尼古丁对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性的抑制作用

目的:通过观察尼古丁对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶及生物活性的影响,探讨其对骨折愈合的作用机制。方法:不同含量的尼古丁硫酸盐作用于兔骨髓间充质干细胞,分别在1,3,5,7d时测定碱性磷酸酶活性,于3周时测定细胞生长数及细胞集落形成单位(colonyformingunit,CFU)。结果:尼古丁硫酸盐含量0.05g/L第7天的碱性磷酸酶活性为20.26,0.1g/L第5天时为18.46,0.2及0.4g/L第3天时分别为20.27和19.06,碱性磷酸酶活性的变化差异开始有显著性意义P<0.01),且(碱性磷酸酶活性随尼古丁含量的增高及作用时间的延长而逐渐降低,而3周后测定的细胞数及CFU差异无显著性意义。结论:尼古丁抑制骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性,并表现出对浓度和时间的依赖性,而对细胞生长形态以及细胞集落形成单位无明显影响。     

脉冲电磁场对骨髓间充质干细胞成骨成脂肪分化的影响

目的研究15Hz、1mT脉冲电磁场对骨髓间充质干细胞向成骨、成脂肪分化的影响。方法体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，取第3代细胞，用15Hz、1mT脉冲电磁场刺激，按照碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒说明书步骤检测ALP活性，用半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测骨髓间充质干细胞成骨、成脂肪指标的表达，油红O染色观察其成脂肪诱导分化情况。结果15Hz、1mT脉冲电磁场明显促进骨髓间充质干细胞ALP活性（P〈0．01）以及成骨蛋白（骨钙蛋白、骨桥蛋白）的mRNA表达；抑制脂肪素、脂肪细胞结合蛋白2（AP-2）等成脂肪转录因子的表达，抑制骨髓间充质干细胞向成脂肪分化。结论15Hz、1mT脉冲电磁场可促进骨髓间充质干细胞向成骨分化，抑制其向成脂肪分化。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的流体剪切应力参数

目的：流体剪切力是骨骼组织中骨骼细胞所感受到的主要应力刺激，可促进骨骼细胞的增殖、分化及保持细胞正常的生理功能。应用流体剪切力刺激体外培养的人骨髓间充质干细胞，观察其向成骨细胞分化的可行性。方法：实验于2004—04／12在第三军医大学西南医院完成，骨髓来源于正常志愿献髓者。进行人骨髓间充质干细胞的分离培养，实验组应用平行平板流动腔对自愿捐献的人骨髓间充质干细胞给予强度为0．3Pa的流体剪切力刺激30min，对照组不加此干预，两组物理环境相同。应用流式细胞仪检测细胞周期，应用透射电镜观察细胞超微结构，检测细胞内碱性磷酸酶含量。评估其向成骨细胞分化和具备功能的特征。放免法检测培养上清液骨钙素含量。评估其是否向成骨细胞成熟晚期分化。并与静态培养对照组作对比。结果：①实验组经流体剪切力作用后，细胞胞体变大，突起较多，多角形细胞较对照组增多；透射电镜观察可见细胞胞浆丰富、核浆比例小，有较多的内质网，高尔基体发达，核仁明显，呈成熟细胞表现。②实验组细胞S期(DNA合成期)比例较对照组明显增高[(13．53&;#177;1．47)％，(7．56&;#177;2．54)％，P&;lt;0．01]。③实验组细胞内碱性磷酸酶含量第9天开始增高，且随时间延长，增高速度加快。④第12天及第24天检测的上清液骨钙素含量两组无明显差别(t=0．263，-0．406，P&;gt;0．05)。结论：本实验发现强度为0．3Pa作用30min的流体剪切力可以使人骨髓间充质干细胞早期的细胞内碱性磷酸酶含量增高，细胞开始向成骨细胞分化，但未能促使晚期的骨钙素表达升高，说明此强度的流体剪切力不能成功促进人骨髓间充质干细胞最终实现向成骨方向分化。需要继续探索能够促进人骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的流体剪切力的更有效的参数。     

去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

背景：细胞学研究表明,骨髓间充质干细胞在绝经后骨质疏松症的发病过程中起有重要作用。目的：观察去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨分化。方法：将6月龄雌性SD大鼠双侧卵巢切除建立骨质疏松模型。实验分为4组：正常干细胞组、骨质疏松干细胞组、正常干细胞成骨诱导组、骨质疏松干细胞成骨诱导组。全骨髓贴壁法培养正常和骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞至第3代细胞用于实验。倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞周期、增殖指数。加成骨诱导液进行成骨诱导,检测各组骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性,茜素红染色法比较各组钙结节的形成。结果与结论：正常干细胞成骨诱导组、骨质疏松干细胞成骨诱导组均具有成骨细胞的形态特征,但骨质疏松干细胞成骨诱导组形态变化相对缓慢。正常干细胞组细胞增殖指数高于骨质疏松干细胞组（P〈0．05）;成骨诱导组碱性磷酸酶活性均明显高于相应的正常或骨质疏松干细胞组（P〈0．05）;正常干细胞成骨诱导组明显高于骨质疏松干细胞成骨诱导组（P〈0．05）。成骨诱导组茜素红染色均呈阳性,相应的正常或骨质疏松干细胞组呈阴性;且正常干细胞成骨诱导组染色强于骨质疏松干细胞成骨诱导组。提示去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力和成骨分化能力明显降低,可能与去卵巢大鼠骨质疏松的发生相关。     

成纤维细胞生长因子18对体外培养兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的影响

目的：构建可稳定表达成纤维细胞生长因子18蛋白的真核表达载体，观察成纤维细胞生长因子18对体外培养的兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的影响。 方法：本实验于2002-10／2004-03在解放军第四军医大学全军骨肿瘤研究所及121腔医学院完成。①将pGEM-T-FGF18-3和pSecTag2B表达载体分别用KpnⅠ和NotⅠ酶切后重组pSecTag2B-FGF18质粒；ELISA检测转染后COS-7细胞上清的成纤维细胞生长因子18蛋白，以大于阴性对照A值2.1倍以上为阳性结果。②用细胞上清刺激骨髓基质干细胞，根据含小牛血清的DMEM不同比例稀释转染后COS-7细胞上清分为1：2稀释组、1：4稀释组、1：8稀释组、1：16组、1：32稀释组；对照组：用含体积分数为0．02小牛血清的DMEM培养液按1：2稀释未转染的COS-7细胞上清。⑧通过酶动力法检测细胞碱性磷酸酶合成情况。 结果：①成功构建了pSecTag2B-FGFl8真核表达载体。②转染哺乳动物细胞COS-7用夹心ELISA法检测到了成纤维细胞生长因子18蛋白质的稳定表达，原液及l：10稀释度细胞上清A值大于阴性对照A值2．1倍以上（P〈0．01）。③用细胞上清刺激骨髓基质干细胞72h后，1：2稀释组、1：4稀释组、1：8稀释组、1：16组、1：32稀释组骨髓基质干细胞A值较对照组明显增高（P〈0．01），证实了成纤维细胞生长因子18对体外培养的兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的促进作用。 结论：成纤维细胞生长因子18有显著促进体外培养的兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的作用，提示成纤维细胞生长因子18对于骨髓基质干细胞的分化及成骨表型的维持起着重要的调节作用。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染免骨髓间充质干细胞

背景:碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况.设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成.材料:日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科.pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品.方法:抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代.参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xhol I、BamH I双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株.主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达.结果:流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性.转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在M_r 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带.结论:实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达.     

杜仲诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的有效部位

背景:体外细胞培养实验发现,杜仲能够诱导骨髓间充质干细胞成骨分化。目的:分离确认杜仲诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的有效部位。方法:体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。提取分离杜仲有效部位,杜仲粉末经体积分数60%乙醇提取,再用半制备高效液相色谱仪法收集6个组分,编号为B2.1.1、B2.1.2、B2.1.3、B2.1.4、B2.1.5、B2.1.6。取第3代骨髓间充质干细胞,加入不同浓度的杜仲分离物,诱导培养6d,同时设非诱导对照。荧光定量PCR法测定成骨分化标记物碱性磷酸酶的表达变化。结果与结论:在高效液相色谱仪分离的6个组分中,B2.1.1和B2.1.3两个组分具有显著刺激骨髓间充质干细胞成骨分化标志基因碱性磷酸酶表达的作用,与非诱导对照相比,其表达分别达到3.73和4.74倍。实验初步分离了杜仲诱导骨髓间充质干细胞成骨分化有效部位,为最终分离和确认有效物质的化学成分提供了资料。     

工频电磁场对骨髓间充质干细胞增殖、分化及其胞浆内钙离子浓度的影响

目的：研究工频电磁场刺激对骨髓间充质干细胞（MSC）的增殖与分化以及胞浆内钙离子浓度的影响。方法体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，取第4代细胞，应用工频电磁场进行干预。用四甲基偶氮唑蓝比色法检测其增殖活性，采用碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒检测ALP活性。应用Fura．2／AM对细胞进行染色，用细胞内双波长钙荧光系统测定细胞胞浆内游离钙离子的浓度。结果50Hz、1．1mT的电磁场对骨髓间充质干细胞具有明显的促增殖作用（P〈0、05），使其ALP活性增高（P〈0．05）。无论是放置在含诱导剂还是不含诱导剂培养基中的细胞，其胞浆内的钙离子浓度在电磁场刺激下都有不同程度的增高。结论50Hz、1.1mT的电磁场可促进MSC增殖，使其向成骨细胞分化。胞浆内钙离子浓度增加可能在细胞的增殖与分化过程中起着重要作用。     

维拉帕米在电磁场刺激骨髓间充质干细胞增殖与分化过程中的作用

目的 研究在50Hz、0．8mT的电磁场条件下，维拉帕米（verapamil）对骨髓间充质干细胞增殖与分化的作用，以推断Ca^2＋在此过程中的作用及其内流变化情况。方法 体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，取第4代细胞，应用工频电磁场及维拉帕米干预，用四甲基偶氮唑蓝比色法检测其增殖活性，按照碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒说明书步骤检测ALP活性，并用改良Gomori钙钻法染色定性观察。结果 50Hz、0．8mT的电磁场对骨髓间充质干细胞具有明显的促增殖（P〈0．01）、抑分化（P〈0．01）作用，但在加入维拉帕米后，这种增殖效应消失而抑分化效应减弱（P〈0．01）。结论 在50Hz、0．8mT的电磁场作用下，骨髓间充质干细胞Ca^2＋内流发生变化，且该变化在骨髓间充质干细胞向成骨方向分化过程中起部分抑制作用，而在促其增殖的过程中起主要作用。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中26RFa的作用

背景：研究表明26RFa在骨形成、痛觉、内分泌、心血管以及能量代谢等方面都有重要的调节作用。目的：观察26RFa在成骨培养体系中对人骨髓间充质干细胞增殖分化的影响。 方法：通过MTT实验,以此确定26RFa对人骨髓间充质干细胞是否有促增殖作用及其起作用的最大活性浓度;将人骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板上,实验分为2组：实验组含有10-11mol/L的26RFa,对照组不含26RFa。取成骨诱导8,12,16 d细胞用碱性磷酸酶试剂盒测定细胞内碱性磷酸酶活性;成骨诱导21,28 d后行茜素红染色和Von Kossa染色,计算每张玻片钙化结节数,Western blot检测cbfa1的表达。 结果与结论：成骨诱导8,12,16 d后细胞内碱性磷酸酶活性实验组高于对照组（P〈0.05,P〈0.01,P〈0.05）;21,28 d后茜素红染色和Von Kossa矿化结节数实验组均高于对照组;实验组细胞cbfa1表达明显高于对照组（P〈0.05）。说明在适宜的培养条件下,26RFa可促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

大鼠骨髓和脂肪来源间充质干细胞的成骨特性比较

背景:尽管骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞均具有向骨和软骨分化潜能,但终究带有各自来源组织的特点,那么是否意味着两者在非基因影响下成骨特性存在一定差异呢?目的:比较大鼠骨髓和脂肪来源的间充质干细胞在体外成骨分化中的特性区别。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2008-03在中国科学院昆明动物研究所国家级重点实验室完成。材料:6周龄和18周龄SD大鼠各2只,分别用于制备骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。方法:选取第3代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,按5×107L-1接种后各分为2组:诱导组加入含10-8mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养基1.5mL,未诱导组不加入成骨诱导培养基。主要观察指标:碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果,碱性磷酸酶和骨钙素定量分析结果。结果:成骨诱导7,14d,经诱导的骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞呈碱性磷酸酶阳性,有钙结节形成,未诱导组呈阴性。成骨诱导3,7,10d,未诱导组间比较碱性磷酸酶及骨钙素含量均基本相似(P>0.05);与未诱导组比较,脂肪间充质干细胞诱导组碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞诱导组升高幅度更为显著(P<0.001)。结论:大鼠骨髓来源间充质干细胞体外成骨性能强于脂肪来源间充质干细胞,在骨组织工程种子细胞的选用中应优先考虑前者。     

心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞自体移植的影响

目的：了解骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在心肌梗死的缺血心肌微环境中转化为心肌细胞并改善心功能的可行性，及同时心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)对此过程的影响。方法：将21只兔结扎左前降支制作急性心肌梗死模型，骨穿抽取骨髓，分离培养扩增MSCs。随机分成3组，术后2周进行心肌梗死瘢痕内移植5-溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine，BrdU)标记的MSCs(加或不加bFGF)(MSCs组、MSCs+bFGF组)，对照组注射培养基。心肌梗死手术前、手术后3d及移植后4周做超声心动图检测心功能，处死动物取左室标本作冷冻切片，采用免疫荧光法鉴定植入细胞，并检测VIII因子相关抗原以测量毛细血管密度。结果：两细胞移植组左室切片中均可见BrdU染色阳性细胞即植入细胞。对照组未见BrdU染色阳性细胞。VIII因子阳性内皮细胞计数表明MSCs组及MSCs+bFGF组毛细血管密度分别为每高倍视野29&;#177;8和31&;#177;6，显著高于对照组(21&;#177;5)(F=11．971，P&;lt;0．01)，超声心动图检测证实MSCs组及MSCs+bFGF组移植后4周射血分数显著大于对照组(F=5．850，P&;lt;0．05)，两细胞移植组间上述各项差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。结论：缺血心肌内注射MSCs可依赖组织微环境转化为心肌细胞修复梗死心肌，促进血管新生从而改善心功能，可用于心肌梗死的治疗；心肌内单次直接注射bFGF对MSCs自体移植无显著影响。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的流体剪切应力参数

目的:流体剪切力是骨骼组织中骨骼细胞所感受到的主要应力刺激,可促进骨骼细胞的增殖、分化及保持细胞正常的生理功能。应用流体剪切力刺激体外培养的人骨髓间充质干细胞,观察其向成骨细胞分化的可行性。方法:实验于2004-04/12在第三军医大学西南医院完成,骨髓来源于正常志愿献髓者。进行人骨髓间充质干细胞的分离培养,实验组应用平行平板流动腔对自愿捐献的人骨髓间充质干细胞给予强度为0.3Pa的流体剪切力刺激30min,对照组不加此干预,两组物理环境相同。应用流式细胞仪检测细胞周期,应用透射电镜观察细胞超微结构,检测细胞内碱性磷酸酶含量。评估其向成骨细胞分化和具备功能的特征。放免法检测培养上清液骨钙素含量。评估其是否向成骨细胞成熟晚期分化。并与静态培养对照组作对比。结果:①实验组经流体剪切力作用后,细胞胞体变大,突起较多,多角形细胞较对照组增多;透射电镜观察可见细胞胞浆丰富、核浆比例小,有较多的内质网,高尔基体发达,核仁明显,呈成熟细胞表现。②实验组细胞S期(DNA合成期)比例较对照组明显增高[(13.53±1.47)%,(7.56±2.54)%,P<0.01]。③实验组细胞内碱性磷酸酶含量第9天开始增高,且随时间延长,增高速度加快。④第12天及第24天检测的上清液骨钙素含量两组无明显差别(t=0.263,-0.406,P>0.05)。结论:本实验发现强度为0.3Pa作用30min的流体剪切力可以使人骨髓间充质干细胞早期的细胞内碱性磷酸酶含量增高,细胞开始向成骨细胞分化,但未能促使晚期的骨钙素表达升高,说明此强度的流体剪切力不能成功促进人骨髓间充质干细胞最终实现向成骨方向分化。需要继续探索能够促进人骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的流体剪切力的更有效的参数。     

人重组骨形成蛋白—2对骨髓成骨细胞增睡碱性磷酸酶活性的影响

目的 探讨人重组骨形成蛋白－2（rhBMP-2)对人骨髓成骨细胞增殖和分化的影响以及剂量效应关系。方法 以改良方法培养的骨髓成骨2细胞为作用底物，加入梯度浓度的rhBMP-2溶液，应用MTT法和碱性磷酸酶（ALP）染色法检测其对细胞增殖和ALP活性的影响。结果 rhBMP-2浓度低于1μg/ml时对人骨髓成骨细胞的增殖无明显影响，高于此浓度时有细胞的增殖有明显的促进作用，但无显的剂量效应关系。从0．1－10μg/ml，ALP与rhBMP-2具有剂量依赖性促进关系，rhBMP-2浓度为10μg/ml时，其ALP活性是对照组的4倍，在高于10μg/ml时ALP活性没有进一步显提高。结论 rhBMP-2对骨髓成骨2细胞的增殖的碱性磷酸酶活性人有促进作用，其最佳效应浓度为10μg/ml。     

成纤维细胞生长因子18对体外培养兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的影响

目的:构建可稳定表达成纤维细胞生长因子18蛋白的真核表达载体,观察成纤维细胞生长因子18对体外培养的兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的影响。方法:本实验于2002-10/2004-03在解放军第四军医大学全军骨肿瘤研究所及口腔医学院完成。①将pGEM-T-FGF18-3和pSecTag2B表达载体分别用KpnⅠ和NotⅠ酶切后重组pSecTag2B-FGF18质粒;ELISA检测转染后COS-7细胞上清的成纤维细胞生长因子18蛋白,以大于阴性对照A值2.1倍以上为阳性结果。②用细胞上清刺激骨髓基质干细胞,根据含小牛血清的DMEM不同比例稀释转染后COS-7细胞上清分为1∶2稀释组、1∶4稀释组、1∶8稀释组、1∶16组、1∶32稀释组;对照组∶用含体积分数为0.02小牛血清的DMEM培养液按1∶2稀释未转染的COS-7细胞上清。③通过酶动力法检测细胞碱性磷酸酶合成情况。结果:①成功构建了pSecTag2B-FGF18真核表达载体。②转染哺乳动物细胞COS-7用夹心ELISA法检测到了成纤维细胞生长因子18蛋白质的稳定表达,原液及1∶10稀释度细胞上清A值大于阴性对照A值2.1倍以上(P<0.01)。③用细胞上清刺激骨髓基质干细胞72h后,1∶2稀释组、1∶4稀释组、1∶8稀释组、1∶16组、1∶32稀释组骨髓基质干细胞A值较对照组明显增高(P<0.01),证实了成纤维细胞生长因子18对体外培养的兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的促进作用。结论:成纤维细胞生长因子18有显著促进体外培养的兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的作用,提示成纤维细胞生长因子18对于骨髓基质干细胞的分化及成骨表型的维持起着重要的调节作用。     

大鼠仔鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与鉴定

目的分离培养骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)并进行鉴定。方法取周龄大鼠骨髓用percoll分离液分离,DMEM(含20%胎牛血清)培养、传代,碱性磷酸酶和苏丹Ⅳ染色,流式细胞仪测MSCs表面标志CD44和CD45。结果碱性磷酸酶染色和苏丹Ⅳ染色阴性,CD44、CD45表达甚微。结论所分离培养的细胞为未分化的具有较强增殖能力的细胞,可认为是间充质干细胞。     

新生儿不同疾病白细胞碱性磷酸酶活性的临床观察

采用萘酚ＡＳ－ＭＸ法测定１０６例不同疾病的新生儿正常新生儿的白细胞碱性磷酸酶（ＬＡＰ）活性，并计数白细胞总数和分类。结果细胞性感染组ＬＡＰ活性明显高于对照组、非感染组和病毒组，差异有非常显著意义；病毒性疾病组ＬＡＰ活性明显低于对照组。提示ＬＡＰ活性是诊断新生儿细菌性疾病有意义的检测指标，而且对鉴别细菌和病毒性感染有一定的临床价值。     

Ca2+在电磁场刺激骨髓间充质干细胞增殖与分化过程中的内流变化

背景:已证实电磁场可通过cAMP-蛋白激酶A信号转导系统调控骨髓间充质干细胞的增殖与分化,但同样作为第二信使的Ca2 相关作用报道较少。目的:观察钙拮抗剂维拉帕米对电磁场刺激骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响,以推断Ca2 在此过程中的内流变化。设计、时间及地点:电刺激细胞学体外观察,于2005-04/06在同济医院矫形外科实验室完成。材料:清洁级4~5周龄SD大鼠6只,维拉帕米为Sigma公司产品,Helmholtz线圈式磁场发生器由海军工程大学电机系设计制造。方法:贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰蛋白酶消化传代。取生长良好的第4代细胞,调节密度至1×107L-1,将其分种于4块96孔板内,200μL/孔。正常对照组不进行任何干预;暴磁组接种第2天将细胞放于置有Helmholtz线圈式磁场发生器的37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度细胞培养箱中进行暴磁,磁场强度0.8mT,频率50Hz,每次暴磁30min,间隔12h,共6次;维拉帕米组加入20μmol/L维拉帕米;联合组加入20μmol/L维拉帕米后进行暴磁。主要观察指标:MTT法检测细胞增殖活性,向成骨细胞分化碱性磷酸酶的含量,改良Gomori氏钙钴法染色定性观察。结果:暴磁3d后,与正常对照组比较,暴磁组细胞增殖活性明显升高(P<0.01),加入维拉帕米进行药物干预后这种促细胞增殖效应消失。未经暴磁的正常对照组、维拉帕米组细胞碱性磷酸酶含量基本相似,均明显高于其余2组(P<0.01);联合组细胞碱性磷酸酶含量高于暴磁组(P<0.01)。碱性磷酸酶染色定性分析结果与上述数据基本一致。结论:在50Hz、0.8mT电磁场作用下,骨髓间充质干细胞Ca2 内流发生变化,且该变化在骨髓间充质干细胞向成骨方向分化过程中产生部分抑制作用,在促其增殖过程中起主导作用。     

骨髓间充质干细胞研究进展

骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived Mesenchymal stemcells，骨髓MSCs）是骨髓内除造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC）之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位（Colony forming unit fibroblast，CFU-F）。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）。     

人重组骨形成蛋白-2对骨髓成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的探讨人重组骨形成蛋白-2(rhBMP-2)对人骨髓成骨细胞增殖和分化的影响以及剂量效应关系。方法以改良方法培养的骨髓成骨细胞为作用底物,加入梯度浓度的rhBMP-2溶液,应用MTT法和碱性磷酸酶(ALP)染色法检测其对细胞增殖和ALP活性的影响。结果rhBMP-2浓度低于1μg/ml时对人骨髓成骨细胞的增殖无明显影响,高于此浓度时对细胞的增殖有明显的促进作用,但无显著的剂量效应关系。从0.1～10μg/ml,ALP与rhBMP-2具有剂量依赖性促进关系,rhBMP-2浓度为10μg/ml时,其ALP活性是对照组的4倍,在高于10μg/ml时ALP活性并没有进一步显著提高。结论rhBMP-2对骨髓成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶活性具有促进作用,其最佳效应浓度为10μg/ml。