兔角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察

目的 探讨兔角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法 采用消化培养法，分2组培养，1组为消化并过滤后的角膜缘干细胞培养组，另1组为消化后未过滤的带组织块培养组，均用含20％胎牛血清的培养液培养，待细胞长成良好单层后消化传代，分别观察记录细胞在原代和传代培养时的生长特性并行HE染色观察。结果 过滤组角膜缘干细胞在培养24h后开始贴壁生长，7～10d形成良好单层，细胞以圆形或椭圆形为主，核较大，呈原始细胞特征，传代培养时见细胞体积逐渐增大，核变小，成纤维细胞少见；带组织块培养组原代培养时与过滤组无明显差异，传代时则见成纤维细胞渐增多，至第3代时占主导并抑制了角膜缘干细胞的生长。结论 采用消化培养法可成功培养出兔角膜缘干细胞，培养时应滤除组织块以减少成纤维细胞的影响。     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进

目的 改进SD大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)原代培养方法,以获得纯化的大鼠PMVECs。方法 对组织块法培养PMVECs过程中的组织取材、植块贴壁、培养基配制、传代培养进行改进包括:在麻醉前提前注射肝素钠;利用腹腔放血,待大鼠停止呼吸后剪开胸腔;改进操作以及试剂中加入双抗以降低污染率;原代培养48 h即取出组织块;进行再次消化去除成纤维细胞;异硫氰酸标记的植物凝集素（FITC-BSI）鉴定培养的PMVECs。培养后在倒置显微镜下观察细胞形态。结果 原代培养的细胞呈现为多角形或短梭形,呈单层铺路石样排列的典型结构。随着细胞传代或培养条件的改变,细胞形态发生变化,可呈长梭形,漩涡状排列。FITC-BSI结合实验呈绿色荧光,阳性率达到90%以上。结论 通过改进分离及培养方法可获得生长状态良好、纯度高且能够稳定传代培养的PMVECs。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞

目的建立用酶消化组织块培养兔牙周膜细胞的方法,为下一步的研究做好基础。方法取成年新西兰大白兔牙周膜组织,通过酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞。取第4代免牙周膜细胞,免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源。结果酶消化组织块法成功培养出兔牙周膜细胞,细胞形态呈梭形。免疫细胞化学鉴定波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,说明细胞为中胚层来源的牙周膜成纤维细胞。结论酶组织消化块法可以很好地进行兔牙周膜细胞体外培养,且此方法简单易行。     

兔声带成纤维细胞的体外分离培养、鉴定与标记

目的探讨体外培养兔声带成纤维细胞（Vocal Fold Fibroblasts,VFFs）的培养及标记方法。方法消化培养法分离、培养兔声带成纤维细胞,倒置显微镜观察其生长和形态特征,并传代、鉴定。增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体（Ad-EGFP）标记体外培养的VFFs,取12只新西兰兔,以1×100万/0.1ml分别注入损伤模型左侧声带,观察注入VFFs的生长情况。结果兔声带成纤维细胞可以在体外原代和传代培养,具有成纤维细胞的典型形态。波形蛋白免疫荧光染色阳性,Ad-EFGP可以成功转染VFFs。将VFFs诸如声带后15d,组织学切片未发现成活细胞。结论用消化培养法可成功获得VFFs,Ad-EGFP是一种理想的示踪标记物。     

兔软骨细胞的分离与培养

目的 探讨免软骨细胞培养方法。方法采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。结果软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右，传代培养约4～5天，细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖，异染反应主要集中在细胞集落样生长区，异染程度以原代培养最为显。结论采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。     

深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养方法。方法 将2mm宽的兔角巩膜组织通过程序降温仪降温后置于-196℃液氮中深低温保存。1年后复温，应用消化培养法分别对冻存及新鲜的兔角膜缘干细胞进行体外培养，观察并记录细胞生长情况，HE染色观察培养细胞的形态特征。结果 经过深低温保存的兔角膜缘干细胞可以在体外被成功培养并传代，其在原代培养48h后开始贴壁生长，5d后生长较旺盛，但可见部分破裂和死亡细胞，约12d基本形成单层；传代培养时次日贴壁，7d形成单层。新鲜兔角膜缘干细胞原代培养时细胞形态相似，但破碎死亡细胞少见，且于7d左右即基本形成单层，传代时两者无明显差别。结论 深低温保存的角膜缘干细胞能被成功地进行体外培养，培养后细胞具有与培养的新鲜角膜缘干细胞基本相似的特性，为深低温保存的角膜缘干细胞培养后移植治疗临床眼表疾病提供了实验依据，并为眼库技术的发挥开辟了新的应用途径。     

口腔黏膜上皮细胞体外培养的研究

目的 建立一种新的口腔黏膜上皮细胞体外培养模型。方法 结合组织块法和酶消化法，先用分离酶消化获取单纯的口腔黏膜上皮组织，再将组织块种植于培养皿，经原代培养和传代培养，光镜观察培养细胞。酶消化后组织块行既染色，观察分离酶作用部位。培养细胞行抗角蛋白抗体免疫组化染色。结果 分离酶作用于基底膜。可以完整地将上皮细胞与固有层分离，细胞培养过程中未见成纤维细胞生长，抗角蛋白抗体染色阳性。结论 该培养方法可获取纯净的人口腔黏膜上皮细胞，建立符合临床研究所需要的口腔黏膜上皮细胞体外培养模型。     

全牙酶消化法原代培养人牙周膜成纤维细胞及鉴定

目的 探讨一种快速简便、原代培养成功率高、可重复性高的人牙周膜成纤维细胞培养方法。方法将处理后的牙齿整个用酶进行消化,原代培养人牙周膜成纤维细胞,对培养出的细胞进行形态学观察,免疫组化方法鉴定其来源,通过生长曲线研究其生物学特性。结果 8~14 d内可获得实验用成纤维细胞,原代培养成功率为90%,细胞形态呈长梭形。波形丝蛋白染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性。结论采用全牙酶消化法可以快速、成功地培养出人牙周膜成纤维细胞,且简单易行,可重复性高。     

兔眼角膜、结膜成纤维细胞的培养

目的 建立眼角膜、结膜细胞体外培养的方法。方法 采用组织块培养法培养兔眼角膜基质及结膜成纤维细胞。结果 结膜成纤维细胞在培养10天以后可以形成单层细胞。眼角膜成纤维细胞在培养瓶中培养2周后可形成单层；24孔板培养3d后细胞贴壁生长旺盛，10d形成单层。结论 眼角膜、结膜成纤维细胞组织块培养法是可行的，但在24孔培养板上眼角膜成纤维细胞比在培养瓶中贴壁快而且容易生长。     

兔软骨细胞的高密度培养及生物学特征

目的观察高密度培养软骨细胞生物学性状的变化，为软骨组织工程建立合适的体外培养方法。方法用酶消化法分离兔关节软骨细胞，高密度单层培养并传代，HE染色、蕃红-O染色观察软骨细胞形态和分泌功能，RT—PCR及免疫组化法观察细胞生物学特征变化。结果高密度培养时，软骨细胞去分化速度减缓，传5代细胞表型保持良好。结论高密度培养利于维持软骨细胞生物学特征，原代细胞高密度培养和传代培养后高密度培养是较好的获取大量优良软骨细胞的培养方式。     

兔眼结膜上皮细胞和成纤维细胞的培养及冻存

目的 探讨体外培养兔眼结膜上皮细胞和成纤维细胞的最佳方法,为进一步研究结膜的生物学特性和结膜重建提供基础。 方法 分别用组织块法培养结膜上皮细胞和混合消化法培养结膜基质细胞,用倒置显微镜观察其生长方式和形态特征;收集第2代细胞,-80℃冻存。结果 兔眼结膜上皮细胞和上皮下成纤维细胞可以在体外成功培养,结膜上皮细胞呈圆形或多角形,成纤维细胞呈长梭形;冻存细胞1个月后复苏成功率达80%。结论 组织块法和混合消化法培养可成功获得结膜上皮细胞和上皮下成纤维细胞。     

Cbfal基因转移对原代培养的兔皮肤成纤维细胞的影响

目的 探讨核心结合因子al（core binding factor al，Cbfal）基因转移对原代培养免皮肤成纤维细胞的影响作用。方法 胰酶消化法培养兔皮肤成纤维细胞，兔采用脂质体转染技术转染原代培养的兔皮肤成纤维细胞，RT—PCR检测成骨标志基因Ⅰ型胶原（Ⅰ collagen）、骨钙素（osteoclcin，OCN）、骨唾液蛋白（bone sialoprotein，Bsp）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Cbfal的表达。结果 兔皮肤成纤维细胞在Cbfal基因转染后出现OCN、Bsp、ALP的表达，Ⅰ Collagen表达增强。结论Cbfal基因转移兔皮肤成纤维细胞可改变原代培养的兔皮肤成纤维细胞的表型，向成骨表型转化。     

人牙周膜成纤维细胞的体外培养

目的：建立人牙周膜成纤维细胞体外培养的方法。方法：采用组织块贴附法原代培养人牙周膜成纤维细胞并传代。结果：牙周膜成纤维细胞体外培养成功率为20％。5代后细胞生长旺盛。经免疫组织化学SABC法证实为来源于中胚层的成纤维细胞。结论：采用组织块贴附法培养原代人牙周膜成纤维细胞。胰酶消化传代后，生长状况良好，可作为人牙周膜成纤维细胞的实验模型。     

异体表皮细胞和成纤维细胞库的建立

目的 寻找表皮细胞和成纤维细胞体外培养、鉴定、冻存与复苏的可行方法.方法 酶消化法分离表皮细胞和成纤维细胞,分别进行原代、传代培养,并对细胞进行冻存与复苏.表皮细胞进行广谱角蛋白-异硫氰酸荧光素(PAN-FITC)免疫荧光染色,成纤维细胞行波形蛋白-FITC免疫荧光染色.结果 表皮细胞呈克降样增长,以后细胞逐渐互相融合.PAN-FITC染色均为阳性.成纤维细胞的体外生长活力强,波形蛋白-FITC染色呈阳性.结论 酶消化法是表皮细胞和成纤维细胞体外培养的重要方法,本实验为构建组织工程皮肤奠定了基础.     

小鼠中脑神经干细胞体外培养方法的研究

目的改进小鼠中脑神经干细胞(NSCs)分离培养方法。方法分别采用机械法和酶消化法分离出生1～3d的小鼠中脑组织,在含体积分数为2%B27及20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养。采用巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、及神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色方法鉴定NSCs和分化细胞。结果在含bFGF及B27的DMEM/F12培养基中,可形成悬浮生长Nestin呈阳性的神经球。诱导分化的细胞可见GFAP或NSE免疫反应阳性细胞。机械法较酶消化法可获得较多的NSCs。结论在DMEM/F12培养基中添加2%B27及20ng/mL的bFGF可成功获得中脑NSCs,机械法为一种简便而有效的NSCs分离方法。     

一种改良宫颈癌相关成纤维细胞原代培养方法的建立

目的:通过对比并改良常见的原代(CAFs)细胞培养方法,建立一种成功率较高的宫颈癌相关成纤维细胞(CAFs)原代培养的方法。方法:取确诊为宫颈癌患者的活检或手术标本,通过对消化时间、重悬液量及培养基血清浓度进行改良原代细胞培养,观察细胞生长状况,并比较其与传统组织块贴壁法和酶消化法的细胞生长率。运用时间差酶消化及反复贴壁法进行分离纯化后,用免疫荧光的方法对宫颈癌相关成纤维细胞的纯度进行鉴定。结果:改良培养法消化时间为30min,血清浓度为20%时成功率最高(66.67%)。反复运用时间差酶消化及反复贴壁法可以得出纯度较高的宫颈癌相关成纤维细胞。结论:本研究成功建立了一种成功率较高的宫颈癌相关成纤维细胞改良培养方法,为后期探讨CAFs在肿瘤形成、进展中的作用打好实验基础。     

优化贴壁法人皮肤成纤维细胞的原代培养

目的:优化贴壁法原代培养人皮肤成纤维细胞的条件,建立稳定?经济?高效可行的人皮肤成纤维细胞培养方法?方法:采用包皮环切术后皮肤组织,剪成均匀组织块后贴壁,皮肤边缘长出薄层致密细胞团后胰酶消化?传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及细胞免疫荧光鉴定?此方法与酶消化法相对照?结果:优化贴壁法成功率100%,取得组织后2 d沿皮肤边缘均开始生长高密度类圆形细胞层,在1周内可获得高质量?高数量的细胞,传代贴壁后经镜下形态观察及细胞免疫荧光染色确定为皮肤成纤维细胞?结论:较之酶消化法,优化贴壁法细胞存活率高,活性及纯度好?该方法可稳定?经济地获得足够数量的细胞?     

大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞的培养方法初探

目的：建立大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞组织贴块法培养模型。方法：分离大鼠胸主动脉外膜,切成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块,均匀贴于细胞培养瓶壁上,加入含20%血清的细胞培养液DMEM,置入细胞培养箱于37℃,5%CO2条件下传代培养。结果：第3～4 d,少量细胞从组织块周边游出,第6～8 d后,细胞围绕组织块生长至亚融合状态,0.25%胰酶消化后传代,可得到较纯成纤维细胞。结论：利用组织贴块法培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞存活率高,操作简单,结果稳定,在血管重塑、血管纤维化、细胞凋亡、细胞表型转变等研究领域具有应用价值。     

兔角膜基质细胞的体外培养及生物学特性

目的 改进兔角膜基质细胞培养技术，观察其生物学特性。方法 先同时消化角膜上皮及内皮层，然后刮去上皮，内皮，前弹力和后弹力层，接着将剩余的基质层剪碎消化，接种，采用MTT法观察细胞生长情况，并对比有，无血清培养基对细胞生长的影响。结果 角膜基质细胞10d后形成细胞单层，增殖旺盛，有血清培养基培养到第8天左右达到生长高峰，无血清培养基培养的细胞生长较慢，第9天左右达到生长高峰，结论 改进的角膜细胞培养技术简便，成功率高，培养出的角膜基质细胞生长良好，血清对角膜基质细胞生长有一定的影响。