引物特异性HCV基因分型检测方法的建立及应用

[目的]建立引物特异性HCVRNA基因分型的方法，并应用于临床诊断。[方法]采用型特异性引物建立单管逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和双管引物特异性套式聚合酶链反应（NEST-PCR）检测技术，1b和3a一管内扩增，1a、2a和2b一管内扩增，分别对147例HCV抗体阳性的标本，设计HCV的C区特异性引物，采用Trizol浓缩RNA进行双管巢式PCR分型。[结果]统计结果表明我国丙型肝炎流行主要以1b（Ⅱ）和2a（Ⅲ）2种基因型为主，但有部分1a、2b、3a的HCV感染者检出，其中1a为1．36％（2／147），1b为65．99％（97／147），2a为6．12％（9／147），3a为1．36％（2／147），1b／2a型混合占22．45％（33／147），1a／2b混合型为0．68％（1／147），未分出型或其它型者分别为2．04％（3／147）。[结论]本文建立的方法具有良好的特异性和敏感性，可同时区分5种HCV基因型，我国北方地区发现有1a和3a基因型感染病例。     

逆转录－套式PCR检测血清中丙肝病毒RNA

利用与丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组５＇非编码区保守序列同源的套式引物，建立了检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，由于在引物设计中选择了最保守的区域且避开了与黄病毒属的同源序列，保证了ＰＣＲ检测的灵敏度和特异性。经逆转录和两轮ＰＣＲ扩增，可检出１×１０－３ｕｌ血清中的ＨＣＶＲＮＡ。研究了影响ＨＣＶＲＮＡＰＣＲ检测的各种因素，并对ＲＮＡ分离及ＲＴ－ＰＣＲ反应体系进行了优化，在此基础上研制了ＨＣＶ的ＰＣＲ检测试剂盒。     

逆转录套式聚合酶链反应检测呼吸道合胞病毒

建立一种敏感、特异和快速诊断人呼吸道合胞病毒感染的方法。选择ＲＳＶ基因组中高度保守的Ｆ基因作为扩增靶序列，独立设计合成了两引物，建立了一个完整的逆转录套式聚合酶链反应检测ＲＳＶＲＮＡ的方法。对引物进行特异性实验，证明其具有高度特异性。     

多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用

目的：建立与应用多种探针的 RT-PCR分析 H5N1病原体的检测方法体系。方法通过 GenBank发表的基因序列分析，针对保守区分别设计并合成2对特异性引物（P1/P2，P3/P4）。通过对扩增条件的优化，建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法。结果合适引物浓度：P1/P2为0.32μmol/L，P3/P4为0.96μmol/L。双重检测的最小病毒核酸量为2 ng/μl，H5N1病原体混合液在相对应位置出现特异性条带，而其他病毒及空白对照均未出现条带。结论多种探针的RT-PCR分析对于 H5N1病原体检测方法在合理引物浓度的应用下具有很好的敏感度与特异度，值得在检验中推广应用。     

单管-套式/多重聚合酶链反应在间日疟原虫基因型鉴定中的价值

目的对单管-套式多重聚合酶链反应(PCR)鉴定间日疟原虫基因型方法的应用价值进行研究。方法以间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因为模型，综合套式多重PCR、等位特异PCR和标签引物扩增等技术，使用Primer Premier5．0软件和NCBI的BLAST网络改进与优化引物设计，并用矩阵试验法优化反应条件和程序，同时，用单管-套式多重PCR和套式PCR对71份间日疟患者血标本的间日疟原虫基因型鉴定结果作比较。结果单管-套式多重PCR可同时扩增出3种不同长度的基因型/族特异片段，且基本消除了二聚体等噪音。用单管-套式多重PCR鉴定检测71份间日疟患者血标本，62份与套式PCR鉴定结果一致，并新发现6份不同基因型和PV-Ⅱ型的混合感染；还将2份套式PCR鉴定为热带族的血标本纠正为PV-Ⅱ型，1份阴性血样鉴定为温带族。结论研究建立的单管-套式/多重PCR鉴定间日疟原虫基因型的方法，简化了试验步骤，节省了试剂耗材，消除了PCR噪音，提高了检出间日疟原虫混合感染和低度感染的敏感性；是一种具有发展潜力的检测单核苷酸多态性和基因型鉴定的方法。     

多重RT—PCR技术检测儿童呼吸道标本中的常见病毒

目的 建立多重RT-PCR技术检测儿科呼吸道标本中常见病毒的方法.方法 参照病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物,并检索NCBI数据库初步验证其特异性,以实验室阳性株验证引物特异性,优化多重RT-PCR反应条件.并对2008年61份儿童呼吸道标本进行检测,阳性片段测序验证扩增片段特异性.结果 采用多重RT-PCR引物对流感病毒A型(IVA)、流感病毒B型(IVB)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒3型(PIV3)、呼吸道合胞病毒(RSV)和鼻病毒(RHV)等6种病毒进行扩增,均无非特异性扩增条带,分别获得171,489,307,585,155,501 bp片段,与设计相符;对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果,61份儿童呼吸道标本多重RT-PCR扩增,阳性率为50.82%(31/61),核酸序列与经NCBI数据库Blast比对同源性高.结论 实验证明,所建立的多重RT-PCR技术检测儿童呼吸道标本中常见病毒的方法,敏感度、特异度和可重复性均较好,为常见呼吸道病毒检测提供了一种方便易行的方法.     

套式聚合酶链式反应诊断三日疟原虫感染的临床应用

目的应用套式聚合酶链式反应(PCR)扩增小亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)基因诊断三日疟原虫感染,以减少三日疟的漏诊和误诊。 方法分别提取可疑三日疟患者抗凝血DNA和对照间日疟、恶性疟患者抗凝血DNA,以此为模板,用疟原虫属特异性引物进行第一轮扩增;然后以第一轮扩增产物为模板,用4种疟疾的种特异性引物进行第二轮扩增,比较扩增出的18 SSU rRNA基因片段的大小,并对目的片段进行测序鉴定。 结果经属特异性引物PCR扩增后,3个样本均出现大小约为1200bp的条带。经种特异性引物PCR扩增后,间日疟及恶性疟确诊样本均扩增出相应的120bp和205bp特异性条带;可疑患者样本仅在用三日疟原虫种特异性作引物时扩增出144bp特异条带,与理论值相符,与Genbank标准序列对比显示,扩增片段大小及测序结果均完全正确。证实患者感染三日疟原虫。 结论利用小亚单位核糖体核糖核酸基因片段三日疟种特异引物进行扩增可以用于诊断三日疟原虫感染。     

Koutango病毒TaqMan反转录聚合酶链式反应方法的建立

目的建立Koutango病毒(KOUTV)的实时荧光定量TaqMan反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法。方法从GenBank中下载KOUTV基因序列,进行多序列比对分析,针对NS5基因中的高保守序列片段设计KOUTV的特异引物与探针,用4科9种病毒进行检测方法特异性验证,通过平行重复实验验证检测方法稳定性,利用体外转录的RNA标准品建立了KOUTV的NS5基因拷贝数的绝对定量分析模型。结果引物与探针工作特异性良好,同一样品重复检测循环阈值(Ct)的变异系数均小于1.5%,定量分析模型灵敏度达到1.0×10^2拷贝/反应。通过本研究建立的快速检测方法对新疆采集的112批,6328只蚊虫进行了测定,结果均为阴性。结论成功建立了KOUTV的高特异性、高敏感性的TaqMan RT-PCR检测方法,可应用于实验室和临床诊断。     

人偏肺病毒基因型双重逆转录PCR检测方法的建立

目的 建立一种鉴别不同基因型hMPV的RT-PCR方法.方法 根据不同基因型的hMPV G蛋白基因序列设计合成A、B基因型的特异性引物,在一次双重PCR反应中根据扩增产物大小鉴别不同基因型.用该方法鉴别37份hMPV阳性的临床标本的基因型.结果 用hMPV G蛋白编码基因的分型引物进行PCR反应,对已知的hMPV阳性标本直接进行分型得到的扩增产物大小易于区分;对常见的呼吸道病毒无非特异扩增,显示引物特异性良好.对37份临床标本进行基因分型结果显示,20份A基因型分型结果与M基因测序分型结果一致,17份经M基因测序分型为B基因型的阳性标本中有14份与M基因测序分型结果一致,3份未得到扩增产物从而不能分型,总符合率为91.9%[(20+14)/37].结论 成功建立了一种可以鉴别不同基因型的hMPV的RT-PCR方法.     

逆转录聚合酶螺旋反应快速检测蜱传脑炎病毒方法的建立及初步评价

目的 建立一种等温条件下蜱传脑炎病毒(TBEV)的现场快速检测的方法。方法 针对TBEV NS1基因设计一对特异性螺旋引物,在等温条件下建立逆转录聚合酶螺旋反应(RT-PSR)检测方法,优化反应条件,对特异性和灵敏性进行分析,应用全血模拟标本评价RT-PSR检测的符合率。结果 成功建立并优化了TBEV的RT-PSR检测方法,RT-PSR法在61℃的温度下只需一种酶可一步实现逆转录和扩增,55 min可完成TBEV的检测,并可通过SYBR GreenⅠ直接肉眼判读结果,该方法特异性强,灵敏性高,最低检测限为107.341×10^-6 ng/μL,是PCR的100倍。全血模拟标本符合率为100%,灵敏性比RNA标准品低10倍。结论 RT-PSR方法具有良好的特异性和灵敏性,可用于基层对TBEV的现场快速检测。     

登革病毒TaqManMGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床。方法根据1～4型登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列,设计一套型通用的引物和TaqManMGB探针,以4个血清型登革病毒标准株为标准,以日本乙脑病毒和丙肝病毒作阴性对照,以包含登革病毒2型标准株（DENV-2NGC株）3’非编码区349bD片段的质粒DNA作标准品,对引物和TaqManMGB探针的特异性、灵敏度进行分析,从而建立登革病毒实时荧光定量PCR检测方法。用该法对登革病毒野毒株和10份登革病毒患者血清进行检测。结果TaqMan实时荧光定量PCR检测的1～4型登革病毒标准株及野毒株均为阳性,日本乙脑病毒和丙肝病毒均为阴性;检测灵敏度可达到每反应2个基因拷贝;检测的10份登革患者血清样本中,8份检测结果为阳性。结论TaqManMGB实时荧光定量PCR方法是一个快速、特异性强、敏感性高的检测登革病毒的方法,适用于登革病毒的临床早期诊断。     

TaqMan实时定量RT—PCR与常规RT—PCR检测登革病毒的比较

目的:比较TaqMan实时定量逆转录-聚合酶链反应(real-timeRT-PCR)法与常规逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测登革病毒的敏感性、特异性和时效性。方法:建立TaqMan实时定量RT-PCR方法和常规RT-PCR方法,分别对登革病毒、乙型脑炎病毒及西尼罗病毒进行检测,并比较两法的特异性、敏感性和时效性。结果:两种方法都能检测出登革病毒,而对乙型脑炎病毒和西尼罗病毒的检测呈阴性;常规RT-PCR的敏感性为0.1TCID50/mL,TaqMan实时定量RT-PCR的敏感性提高了100倍,达到了0.001TCID50/mL,且至少节约了2h。结论:与常规RT-PCR比较,TaqMan实时定量RT-PCR更适用于登革病毒的实验室快速诊断。     

乙型脑炎和登革热病毒的环介导等温扩增基因定量检测技术研究

目的建立一种适合口岸现场快速检测乙型脑炎和登革热病毒的环介导等温扩增(LAMP)定量技术。方法根据LAMP方法的原理,设计LAMP检测引物和反应体系,建立LAMP检测方法,同时综合评估初始拷贝数值与方法中的灵敏度、特异度、重复性及荧光信号值反应时间(1×104)之间的线性关联。结果检测选用1套LAMP引物,完成时间为0.5h,传统PCR检测与LAMP对比,差异明显,LAMP检测可有效提高灵敏度,是PCR检测技术的10倍。循环阈值和模版浓度具有良好的线性联系,实验室变异系数为小于5%。结论该方法是特异度与灵敏度较高,操作简单、结果判断容易、设备要求低的快速检测方法,适合基层医疗卫生机构和现场查验机构的广泛应用。     

用多重PCR快速检测登革病毒并分型

目的　建立一种多重聚合酶链反应 (PCR)方法 ,对不同型别登革病毒进行快速检测及分型。方法　采用 4种型别登革病毒通用的外侧引物进行逆转录PCR(RT PCR)反应 ,继用 4对 (5种 )型特异引物在单管内进行巢式PCR ,依据扩增产物的片段大小进行分型。结果　采用多重PCR ,扩增出 4 82、119、2 90及 392bp的特异片段 ,分别代表登革病毒 1～ 4型。结论　该方法快速、敏感、特异 ,有一定的推广应用价值。     

实时荧光PCR技术检测登革病毒的研究

目的：建立登革病毒的荧光定量PCR检测技术。方法：针对1-4型登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列设计引物和探针,建立登革病毒实时荧光PCR检测方法及定量的检测方法。并对10例ELISA法检测为登革病毒阳性的病例,取其发热1-2天的临床血清标本进行荧光定量PCR检测。结果：实时荧光PCR检测1-4型登革病毒均为阳性,该探针和引物是登革病毒检测的通用探针和引物。实时荧光PCR检测10份临床血清,6份为阳性,阳性率为60%。结论：实时PCR方法是一个快速、特异性强、敏感性高的检测登革病毒的方法,适用于登革热的临床早期诊断,具有很好的社会效益和经济效益。     

逆转录套式聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒

目的建立敏感、特异的逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）方法，以检测中国人庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）感染。方法根据中国人感染ＨＧＶ者ＮＳ５区部分核苷酸序列分析结果，设计套式ＰＣＲ引物，用于ＨＧＶＲＮＡ的检测，并与用国外报道引物所作的一次ＰＣＲ和套式ＰＣＲ检测结果进行比较。结果共检测标本１３３份。以国外报道引物作一次ＰＣＲ和套式ＰＣＲ检出率分别为８．３％和１１．３％，作者建立的套式ＰＣＲ检出率为１８．０％，对部分ＰＣＲ产物进行序列分析证实为ＨＧＶ特异性基因。结论建立的方法可在中国人群中显著提高ＨＧＶＲＮＡ检出率。     

Clinical applicability of single-tube multiplex reverse-transcriptase PCR in dengue virus diagnosis and serotyping

This study has evaluated the clinical applicability of a single-tube multiplex RT-PCR as compared with a two-step nested RT-PCR for the diagnosis as well as serotyping of dengue virus in patient's samples. Seventy-six acute phase blood samples collected from clinically suspected dengue patients during the 2008 outbreak were subjected to two-step nested RT-PCR and single-tube multiplex RT-PCR for dengue diagnosis and serotyping. Of the 76 samples, 17 (22.4%) were positive for dengue viral RNA. Single dengue virus infection was found in 16 cases and 1 had concurrent infection with two serotypes (3&1). Dengue serotype 3 was the predominant serotype (70.5%), followed by serotype 1 (23.5%). Single-tube multiplex PCR had concordant result with that of two-step nested RT-PCR including the one with concomitant infection. This study reveals the predominance of dengue serotype 3 in North India in addition to the co-circulation of multiple serotypes and concomitant infection. The rapid and accurate diagnostic capability of single-tube multiplex RT-PCR used in the study appears to be promising enough to be commonly used for dengue viral detection as well as serotyping.     

Detection of influenza virus from throat and pharyngeal swabs with a nested duplex light cycler RT-PCR

A rapid duplex RT-PCR method was developed using the Roche LightCycler technology for detection of influenza type A and influenza type B viruses. Ninety-seven clinical specimens were analyzed using the Lightcycler method compared with conventional viral culture. Thirty-seven specimens (38.1%) were positive by RT-PCR using matrix protein (MP) primers for influenza A or B virus, compared to thirteen culture positive specimens (13.4%). All culture positive specimens were also positive by RT-PCR. A nested PCR reaction using hemagglutination (HA) gene primers confirmed all of the earlier positive PCR reactions. This LightCycler PCR technique was found to be more sensitive than viral culture for influenza virus detection.