重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白质控方法和标准的研究

目的建立重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白质控方法和质量标准。方法用中和TNF-α生物学活性的方法测定重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白效价,用胰蛋白酶酶切分析肽图,用ELISA方法分别测定蛋白A、残留宿主细胞蛋白残留量和重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白含量。结果建立了重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的生物学活性、肽图分析、残留蛋白A等质控方法和质量标准。结论建立的方法和质量标准已用于重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白产品的检定。     

注射用重组人肿瘤坏死因子受体突变体-Fc融合蛋白对中国健康志愿者血浆中肿瘤坏死因子-α浓度水平的影响

目的研究不同剂量重组人肿瘤坏死因子受体突变体-Fc融合蛋白[rhTNFR(m):Fc]单次皮下给药对中国健康志愿者血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平的影响。方法研究纳入56例健康成年志愿者,分为6个剂量组,分别腹部皮下注射rhTNFR(m):Fc 10,20,35,50,65,75 mg,测定给药前(0 h),给药后4,48,96,168,216,264,312,384,480 h的血浆中游离TNF-α和总TNF-α的浓度。结果单次给药0~264 h后,各个剂量组志愿者体内游离TNF-α和总TNF-α浓度均出现了显著升高;在给药264~480 h后,血浆中游离TNF-α和总TNF-α浓度逐渐下降;给药后480 h,游离TNF-α浓度几乎降至正常。在10~75 mg剂量内,血浆中游离TNF-α和总TNF-α在体内的暴露量(Cmax)与rhTNFR(m):Fc的剂量之间无明显的线性相关性。结论中国健康志愿者单次给予rhTNFR(m):Fc后,可引起血浆中游离TNF-α和总TNF-α水平的升高,因此,血浆中游离TNF-α和总TNF-α水平可能并不适合作为该类药物的药效学评价指标。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗中重度类风湿关节炎的疗效与安全性

目的：观察国产重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白（TNFRⅡ-Fc）与甲氨蝶呤（MTX）联合治疗中重度类风湿关节炎的疗效与安全性。方法：46例病人随机分为MTX组和TNFRⅡ-Fc联合MTX组,疗程24周。疗效评价采用美国风湿病学会（ACR）疗效评定标准。结果：治疗2周后,联合治疗组的ACR20改善率和ACR50改善率均显著高于MTX组（P〈0.05,P〈0.01）。治疗24周后,联合治疗组的ACR50改善率约为MTX组的2倍;ACR70改善率约为MTX组的3.5倍。与基线值相比,MTX组在治疗12周后DAS28明显下降,而联合治疗组在治疗2周后DAS28即有所下降。在治疗2～24周期间,联合治疗组的DAS28较基线值下降的幅度均显著大于MTX组。MTX组和联合用药组不良事件总的发生率分别为17.4%和30.4%,差异无显著意义。其中最常见的不良事件为恶心和上腹不适。结论：TNFRⅡ-Fc联合MTX较单用MTX能更有效控制类风湿关节炎的病情活动,且不良反应无明显增加。     

重组人肿瘤坏死因子受体融合蛋白抗类风湿性关节炎机制研究

目的:探讨重组人肿瘤坏死因子受体融合蛋白(rhTNFR:Fc)对胶原诱导的Wistar大鼠类风湿性关节炎(CIA)动物模型的滑膜细胞凋亡影响。方法:模型随机分为阴性对照组、阳性对照组和rhTNFR:Fc组。rhTNFR:Fc组按17.5μg·kg(-1)每d皮下注射(ih)1次;阴性对照组ih等量0.9%氯化钠溶液;阳性对照组每d ih甲氨蝶呤(MTX),31 d后抽取膝关节滑液以ELISA法测IL-1β、TNFα水平;缺口末端标记法(TUNEL)标记检测凋亡。结果:TUNEL标记显示阴性对照组、阳性对照组、rhTNFR:Fc组的凋亡细胞分别为(2.1±0.9)%、(3.9±0.5)%和(4.4±0.8)%。阳性对照组和rhTNFR:Fc组膝关节滑液IL- 1β、TNF-α水平显著下降。结论:本试验首次阐明了rhTNFR:Fc可诱导CIA大鼠滑膜细胞的凋亡。抗类风湿性关节炎机制可能通过诱导滑膜细胞凋亡,最终减轻CIA大鼠的关节炎症。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗Felty综合征

Felty综合征又称关节炎-粒细胞减少-脾大综合征,病因与免疫异常有关,在类风湿关节炎中发病率约占1%,多发生于50～70岁的女性[1].临床除类风湿关节炎表现外,关节外表现包括脾脏肿大,有的出现巨脾症,伴轻至中度肝脏和淋巴结大.我们应用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗Felty综合征1例,近期疗效满意,现报告如下.     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗Felty综合征

Felty综合征又称关节炎-粒细胞减少-脾大综合征,病因与免疫异常有关,在类风湿关节炎中发病率约占1％,多发生于50—70岁的女性。临床除类风湿关节炎表现外,关节外表现包括脾脏肿大,有的出现巨脾症,伴轻至中度肝脏和淋巴结大。我们应用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗Fehy综合征1例,近期疗效满意,现报告如下。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子α受体抗体融合蛋白对肺纤维化鼠干预作用的实验研究

目的探讨重组人II型肿瘤坏死因子α受体抗体融合蛋白(rhRPTN,免疫球蛋白)对肺间质纤维化鼠的干预作用。方法在给药后第7、21、28和42天,用放射免疫法检测治疗组、模型组和正常组血清中透明质酸、III型前胶原的含量以及大鼠的大体病理形态。结果大体肉眼观察大鼠肺组织的病理形态,治疗组改变较正常组和模型组轻,其透明质酸和III型前胶原含量较后2组亦低(P<0.01),有统计学意义。结论rhRPTN对肺间质纤维化的发生发展具有显著抑制作用。     

风湿性关节炎应用注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗的疗效分析

目的 探讨风湿性关节炎应用注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗的疗效分析.方法 收集本院2014年1月至2015年5月入院的80例风湿性关节炎患者随机分为两组,对照组患者采用传统治疗,实验组则加施注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗,比较两组患者总体治疗效果、治疗后4、24周相关临床指标.结果 实验组患者总有效率(97.5％)明显高于对照组(80.0％),两组比较差异有统计学意义(x2=4.507,P＜0.05);实验组患者治疗后4、24周关节疼痛数[(1.75±0.57)、(0.77±0.41)]、关节肿胀数[(1.32±0.44)、(0.49±0.34)]、晨僵时间[(5.77±1.67)min、(3.96±1.01)min]、ESR[(11.72±4.37)mm/h、(10.01±4.13)mm/h]、CRP[(0.40±0.11)mg/dl、(0.27±0.09)mg/dl]、DAS28[(1.88±0.74)、(1.76±0.69)]与HAQ[(1.03±0.48)、(0.72±0.33)]均显著低于对照组,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 风湿性关节炎应用注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗的疗效显著,具有借鉴性.     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白致皮肤局部反应1例

患者,女,35岁,因强直性脊柱炎皮下注射重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白(上海中信国健药业股份有限公司,批号:20111161)25mg/次,2次/周,第5次注射4h后,右侧上臂三角肌下缘出现8cm×6cm硬结,红、肿、痒,持续120h后逐渐消退。第6次注射左侧上臂三角肌下缘2h后出现5cm×5cm硬结,红、痒,持续36h后逐渐消退。第7次注射右侧上臂三角肌下缘未出现硬结,微痒。以后注射再未出现注射部位局部皮肤不良反应。发生不良反应后用冷毛巾湿敷,未     

国产重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白在国内风湿性疾病治疗中的临床应用

生物制剂在国内风湿性疾病临床治疗中的应用越来越广泛,国产重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白近年在国内类风湿关节炎和强直性脊柱炎等风湿性疾病治疗中取得良好效果。本文综述其在风湿性疾病治疗中的国内临床应用。     

RP-HPLC法测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的含量

目的:建立测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(简称TACI-Fc)含量的方法。方法:采用反相高效液相色谱法。色谱柱为VydacC18,流动相A液为含0.1%三氟乙酸的水溶液,流动相B液为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,梯度洗脱,流速为1.3mL·min-1,检测波长为280nm。结果:TACI-Fc进样量在5.0～20.0μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系(r=0.9997);方法平均回收率为99.71%,RSD=1.14%(n=9)。结论:本方法操作简便、重复性好、结果准确,适用于测定注射用TA-CI-Fc的含量。     

The Pharmacology Study of a New Recombinant Human VEGF Receptor-Fc Fusion Protein on Experimental Choroidal Neovascularization

PURPOSE: KH902, a recombinant fusion protein, is designed for treatment of neovascular age-related macular degeneration. The study is to investigate the prevention efficacy of KH902 on experimental choroidal neovascularization (CNV) in a monkey model. MATERIALS AND METHODS: Binding assay and endothelial cell proliferation assay were used to evaluate activity and bioactivity of KH902 in vitro while an initial comparison of bioactivity was made between KH902 and Ranizumab (Lucentis). Ocular and systemic levels of KH902 were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method after single intravitreal administration to evaluate its availability to ocular fundus. In vivo pharmacological study, CNV was induced by laser in monkeys and KH902 prevention efficacy on CNV was evaluated by incidence of CNV and several ophthalmic examinations. RESULTS: KH902 is a unique fusion protein with high affinity to VEGF and good availability to target tissue, beneficial to good bioactivity in vivo. In vivo pharmacological study, the incidence of CNV formation was largely reduced in KH902 treatment groups. Furthermore, the leakage of CNV in control group which crossed over to KH902 treatment 40 days after laser was much less than that before KH902 treatment. CONCLUSION: KH902 was effective to prevent the formation of experimental CNV and also to treat pre-existed CNV without evidence of toxicity. This study suggests that KH902 has promise as a local anti-angiogenic treatment of CNV-related diseases.     

重组人血清白蛋白突变体干扰素2b融合蛋白的纯化

在成功构建人血清白蛋白突变体干扰素α2b融合蛋白(rmHSA-IFN-α2b)毕赤酵母工程菌株PicZαA/rmHSA-IFN-α2b/X33的基础上,建立了发酵分泌表达rmHSA-IFN-α2b的纯化工艺。对工程菌进行9 L罐高密度发酵后,离心收集发酵液上清,rmHSA-IFN-α2b的表达量为421 mg/L。对发酵液上清,依次进行3步纯化。第一步采用SP sepharose FF除去大部分色素和部分杂蛋白。第二步采用Blue sepharose FF根据亲和作用原理除去部分杂质。第三步采用Q sepharose FF除去溶剂和其他杂质以及类毒素。最终得到高纯度、有活性的rmHSA-IFN-α2b。通过HPLC检测和SDS-PAGE检测,最终产品的纯度都大于95%;通过活性检测,rmHSA-IFN-α2b的比活为1.5×106IU/mg。纯化总收率为25.3%。连续重复纯化6批,结果稳定。该工艺简单稳定,容易放大,适合规模化生产。简单高效纯化工艺的建立,为rmHSA-IFN-α2b后续研究奠定了坚实的基础。     

α-型重组人肿瘤坏死因子衍生物的稳定性研究

应用体外细胞毒实验对2种α－型重组人肿瘤坏死因子衍生物生物学效优的稳定性进行了考察。结果表明，这2种制品对温度和光照都比较敏感，受热后其生物学活性迅速下降。但在一20℃存放1a后，活性光明显变化。建议该2种制品应在低温条件下避光贮存。     

重组人红细胞生成素胶原蛋白双层微条的制备及含量测定

目的:制备重组人红细胞生成素(rhEPO)胶原蛋白双层微条并建立其含量测定方法。方法:以胶原蛋白为包裹材料,以硫酸软骨素钠为释放调节剂,采用凝胶加压成型的方法制备双层微条;采用反相高效液相色谱法测定双层微条中rhEPO的含量。结果:rhEPO检测浓度线性范围为0 .25～20μg/ml(r=0 9998) ,平均回收率为96 .2% ,日内、日间精密度分别为0. 9%、2 .6%(n=3)。结论:rhEPO胶原蛋白双层微条制备方法简单可行,含量测定方法准确、可靠。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗活动性类风湿性关节炎效果观察

目的研究重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR：Fc）对活动性类风湿关节炎（RA）的疗效。方法40例活动性RA随机分为两组,观察组皮下注射rhTNFR：Fc25mg,2次/周;对照组口服来氟米特（LEFT）20mg,1/d及甲氨蝶呤（MTX）15mg,1次/周。疗程为24周。治疗2、4、8、12、24周后,统计两组达到美国风湿病学会（ACR）20、ACR50、ACR70改善标准的情况。结果治疗2、4周后,观察组ACR20的比例明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）;治疗8周后,观察组ACR20、50的比例均明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）;治疗24周后,观察组ACR20、50、70的比例均显著高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。对照组中的消化道症状发生率明显高于观察组（P〈0.05）。结论 rhTNFR：Fc对活动性RA具有良好的疗效及安全性。     

抗SARS病毒融合蛋白单克隆抗体的制备与初步鉴定

用基因工程技术表达的SARS-CoV S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白作抗原免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,经ELISA法筛选阳性克隆及测定效价,用免疫印迹法进行特异性鉴定。最终获得2株(1F11和3D2)能稳定分泌抗SARS-CoV融合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。其培养上清的ELISA效价分别为1∶1024和1∶512;腹水效价分别为:1×10-6,2×10-5。1F11株识别融合蛋白上的N抗原表位,3D2识别其上的S抗原表位。该单抗可望成为快速诊断SARS-CoV感染的特异性抗体。     

重组可溶性TRAIL冻干保护剂的初步筛选

目的 筛选出适合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）冻干制剂的保护剂。方法在TRAIL蛋白中加入不同浓度配方的甘露醇、清蛋白和乳糖，经过冷冻干燥，观察冻干制剂的色泽、外观、溶解度和澄明度，并且测定冻干制品的水分和生物学活性，筛选出最佳保护剂。结果初步筛选出2％甘露醇＋3％乳糖作为TRAIL蛋白的保护剂。结论 TRAIL蛋白药物加入该保护剂后，外观、溶解度、澄明度及生物活性都比较好。在不同温度，对TRAIL蛋白生物活性有很好的稳定作用。     

重组人粒细胞集落刺激因子对化疗后中性粒细胞缺乏的有效性和安全性研究

目的：评价重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）对化疗所致中性粒细胞缺乏的恶性血液病患者的临床疗效和安全性。方法：对2012年1~12月我院73例化疗后出现中性粒细胞缺乏的恶性血液病患者进行调查分析,均在粒缺发生后使用rhG-CSF,用SPSS统计软件对信息进行分析。结果：rhG-CSF可以有效缓解化疗后的中性粒细胞缺乏,使白细胞和中性粒细胞数目明显升高,平均恢复时间为（7.77±5.14） d,总有效率为95.9%,研究中根据病人中性粒细胞缺乏发生程度、阶段及持续时间进行个体化给药。结论：rhG-CSF对化疗所致的中性粒细胞缺乏症安全有效。     

重组人血管内皮抑素联合DIA方案治疗骨肉瘤的临床分析

目的观察重组人血管内皮抑素联合DIA方案治疗骨肉瘤的临床效果。方法将我院2007年9月至2008年9月收治的76例骨肉瘤患者随机分成观察组和对照组,每组38例。所有患者手术治疗后,观察组采用重组人血管内皮抑素联合DIA方案治疗,对照组采用DIA方案治疗,比较两组的临床疗效、不良反应、5年生存曲线以及肢体功能。结果观察组和对照组的临床有效率分别为71.0%、51.3%,观察组显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组患者不良反应的差异无统计学意义(P>0.05);而5年生存曲线以及肢体功能的差异有统计学意义(P<0.05)。结论重组人血管内皮抑素联合DIA方案治疗骨肉瘤的疗效较单用DIA方案更好,且安全性高,值得在临床推广。