测序,并通过 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ软件和 Ｇｅｎｅｂａｎｋ 进行序列分析。③结果　此分离株与基因型１ｂ 的 Ｈ Ｃ Ｖ 分离株同源性最高,与４ 个已知 １ｂ 型分离株的核苷酸相应序列同源性为 ９６．５２８％ ～９８．１４４％ ,其推导的氨基酸同源性为９４．４４４％ ～９６．０３２％ ．④结论　此分离株归为 １ｂ 型。     

山东省HCV分离株C 区及NS5 区核苷酸序列分析

①目的 探讨山东省丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）分离株Ｃ区、ＮＳ５区的核苷酸序列及其基因型别。②方法 以ＲＴ－ｎｅｓｔ－ＰＣＲ方法从１例临床ＨＣＶ感染者血清中分别扩增出ＨＣＶＣ区（４３２ｂｐ）及ＮＳ５区（３１９ｂｐ）的基因片段,将其克隆于Ｔ载体上,以双脱氧末端终止法自动测序并进行序列分析。③结果 该分离株与ＧｅｎＢａｎｋ中５０多个１ｂ型分离株同源性均在９０％以上,其中Ｃ区与中国北京的１ｂ型株ＨＣＵ６３３７