脐血CD+34细胞体外扩增新进展

造血干细胞(hematepoietic stein cell，HSC)是各种血细胞和免疫细胞的始祖，具有极重要的生理功能。脐带已经成为近年来研究的热点，但单份脐血中造血干细胞理论上不少，但实际上数量往往不足以支持成人的造血重建，需要体外加以扩增。影响脐血CD34^ 细胞体外扩增的因素有很多，现就几种关键因素对脐血CD34^ 细胞体外扩增作用的研究新进展综述如下。     

人脐血CD34+细胞和贴壁细胞体外诱导树突状细胞及其鉴定

目的 从人脐血中不同的前体细胞扩增树突状细胞(DCs)，并对其进行鉴定。方法 用免疫磁珠法分离人脐血CD34^ 细胞，以GM—CSF、TNF-α、FL、SCF和IL-4诱导生成DC；用Ficoll分离脐血单个核细胞，2h贴壁后的细胞，以GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导生成DC。观察细胞形态，流式细胞仪分析表面标志(CDla、CD80、HLA-DR)，并检测其刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果 人脐血CD34^ 细胞和贴壁细胞体外诱导生成的细胞均具有典型的DC形态特征，表达高水平的DC分化抗原CDla，MHCⅡ类抗原递呈分子HLA—DR和CD80共刺激分子，并具有刺激同种异体T细胞增殖的能力。前者扩增DC的效率更高。结论 从人脐血CD34^ 细胞和贴壁细胞均可诱生出功能性DC，是DC理想的组织来源。     

脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的探索脐血CD34 细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法。方法Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34 细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定。结果体外培养14d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P<0.05)。结论体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α,能够成功诱导脐血CD34 细胞分化为大量活力好的DCs。     

多种细胞因子组合对脐血CD34+细胞的体外扩增

目的 探讨不同细胞因子组合在无血清、无基质条件下对脐血干／祖细胞的调控作用。方法 将SCF、Flk2／Flt3配体(FL)、TPO、IL-6及IL-6受体的可溶性形式(sIL-6R)进行不同组合扩增脐血CD34^ 细胞。结果 ①SCF FL ／-TPO组合能有效快速扩增脐血CD34^ 、CD34^ Thy-1^ 、CD34^ CD33^ 及长期培养启始细胞(LTC—IC)；②该组合同时加入IL-6及sIL-6R后，脐血干／祖细胞显著增殖；单独加入IL-6(不含sIL-6R)时，早期CD34^ 细胞和LTC—IC含量无明显增加，而且CFU-Mix、BFU—E的扩增不如CFU—GM明显；③通过细胞凋亡早期膜变化标记FITC—Annexin—V检测细胞凋亡率，加入Flt3L和／或IL-6 sIL-6R后Annexin-V阳性细胞由15．2％～19．1％降至2．8％～3．5％。结论 在SCF TPO Flt3L IL-6 sIL-6R组合的无基质、无血清悬浮体系中，脐血既能产生大量定向祖细胞，又能保持一定数量的早期造血细胞，这一体外培养体系具有重要的临床意义。     

脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的 探索脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法.方法 Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34+细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3 Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14 d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定.结果 体外培养14 d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P＜0.05).结论 体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α, 能够成功诱导脐血CD34+细胞分化为大量活力好的DCs.     

人脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的 采用脐血CD34+细胞在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下体外分化扩增为成熟树突状细胞.方法 应用CD34+干细胞分选试剂盒以及免疫磁珠法从脐血中分离CD34+细胞,用rhGM-CSF、rhTNF-α联合诱导分化发育14 d,成为成熟DC,观察细胞形态及检测CD83分子表达.结果 50 ml脐带血可分离出CD34+细胞约1.1×106,在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下CD34+干细胞培养2周,约扩增10～20倍.CD34+干细胞培养第3 d开始出现集落,第8～9天集落最大,CD34+干细胞分化发育为有树突状突起的成熟DC,表面分子CD83阳性率为81.7%.结论 体外联合运用rhGM-CSF、rhTNF-α,能够成功诱导脐血CD34+细胞分化为大量成熟的DCs.     

人脐血基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的作用

目的研究人脐血基质细胞(hUCBSCs)对脐血CD34+细胞体外扩增的促进作用. 方法应用MACS磁珠分离系统分离脐血CD34+细胞,按照DEXTER法行脐血基质细胞培养,观察hUCBSCs的生长状态及细胞表面分子的表达情况.建立以hUCBSCs为滋养层的脐血CD34+细胞体外扩增体系,并对脐血CD34+细胞短期扩增后行集落形成单位(CFU)-GM、CFU-E和CFU-Mg半固体培养. 结果脐血基质细胞为混合细胞群,包括CD68(+)、Fn(+)、CD31(+)和CD34(-);以hUCBSCs为滋养层的体外扩增体系对脐血CD34+细胞具有明显的扩增作用,体外液体扩增后的脐血CD34+细胞集落形成能力明显高于对照组,其中细胞因子(SCF+IL-3+EPO+TPO+GM-CSF)联合hUCBSCs体系的扩增作用最强,hUCBSCs在促进CFU-Mg集落形成的作用中具有明显优势. 结论hUCBSCs具有体外支持造血作用,与细胞因子联合对促进脐血CD34+细胞扩增作用更加明显.hUCBSCs对促进巨核细胞扩增可能具有特殊的意义.     

脐血CD34+细胞的体外扩增研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)的扩增作用.方法:应用StemsepTM阴性分选系统分离纯化CD34+细胞,在体外液体培养体系中经不同组合细胞因子进行扩增1～3w.结果:FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF+Epo组合的扩增效果最佳,可分别扩增细胞总数、造血祖细胞集落总数(CFCs)、CD34+细胞达1627.57±52.93、56.78±8.13、41.09±4.11倍.FL和Tpo具有明显的协同扩增早期祖细胞的作用,CFCs和CD34+细胞在1～2w维持在较高水平,以后逐渐衰退.结论:合理的细胞因子组合在大量扩增造血细胞的同时也有助于早期造血祖细胞的自我更新,把握适宜的扩增时机,将有助于扩增细胞在质和量上满足移植和基因治疗等的要求.     

慢性粒细胞白血病树突状细胞的体外定向诱导扩增及鉴定

目的：W本外定向诱导扩增慢性粒细胞白血病（CML）患者外周血单个核细胞（PBMNC）来源的树突状细胞（CML－DC）并测定其表型。方法：取CML患者新鲜抗凝血,用淋巴细胞分离液分离PBMNC,经细胞因子rhGM-CSF,rhIL-4,rhTNF-α联合刺激培养9－12d,收集培养细胞,光镜形态学分析并细胞计数,结合PE－CD1a单抗、FITC－CD14居流式细胞 （FCM）上进行CML－DC比例及表型分析。结果CML患者PBMNC经以上细胞因子联合培养,CML－DC含是可达3．5％－23．5％,而新鲜分离的CML患者PBMNC中CML－DC含量仅为0．1％－1％,结论CML患PBMNC 体外定向诱导扩增培养可以生成较多的CML－DC,从而为CML的免疫治疗应用于临床提供了基础。     

不同细胞因子对脐血CD34+细胞扩增的影响

目的探讨不同细胞因子促进脐血CD34 细胞扩增的效应,为下一步的临床应用奠定基础。方法采用EasySep免疫磁珠阳性选择系统分离脐血中CD34 细胞,在无血清、无基质细胞培养体系中添加不同细胞因子培养2周,分组:A组,SCF FL TPOB组,SCF FL TPO IL-3C组,SCF FL TPO G-CSF。结果CD34 细胞数目于培养后7d达到峰值,3组间差异无显著性;B组扩增至14d时细胞总数达(384.40±17.48)倍,显著高于另外2组。扩增7d后的脐血细胞经体外培养可形成造血集落。结论体外扩增脐血CD34 细胞理想的细胞因子组合为SCF TPO FL,以7d为宜。     

应用Solexa技术检测脐血CD34+细胞体外诱导的巨核细胞mRNA表达

目的 应用Solexa技术研究人脐带血CD34+细胞体外诱导巨核细胞的mRNA表达.方法 采用密度梯度离心法和免疫磁珠分选系统获取人脐带血CD34+细胞.100 ng/ml促血小板生成素诱导培养12 d后,应用抗CD41+单克隆抗体免疫磁珠法分选获得巨核细胞和非巨核细胞.应用Solexa技术检测巨核细胞和非巨核细胞的mRNA表达差异.结果 获取的Tag初始数量巨核细胞和非巨核细胞分别为3 773 147和3 533 805个.整个清晰的Tag数量分别为3 291 132和2 967 947个,明显独特的tag数量分别为197 769和245 318个.其中上调基因表达数量为1161个,下调为902个.上调Tag表达数量为2717个,下调为1519个.结论 巨核细胞和非巨核细胞mRNA表达存在显著差异,差异基因编码产物与细胞发育、黏附、凋亡、代谢、细胞内及细胞间的信号转导以及免疫应答等功能相关,进一步深入将有助于探讨巨核细胞的表达机制、信号传导及调控机制.     

成人骨髓间充质干细胞对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

目的: 探讨骨髓间充质干细胞(MSCS)对脐血CD34 细胞体外扩增作用. 方法: 分离培养成人MSCS作为滋养层,联合SCF, IL-11和GM-CSF分别组成对脐血CD34 细胞的不同扩增体系,培养3 wk后观察脐血有核细胞、CFCs以及CD34 细胞扩增倍数的变化. 结果: MSCS联合细胞因子组较其他组培养体系对有核细胞总数、CFCs含量及CD34 细胞含量均具有明显的扩增作用,分别扩增了114.2±2.4, 40.5±8.6, 11.3±0.4 倍. 结论: 成人MSCS协同其他细胞因子可增强脐血CD34 细胞的体外扩增作用.     

基质细胞对小鼠骨髓单个核细胞体外扩增的促进作用

目的 阐明基质细胞在造血细胞体外扩增中的作用。方法 采用骨髓基质细胞培养、骨髓单个核细胞（BMMNC）体外液体培养和各种造血相细胞集落培养技术,进行基质细胞支持条件下骨髓单个核细胞体外扩增的研究,并与单纯细胞因子支持下的细胞扩增进行比较。结果 在照射后细胞层存在的条件下,同时含有细胞因子组合的培养体系,对细胞总数和集落形成细胞数的扩增作用明显高于其它各组。结论 基质细胞对细胞因子作用下的造血细胞体外扩增有明显的促进作用。     

层流流体剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响

目的本实验系在考察层流剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响作用。方法从脐血中分离出CD34＋细胞,接种入实验室自制的层流剪切力实验装置中,在不同大小的层流流体剪切力（0.5,1,2,4dyn/cm2）加载下进行体外扩增培养。结果较小的层流剪切力（0.5,1dyn/cm2）可促进造血干/祖细胞扩增,有利于早期造血干/祖细胞的维持,并能促进更多的细胞由G0/G1期进入S期 较大的层流剪切力（2,4dyn/cm2）抑制了造血干/祖细胞的扩增,导致其迅速分化 并使S期细胞的比例减小。结论在生物反应器体外扩增培养脐血CD34＋细胞时,其层流流体剪切力应控制在1dyn/cm2范围内。     

定量PCR检测体外扩增脐带血造血干细胞HOXB4基因的表达

目的:通过检测HOXB4基因表达,评价体外扩增的脐带血干细胞(CBSC)自我更新的能力。方法:CBSC在含造血细胞因子(TPO SCF FL G鄄CSF)的无血清培养基体外扩增7天和14天,抽提细胞总RNA,采用定量PCR检测HOXB4基因的表达。结果:CBSC体外培养后,细胞总数可以增加近100倍,但HOXB4的表达较扩增前下降。培养7天HOXB4的水平为扩增前的18%,培养14天,HOXB4表达仅为扩增前的3%左右。结论:CBSC体外扩增细胞数量增加的同时,自我更新能力逐渐下降,甚至消失。     

细胞因子组合对小鼠骨髓单核细胞的体外扩增作用

目的　了解细胞因子组合对小鼠骨髓单个核细胞的体外扩增作用。方法　采用SCF、IL 3、IL 6、GM CSF、G CSF和EPO等 6种细胞因子组合在体外扩增培养小鼠骨髓单个核细胞 5d后 ,收集培养细胞作体外半固体培养计数各不同阶段祖细胞数 ,并计数细胞总数 ,与未经扩增培养的细胞作比较以判断其扩增情况。结果　有核细胞总数扩增不显著 ,为 (1 .3 60± 0 .1 2 6)倍 ,但造血祖细胞却获得了明显扩增 ,其中CFU E达培养扩增前的 (7.0 4± 1 .2 6)倍 ,BFU E为 (4 .74± 1 .0 4)倍 ,CFU GM和CFU Cs则分别为 (1 .78± 0 .47)和 (1 .74± 0 .48)倍。由此可见 ,在此培养体系中以红系祖细胞的扩增最为显著。结论　小鼠骨髓单个核细胞在单纯细胞因子存在的扩增体系中具有一定的扩增其细胞总数和集落形成祖细胞数的能力 ,为进一步作体内实验判断其造血重建的功能奠定了理论基础。     

不同条件下体外扩增造血细胞促造血恢复能力的比较

目的 比较研究不同条件下体外扩增的造血细胞回输体内后促进造血功能恢复作用的差异，方法 在小鼠骨髓单个核细胞液体培养体系中，分别加入几种细胞因子组合和／或基质细胞层存在的条件下进行体外扩增，然后将不同条件下扩增的细胞经尾静脉回输至经致死量照射的小鼠体内，动态观察小鼠的外周血象变化及其一般状况和生存率。结果 ①单纯细胞因子介导BMMNC体外扩增后并不能增进这些细胞促造血恢复的能力；②含有骨髓基质细胞底层的体外扩增，无论是否加入细胞因子，均有明显的促进移植受体造血功能迅速恢复的作用。结论 骨髓基质细胞支持下的造血细胞体外扩增可能有助于维持扩增后造血干／祖细胞造血重建的功能，值得深入研究和应用。     

细胞因子介导的体外扩增对脐血干/祖细胞粘附分子表达的影响

目的：比较脐血（CB）AC133^ 细胞扩增前后CD34^ 细胞亚群表面归巢相关粘附分子VLA－4（CD49d),VLA-5(CD49e),LFA-1(CD11a),L-selectin(CD62L)和PECAM－1（CD31）等的表达情况,以评价细胞因子介导的体外扩增对干／祖细胞（HSPC）归巢功能的影响。方法：将从新鲜CB标本中纯化的AC133^ 细胞接种于无血清基QBSF－60的无基质悬浮体系培养扩增14d,加入早期作用因子FL,SCF和TPO组合（FST）,并在接种0d时添加一剂IL－3,分别于培养0,7,10和14d检测扩增有和上述几种粘附分子的表达情况。结果：（1）在14d的培养扩增中,各阶段的HSPC均得到有效扩增,至14d时AC133^ 和CD34^ 细胞分别增加33．50和64．56倍;（2）表达上述粘附分子的各CD34^ 细胞亚群均有不同程度（约20－160倍）的扩增;（3）扩增后CD34^ 细胞表达的粘附分子CD11a,CD49e和CD49d的表达与原代CD34^ 细胞持平或上升,而CD62L和CD31的表达则有不同程度的下调。结论：我们建立的短期培养体系不仅可以支持CB HSPC的有效扩增,而且扩增后HSPC总体上保持原有的归巢相关粘附分子的表达。     

脐带血CD34+细胞体外诱导成为血管内皮细胞的观察

目的研究脐带血CD34^＋细胞在体外适宜的细胞因子作用下，不仅能够大量增殖分化为各系造血细胞，而且还可以向血管内皮细胞增殖分化的特性。方法采用CSF、FLT-3、TPO、IL-3、G-CSF细胞因子在无血清体系中进行不同的组合，分别在1、2周检测增殖后造血细胞的各项指标，同时用半固体培养研究造血细胞集落形成能力。2周后去除所有非贴壁细胞，更换含小牛血清和血管内皮细胞生长因子的培养基继续培养。分别于4、8周后收集液体培养和半固体培养后的贴壁细胞，检测细胞表面标志。结果CD34^＋细胞在适宜条件下，大量地向造血细胞及内皮细胞增殖分化，分别表达各系细胞分化抗原。结论脐带血CD34^＋细胞在体外可以被扩增、诱导分化为血管内皮细胞。