基因芯片可靠性分析及数据处理

基因芯片(gene chip)又称为DNA微阵列(DNA microarray),其基本原理是将众多的靶基因序列或寡聚核苷酸片段有序而高密度地排列在玻璃、硅、尼龙膜等固相载体上,用待检测的标记样本分子与之杂交,并利用激光共聚焦显微扫描等技术对芯片上成千上万的杂交信号进行实时、灵敏而准确的检测,辅以计算机统计分析从而得到样本的基因表达信息.     

采用集合转化的方法构建HIV-1蛋白酶区和反转录酶区T-A克隆载体

DNA重组技术是将两个或多个单独的DNA片段连接起来产生一个能在特定宿主中自主复制的DNA分子。重组DNA分子最简单的构建方法是将基因片段克隆到质粒或噬菌体等克隆载体上。常用的质粒载体有pBR322、pUC和pGEM等。这些载体含有不同的多克隆位点,适于将含有不同酶切位点的DNA片段连接起来[1]。     

DNA芯片技术及其临床应用

<正> DNA芯片(DNA chips)也称为DNA微阵列(DNA microar-rays)、基因芯片(gene chips)或高密度寡核苷酸微阵列(high-density oligonucleotide arrays),它是在一个固相支持物(如硅、玻璃或硝酸纤维膜、尼龙膜)的表面,排列了成千上万个已知基因的克隆,或包括了一个遗传因子及其全部可能突变的cDNA或寡核苷酸序列。这种高密度的DNA片段排列,可以在一个实验中检测上万个基因的表达,甚至可以提供一个有机体全部基因表达的鉴定。DNA芯片技术的发展和临床应用,宣布了一个疾病诊治的新时代的到来。     

遗传工程简介

<正> 遗传工程或基因工程,是在无细胞系统中,将不同的DNA片段(cDNA或基因DNA与载体DNA)连接成重组的DNA分子,然后将重组分子转入合适的宿主中,成为宿主基因组的一个整体份系或独立地在宿主细胞内进行复制。由此可知,遗传工程的核心是分子的无性繁殖。在自然界,遗传信息的交换一般只限于同种生物体之间。遗传工程技术的出现打破了遗传信息交换的壁障,能使不同种生物体之间甚至在高等生物与低等生物之间进行遗传信息的传递,因而可以按照人类的希望,在短期内定向地改变生物特性并创造新物种,以造福人类。基因工程是否可造成严重危害的争论曾     

富含GC的DNA片段对中国仓鼠卵巢细胞中转基因表达的影响及其位置效应

目的分析富含GC的DNA片段对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中转基因表达水平的影响及其位置效应。方法人工合成富含GC的DNA片段,将其克隆到表达载体的表达盒的5'、3'端及两端,构建在载体不同位置插入富含GC DNA片段的3个新表达载体(p IRES-G1、p IRES-G2和p IRES-G3),分别转染CHO细胞并用荧光显微镜进行观察;对照载体为p IRES-EGFP。采用G418筛选稳定细胞株,流式细胞术分析增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测其转基因拷贝数。结果成功构建了在载体不同位置含有GC DNA片段的3个载体,瞬时及稳定转染结果显示,在载体表达盒两端及3'端插入富含GC DNA片段能够明显提高EGFP在CHO细胞中的表达水平。与对照载体比较,稳定表达情况下载体表达盒两端及3'端插入富含GC DNA能分别提高转基因表达水平约1.39、1.32倍,而在5'端插入富含GC DNA片断对于提高基因表达水平作用尚不明显。表达盒两端及3'端插入富含GC DNA片段的转基因拷贝数比对照载体提高了约1.32、1.24倍。结论富含GC的DNA片段在CHO细胞提高转基因表达与其在载体上的位置有关,在载体表达盒两端或3'端插入一段富含GC的DNA片段可以提高转基因表达水平。     

信号肽-FRET荧光蛋白载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的构建带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白(pECFP-C1-SP)和增强型黄色荧光蛋白(pEYFP-C1-SP)的质粒载体,为使用荧光共振能量转移(FRET)技术研究LPS在细胞膜上的受体识别机制提供依据。方法采用点突变技术构建了带TLR4信号肽的载体,用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞,观察带信号肽载体和融合蛋白载体在细胞内的表达。结果DNA测序证明所构建的带TLR4信号肽的载体正确;酶切和DNA测序表明融合蛋白载体的构建正确,TLR4信号肽可以使蛋白主要表达在膜上。结论所构建的带信号肽的荧光蛋白载体是正确的,pECFP-C1-SP和pEYFP-C1-SP能够表达在细胞膜上,可有效地应用于膜蛋白相互作用的研究。     

不同载体及靶基因对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫效果的影响

目的　探讨不同DNA载体及靶基因对DNA疫苗免疫效果的影响.方法　用已构建的不同载体HBVS基因疫苗(pCR3.1-S,pcDNA3-S)和HBVC基因疫苗(pCR3.1-C)分别给BALB/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫1次,用ELISA法及MTT法分别检测小鼠血清抗-HBs及HBc及脾细胞对HBsAg或HBcAg的特异性增殖反应.结果　免疫接种2wk后小鼠血清抗-HBc抗体均明显高于对照组,载体pCR3.1的表达效力稍高于pcDNA3,但同一基因不同载体间无显著差异.不同靶基因血清抗体滴度及脾细胞对HBsAg或HBcAg的刺激指数均明显高于对照组,刺激指数pCR3.1-C组明显高于…     

基因芯片技术在脑创伤研究中的应用

基因芯片(gene chip)是将大量的靶基因片段用点样仪有序地、高密度地(点与点之间的距离一般＜500μm)固定在玻璃、硅等固相载体上的一项技术.它将待测样品用荧光染料标记成探针与芯片杂交,杂交后的信号用激光扫描仪检测,计算机分析检测结果,可获得类似于传统的点杂交的分子杂交数据,比较各组织间靶基因表达谱的差异,以达到快速、高效、高通量及平行性地分析生物信息的目的.     

组织芯片技术

组织芯片 (tissuechip)又称组织微阵列 (tissuemicroarray) ,是将数十个、数百个乃至上千个小的组织片按预先设计的需要整齐地排放在某一载体上(通常是载玻片 )而排列成矩阵的微缩组织切片[1] 。1986年Battifora首先创立了组织芯片的雏形。 90年代初 ,由美国Fodor博士提出并开始生物芯片技术的研究。至今生物芯片技术在医学各个领域中已显示出其巨大的发展潜力并取得了一定成功 ,其技术原理就是将少量组织高密度固定于固相载体上之后 ,用不同的基因探针或抗体与之杂交 ,以分析目的基因在相关的组织中表达的差异性。根据芯片上固定的生物物…     

微环载体与基因治疗

基因治疗是将有治疗作用或正常基因的DNA序列导入靶细胞,通过纠正基因缺陷或发挥治疗作用而达到治疗疾病的目的。基因治疗的关键技术之一是研发用于真核细胞转移基因的安全有效的载体系统。病毒和非病毒载体系统均有各自的优势和缺点。微环载体是一种来源于质粒DNA的新型的较小的超螺旋表达元件,通过在大肠杆菌体内发生位点特异性结合而产生,并已应用于基因治疗。由于微环载体缺乏原核DNA骨架序列,如抗生素基因、原核复制起始点等,可提高治疗基因表达水平、基因治疗的安全性及降低炎症反应。本文就微环载体的产生、提高转基因表达的机制及在基因治疗中的应用作一综述。     

信号肽-FRET荧光蛋白载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的 构建带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白(pECFP-C1-SP)和增强型黄色荧光蛋白(pEYFP-C1-SP)的质粒载体，为使用荧光共振能量转移(FRET)技术研究LPS在细胞膜上的受体识别机制提供依据。方法 采用点突变技术构建了带TLR4信号肽的载体，用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞，观察带信号肽载体和融合蛋白载体在细胞内的表达。结果 DNA测序证明所构建的带TLR4信号肽的载体正确；酶切和DNA测序表明融合蛋白载体的构建正确，TLR4信号肽可以使蛋白主要表达在膜上。结论 所构建的带信号肽的荧光蛋白载体是正确的，pECFP-C1-SP和pEYFP-C1-SP能够表达在细胞膜上，可有效地应用于膜蛋白相互作用的研究。     

浅谈原核基因工程细胞内不溶性表达产物的下游处理

基因工程或基因重组技术,是将不同生物的基因在体外人工剪切,组合并和载体(质粒、噬菌体、病毒)DNA连接,然后转入微生物或细胞内进行扩增,并使转入的基因在细胞内表达,产生所需要的蛋白质.     

基因芯片与卫生微生物检验

基因芯片又称DNA微阵列，是采用原位合成或显微点样技术，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面，有序地集成一系列可寻址识别的基因片段，与标记的样品进行杂交后，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速检验或医学诊断，它具有高通量、可并行检测的特点。根据载体上核酸分子的不同，分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片等。它在临床微生物检测中的应用为其在卫生微生物检验中的应用奠定了良好的基础。     

偶氮苯聚合物膜的光致高密度存储及其三维微结构的研究

设计、合成及表征了一种偶氮苯聚合物(PGMAA-20)。研究了该偶氮苯聚合物薄膜中的高密度光学存储和三维微结构，并成功地将20套光栅储存在样品中同一个点上，储存密度是已报道的两倍；用简单的2波混频光路在该材料中刻写出长方格子和六角星型的微结构，在制作多重不同周期不同角度的高密度光栅结构的实验过程中，观察到不同周期光栅的刻写顺序对整个微结构形成的最终结果具有决定性的影响。     

应用穿梭质粒建立哺乳动物细胞诱变检测系统的实验研究

用基于EB病毒的穿梭质粒载体pMCi5转染小鼠3T3细胞,建立一种能在DNA水平上检测化学物对哺乳动物细胞诱变作用及其机理的快速实验系统。该质粒带有诱变作用靶基因LacI,用甲基磺酸乙酯(EMS)作诱变剂进行的实验结果表明,该系统的自发突变率小于1.21×10~(-4),而EMS(300μg/ml)的诱发突变率为3.8×10~(-3)。7个突变子经EcoRI酶切证明,质粒上无大片段插入或缺失,6个EcoRI位点上没有点突变。     

转染野生型DNA聚合酶β对交链孢霉酚致突变作用的影响

目的:观察转染野生型DNA聚合酶β(polymerase beta,polβ)对交链孢霉酚(alternariol,AOH)致突变作用的影响.方法:用pEGFP-C3(空载体)、pEGFP-C3-polβ(野生型polβ重组表达载体)质粒转染NIH3T3细胞;转染后的细胞分别用1.5 μmol/L、2.0 μmol/L和2.5 μmol/L 3种浓度的AOH诱导48 h,RT-PCR扩增DNA polβ基因,克隆至pEGM-T载体后,转化大肠杆菌JM109,筛选鉴定,进行测序分析.结果:转染pEGFP-C3的NIH3T3细胞DNA polβ基因突变点个数随AOH浓度升高而增多,而转染pEGFP-C3-polβ的NIH3T3细胞DNA polβ基因在1.5 μmol/L和2.0 μmol/L浓度诱导下未见突变发生,当AOH浓度增大到2.5 μmol/L才出现DNA polβ基因突变.结论:高表达野生型DNA polβ能够在一定程度上抵抗霉菌毒素的致突变作用.     

利用PCR产物快速构建兔HPRT 基因无启动子打靶载体

目的 探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法,为下一步获得兔 HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础.方法 首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12.5 kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-rHPRT质粒.然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒,通过PCR的方法获得两个不同的带有50 bp HPRT 基因同源序列的IRES-eGFPCre-Frt/Neo/Frt同源重组片段,最终构建 HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.结果 PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,表明载体构建成功.结论 成功快速地构建了HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究.     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

肝脏局灶性结节增生的螺旋CT表现

目的 探讨肝脏局灶性结节增生(FNH)的螺旋CT表现,提高FNH的诊断符合率.方法 经手术病理证实的FNH 18例(24个病灶)的影像资料.结果 4/4个病灶CT平扫呈等或略低密度影;92%病灶在CT增强扫描动脉期为均匀高密度或明显高密度;96%病灶在门静脉期表现为高密度或略高密度;38%病灶在延迟后平衡期扫描表现为高密度或略高密度,52%为等密度;50%病灶内有纤维分隔或瘢痕.结论 平扫和动态增强螺旋CT能较全面显示FNH的病理特征和血供特点,明显地提高与其它富血管恶性肿瘤的鉴别诊断能力.     

壳聚糖修饰的纳米羟基磷灰石基因结合性研究

目的评估用壳聚糖修饰的纳米羟基磷灰石(HA)基因载体结合和保护DNA的性能。方法 HA纳米颗粒胶体液中加入壳聚糖弱酸溶液,以修饰HA纳米颗粒;透射电镜下观察壳聚糖修饰后HA纳米颗粒的形貌及粒径;在不同pH值环境下(5、6、7、8和9)测定修饰前后的HA纳米颗粒的Zeta电位;采用离心后测上清DNA浓度检测未修饰的HA纳米颗粒和经壳聚糖修饰后的HA纳米颗粒结合DNA的能力及壳聚糖-HA纳米颗粒与DNA解离的方式;应用DNA抗核酸酶保护实验测定修饰后的HA纳米颗粒保护DNA的能力。结果透射电镜观察经壳聚糖修饰的HA纳米颗粒周围有长梭状的壳聚糖颗粒包绕,粒径较均匀,约为50 nm,分散性较好;经过壳聚糖修饰的HA纳米颗粒较未修饰的HA纳米颗粒的Zeta电位显著升高(P<0.05)。血清、磷酸缓冲液(PBS)可以使结合到壳聚糖-HA纳米上的DNA解离。DNA结合及抗核酸酶保护实验显示,修饰后的HA纳米和DNA质量比达500∶1时,可更有效结合并保护DNA。结论经过壳聚糖修饰的HA基因载体分散性更好,Zeta电位显著提高,更有效地结合和保护DNA。