超声辅助转基因治疗缺血性心脏病的骨髓间充质干细胞的实验研究

目的血管内皮生长因子（VEGF）基因转染骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法VEGF165基因的质粒PEGFP-C1,采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达情况。结果超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达,10h后出现表达高锋,持续3d左右,其后有些细胞荧光开始减退。结论VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

超声辅助VEGF165转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法 VEGF165基因的质粒PEGFP-C1，采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞，转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果 超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达，10h后可达高锋，持续3天左右，其后有些细胞荧光开始减退。结论 VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞内有GFP表达，提示细胞转染成功，骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

骨髓基质干细胞转基因治疗兔股骨头无菌性坏死的研究

目的：探讨激素诱导兔股骨头无菌性缺血坏死通过骨髓基质干细胞转染血管内皮细胞生成因子治疗的实验可能性。方法：体外扩增兔骨髓基质干细胞，将hVEGF165质粒转染兔骨髓基质干细胞，然后将此细胞与同种异体冻干松质骨复合构建重组真核表达质粒pcDNA31/VEGF165，48只新西兰大白兔成功建立股骨头坏死模型后随机分成3组。第一组：用VEGF转染BMSC与冻干松质骨做载体回植于兔股骨头坏死部位。第二组：BMSC与冻干松质骨复合植入。第三组：单纯冻干松质骨植入。在植入后2、4、和8周对植入物进行形态学及组织学观察。结果：pcDNAy/VEGF165转染BMSC构件成功，第一组：股骨头坏死情况得到改善。第二组：有改善。第三组：改善不明显。第一组与另外几组比较差异有显著性（P〈0．01）。结论：VEGF转染BMSC复合冻干骨治疗兔股骨头坏死可促进局部血管的早期形成，松质骨复合物可增加骨形成。为临床上VEGF转染BMSC结合冻干骨治疗股骨头坏死提供实验和理论基础。     

VEGF165在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达及鉴定

目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF165）转染恒河猴间充质干细胞（MSCs）后的表达情况, 以及转染后对 MSCs 功能的影响。 方法 通过 Ficoll 法分离并培养恒河猴骨髓 MSCs, 进行细胞表型鉴定。 转染 pcDNA-eGFPVEGF165至 MSCs, 荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达情况, 同时流式细胞技术对转染成功的细胞进行细胞表型及 eGFP 表达鉴定, RT-PCR 法检测转染后 VEGF165表达情况。 结果 成功分离到纯度较高的 MSCs, 转染后的 MSCs 及子代细胞均有 eGFP 和 VEGF165 的表达, 且保留了 MSCs 的特性。 结论 VEGF165 基因转染 MSCs 后可以稳定表达外源基因, 且可以维持 MSCs 的特性。     

重组VEGF165基因腺相关病毒的包装和鉴定

目的包装重组VEGF165基因的无致病性腺相关病毒,以其作为基因载体感染HUVEC细胞并检测其表达,并在体外检测病毒生物学活性。方法从含有VEGF165基因的pET-32a（＋）-VEGF165原核表达载体中扩增出VEGF165片段,构建重组骨架质粒pAAV-VEGF165。将此质粒和对照质粒pAAV-GFP分别与腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper用钙-磷共转法转染HEK293细胞,通过同源重组分别产生rAAV-VEGF165和rAAV-GFP重组腺相关病毒。通过real-timePCR法测定病毒滴度后,转染HUVEC细胞并检测其表达,并通过感染HUVEC来检测其促增殖作用。结果扩增出的VEGF165片段成功构建至重组骨架质粒中,pAAV-VEGF165经双酶切和测序鉴定正确。病毒包装效率达90%以上,收获纯化rAAV-VEGF165病毒滴度达6.0×1010pfu/mL。重组腺病毒rAAV-VEGF165能够感染HUVEC细胞并得到显著性表达;与未转染组和GFP组相比,能够显著促进HUVEC细胞的增殖。结论我们成功包装了重组腺相关病毒rAAV-VEGF165,它能够感染HUVEC细胞并高表达VEGF165蛋白,并具有促增殖作用,这为进一步开展VEGF165基因的基因靶向治疗奠定了基础。     

人VEGF165基因的克隆、表达和活性鉴定

目的 克隆人VEGF165基因,构建其真核表达质粒,转染293细胞,并鉴定表达VEGF的生物学活性。方法采用PCR法从人心脏cDNA文库钓取人VEGF165基因,插入pUC19载体测序后与真核表达质粒pAdTrackCMV连接,阳离子脂质体Lipofectamin介导VEGF基因转染293细胞,Northern blot和Western blot法分别检测VEGFmRNA和蛋白的表达,Miles试验进行活性鉴定。结果(1)琼脂糖凝胶电泳分析得到两个片段,分别为582bp的VEGF165DNA和2．68kb的pUC19线性质粒,结果与理论值相符,VEGF165测序结果与GENE BANK中VEGF165序列完全一致。(2)转染293细胞后表达绿色荧光蛋白,转染后第3天(1024pg／ml)和5天(986pg／ml)VEGF表达最高,明显高于转染前(102pg／ml)。(3)Miles试验结果显示,用转染AdTrackCMV-VEGF165细胞培养上清皮下注射后10分钟左右皮丘变为蓝色,成倍连续稀释后,出现蓝斑的时间延长,蓝斑范围也相应缩小。而注射未转染293细胞培养上清和生理盐水组则未见蓝斑出现。结论成功克隆人VEGF165基因,并表达出具有生物学活性的VEGF蛋白。     

bFGF基因与体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞的相关性

目的探究bFGF基因与体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞的相关性。方法采用Lipofectamine转染试剂将重组真核表达质粒pIRFS2-EGFP-bFGF来转染缺血性心肌病患者的骨髓基质干细胞。观察患者转基因效率和bFGF浓度变化情况。结果最初的标记基因荧光强度最强,从4～48 hEGFP阳性细胞数量逐渐增多,转基因效率逐渐升高,而在48～72 h内强度逐渐减弱,转基因效率反而有所下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。采用酶联免疫吸附法(ELISE)检测转染后4、12、24、48 h的bFGF浓度逐渐升高到23.5ng/ml,而在48～72 h内浓度慢慢降低。差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 bFGF基因体外转染对于缺血性心肌病患者的骨髓基质干细胞的增殖和分化具有较好的促进作用。     

骨形成蛋白2基因转染对犬牙髓细胞生物学特性的影响

目的构建骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic proteins 2,BMP2）绿色荧融合蛋白pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,然后再用其在体外转染犬牙髓细胞（DDPCs）形成BMP2-DDPCs细胞,观察BMP2基因转染对牙髓细胞生物学特性的影响。方法构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,采用阳离子脂质体转染法将BMP2基因转染体外培养的DDPCs,检测BMP2-DDPCs碱性磷酸酶（ALP）活性,骨钙素（OC）产量和Ⅰ型胶原合成量等指标的测定,研究BMP2基因转染对牙髓细胞生物学特性的影响。结果成功构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,对构建的BMP2真核重组质粒用XhoI、HindIII进行双酶切,其产物进行琼脂糖凝胶电泳后,在1.2、4.7kb可见两条特异条带;并进行全基因序列测序,报告100%符合,证明pEGFP-N1-BMP2重组质粒构建成功。BMP2-DDPC中ALP活性,OC产量和Ⅰ型胶原合成量增加,与对照组DDPCs、N1-DDPCs相比差异有统计学意义（P〈0.05）,通过增强ALP、OC和Ⅰ型胶原等成骨标志物的表达,促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化。结论 pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒转染后的牙髓细胞,具有成牙本质细胞的特征。     

pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其在小鼠骨髓基质干细胞的表达

目的:通过基因重组技术体外构建真核表达质粒pcDNA3．1( )／GDF-5,并检测其在小鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法:提取孕14 d小鼠胚胎肢芽组织总RNA,RT-PCR扩增,将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA 3．1( )载体,并进行酶切鉴定及测序;脂质体介导pcDNA 3．1( )／GDF-5重组质粒瞬时转染小鼠MSC,RT-PCR和免疫细胞化学检测GDF-5的表达。结果:重组质粒双酶切图谱显示有5．4 kbp和1．6 kbp两条带;测序结果与Genbank中的序列完全相同;转染后RT- PCR显示实验组有一219bp特异性条带,免疫细胞化学检测发现实验组细胞胞浆内有棕色阳性染色,实验对照组和空白组均为阴性。结论:本实验成功构建pcDNA3．1( )／GDF-5真核表达质粒,转染小鼠MSC中有GDF-5表达,为进一步研究其在软骨发育机制和软骨骨组织工程领域提供了实验基础。     

重组人VEGF和前列腺素E1对移植脂肪早期血管生成的作用

目的探讨重组人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165基因质粒转染移植脂肪组织和脂微球化前列腺素E1（Lipo—PGE1）局部应用对移植脂肪颗粒早期血管生成的作用。方法在颗粒脂肪移植的动物模型中,分别应用PCD-VEGF165质粒、Lipo—PGE1、PCD-VEGF165质粒＋Lipo—PGE1。Western blot检测实验组和对照组移植组织的VEGF表达,免疫组化法测定各组移植组织的微血管密度值。结果各实验组组织中VEGF蛋白表达量及微血管密度值明显高于对照组。结论VEGF165基因质粒能在移植脂肪组织中表达外源性VEGF蛋白,诱导移植脂肪血管的新生,Lipo-PGE1能有效促进移植脂肪早期血管生成,VEGF165基因质粒和Lipo—PGE1有协同作用。     

叔丁基对苯二酚上调Nrf2调控的基因表达并减轻环磷酰胺导致的小鼠血液毒性

血液毒性（或称骨髓抑制）是癌症化疗最常见的剂量限制毒副作用,而转录因子Nrf2控制着包括骨髓在内的许多组织对化学刺激的敏感性。本文研究了叔丁基对苯二酚（tBHQ）对小鼠外周血细胞中Nrf2调控的基因表达和环磷酰胺（CTX）导致的血液毒性的影响。CTX处理导致了小鼠外周血有核细胞的凋亡和白细胞减少,伴随着骨髓造血细胞的动员。tBHQ处理则可以在体外和体内激活RAW264.7小鼠巨噬细胞和外周血细胞中Nrf2信号和下游基因如血红素氧化酶1和谷胺酸半胱氨酸连接酶催化亚基等的表达同时,tBHQ预处理可以减轻CTX导致的小鼠外周血有核细胞的凋亡和白细胞减少,说明Nrf2可能在减轻CTX血液毒性中发挥作用。本文的研究有助于加深对化疗所致血液毒性的了解,并提示Nrf2可能作为减轻化疗毒副作用的化疗保护剂的药物靶标。     

再生障碍性贫血患者骨髓中RCAS1水平的研究

目的分析RCAS1在再生障碍性贫血患者骨髓上清及骨髓基质细胞培养上清中的表达。方法酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定17例再生障碍性贫血患者及18例正常对照骨髓上清及骨髓基质细胞培养上清中sRCAS1水平。结果①再生障碍性贫血患者骨髓上清中sRCAS1水平为(0.37±0.14)μg/L,正常对照为(0.09±0.11)μg/L(P<0.05)。②再生障碍性贫血患者基质细胞培养上清中sRCAS1水平为(1.00±0.08)μg/L,正常对照组为(0.81±0.05)μg/L(P<0.05)。结论再生障碍性贫血患者骨髓上清及骨髓基质细胞培养上清中sRCAS1水平明显高于正常对照组。     

BMP-2与VEGF基因在同种异体骨修复骨缺损中的实验研究

目的 探讨“补肾壮骨合剂”(骨碎补、续断、自然铜、土鳖虫)在同种异体骨修复骨缺损中对骨形态形成蛋白-2(bone morphogenetic protein two,BMP-2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的表达及影响 方法 普通家兔48只,取其中36只随机分为实验组和对照组,实验组和对照组均为18只,实验组和对照组再继续分为6组,每组各为3只;实验组和对照组均按常规1术在无菌条件把左侧桡骨中下1/3处用骨磨钻制成10mm的骨缺损模型,取另外12只备用家兔处死后取髂骨植入以上骨缺损处;实验组用“补肾壮骨合剂”复合饲料喂养,对照组用普通饲料喂养,于术后3d及1、2、4、6、8周各处死实验组和对照组普通家兔3只,取骨缺损处标本进行BMP-2和VEGF基因的实时定量聚合酶链反应(real-time PCR).结果 对BMP-2和VEGF的目的基因校正结果后,以对照组1周拷贝数为基础,其他各组与其比值:对照组和实验组在3d及1、2、4、6、8周BMP-2基因分别为0.55、1.00、2.19、3.20、2.29、1.42和1.84,8.83、3.44、2.50、6.50、6.00;VEGF基因分别为2.08、1.00、0.88、3.40、1.71、1.17和6.5、2.25、1.86、3.13、3.33、3.31,实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05) 结论 补肾壮骨合剂能明显缩短骨缺损的修复时间和提高骨组织的修复质量,在对BMP-2和VEGF的释放水平和诱导成骨进程及促进骨损伤区血管化方面有显著的影响,并可以看出在骨缺损的修复过程中各个时间段二者的增长不成比例关系.     

血管内皮细胞生长因子-165和血管形成素-1促进干细胞动员

目的 研究缺血肌肉转染腺病毒(Ad-)携带人血管内皮细胞生长因子-165(VEGF-165)和人血管形成素-1(Ang-1)基因后引起的细胞动员效应。方法 制作大鼠下肢血管闭塞模型,肌肉内注射Ads-VEGF-165和／或Ad5-Ang-1,以Western法检测生长因子蛋白表达、免疫组化检测基因导入后在缺血肌肉引起的效应。结果(1)局部转基因肌肉组织高表达人VEGF-165蛋白和人Ang-1蛋白;(2)与对照组相比,接收两因子转染后的骨骼肌纤维间溴化脱氧尿嘧啶(BrdU)阳性的浸润细胞显著增多,呈协同效应。有细胞同时表达内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞标志性抗原。部分细胞表达CD117^ 并分化为新生微血管的内皮细胞。结论(1)两因子能促进CD117^ 骨髓干细胞动员到缺血组织部位并分化为内皮细胞参与血管新生;(2)两因子可能协同动员召集能在缺血部位聚集并分化为其它类型细胞的干／祖细胞;(3)两因子可能同时作为血管生成因子和细胞动员剂用于缺血性疾病的干细胞移植治疗中,以增强缺血损伤修复效果和节省干细胞用量。     

肝细胞生长因子对兔骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的　观察腺病毒携带肝细胞生长因子cDNA(adHGF)转染兔骨髓基质细胞 (MSC)后的主要生物学特性。方法　抽取成年雄性新西兰白兔骨髓 ,密度梯度离心获得MSC。取兔膝关节软骨 ,体外培养软骨细胞至第 3代。adHGF转染第 5代MSC ,噻唑蓝 (MTT)法检测细胞增生活力 ,阿尔新蓝法检测细胞培养上清液中氨基己糖多糖 (GAG)含量。酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测adHGF转染MSC后HGF的表达。免疫组织化学染色及反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。结果　原代MSC为短梭形、簇状生长 ,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长。adHGF转染前后细胞增生状态差异无显著性。MSC转染后GAG含量增加。免疫组织化学染色MSC转染前后I型胶原阳性 ,转染后Ⅱ型胶原弱阳性。转染后HGF表达量在转染 1周内最高 ,达 12 0 5ng/ml,并可持续至 6周。RT PCR表明MSC在adHGF转染前后均表达I型胶原 ,转染后微量表达Ⅱ型胶原。结论　MSC在体外培养过程中的自然转归是趋向于成骨。MSC不仅是HGF的源细胞 ,而且可作为靶细胞接受外源目的基因的转染并有效表达     

槐白皮对放射损伤人鼠骨髓VEGF、G-CSF的表达及超微结构的影响

目的:通过检测急性放射损伤小鼠骨髓组织中血管内皮细胞生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的表达及骨髓细胞超微结构的变化,探讨槐白皮对骨髓造血细胞和造血微环境的影响.方法:实验随机分为5组,即正常、照射对照和槐白皮高、中、低剂量(0.8、0.4、0.2mL·kg-1)组.采用免疫细胞化学SABC染色法检...     

Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) transfection to human periosteal cells enhances osteoblast differentiation and bone formation

Periosteum has been demonstrated to contain mesenchymal progenitor cells differentiating to osteoblasts, and both bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) may play important roles in cell-based approaches to bone regeneration. The purpose of this study was to evaluate the feasibility and efficacy of BMP-2 and/or VEGF on periosteal cell differentiation to osteoblasts in vitro and ectopic bone formation in vivo. Human periosteum-derived cells were transfected with BMP-2, VEGF, BMP-2 + VEGF, or vehicle as a control by non-viral gene transfer and then cultured and implanted to nude mice intramuscularly. Real-time polymerase chain reaction analysis of the culture revealed that transgenes for BMP-2 and BMP-2 + VEGF induced more mRNA expression of alkaline phosphatase, collagen type I, and osteocalcin than VEGF and vehicle treatments; additionally, alizarin red S staining, alkaline phosphatase staining, and alkaline phosphatase activity were significantly higher in the BMP-2 + VEGF transgene than in the other versions. After implantation, ectopic bone was observed at 4 weeks and greatly increased at 8 weeks in all groups. In particular, the combination of BMP-2 and VEGF formed significantly more bone at 4 weeks, and VEGF transfection resulted in more blood vessels relative to the conditions without VEGF. Thus, VEGF might enhance BMP2-induced bone formation through modulation of angiogenesis.     

Bcl-2 与急性白血病患者骨髓组织血管新生的关系

目的通过检测急性白血病（AL）患者骨髓病理切片中血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）及Bcl-2蛋白的表达和微血管的生成情况及VEGF及Bcl-2蛋白的表达和微血管生成之间的相关性。方法免疫组织化学染色方法检测35例AL患者和35例对照组骨髓病理切片中的,Bcl-2表达;ELISA检测患者血清中VEGF-C的表达。结果对照组患者血清中VEGF-C为（126.34±21.22）pg/ml,实验组患者血清中VEGF-C为（324.45±34.12）pg/ml,35例AL患者,微血管密度（microvessel density,MVD）的平均光密度值为（0.3573±0.030）。35例对照组骨髓病理免疫组织化学片中,MVD的平均光密度值为（0.2192±0.037）。AL患者的MVD平均光密度值明显高于对照组,有显著性差异。结论 AL患者的骨髓组织中由于VEGF的表达,诱导产生更多的Bcl-2蛋白来降低AL细胞凋亡,从而增加AL的恶性程度。     

刺梨汁对骨髓抑制小鼠造血功能的调控作用

目的探讨刺梨汁对环磷酰胺合并60Co致骨髓抑制小鼠造血功能的影响,研究其促进血细胞上调的作用机制。方法双抗体夹心法检测外周血常规、骨髓基质中红细胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）、粒细胞生长因子（GCSF）的量。结果刺梨汁能明显改善骨髓抑制小鼠外周血常规,能有效平衡微环境中TPO的量,改善EPO的表达,对骨髓抑制小鼠骨髓细胞上清中GCSF有明显的正调控作用。结论刺梨汁能提高骨髓抑制小鼠外周血血细胞和骨髓有核细胞计数,可促进骨髓抑制小鼠骨髓细胞从G0/G1期进入增殖周期,并能有效调节骨髓微环境中TPO、EPO、GCSF的表达,从而促进骨髓抑制小鼠的造血功能,可作为一种治疗贫血的辅助保健药物。