大鼠生后肾内皮型一氧化氮合酶的定量分析

为探讨内皮型一氧化氮合酶在大鼠生后肾发育中的作用,采用SD大鼠按生后年龄随机分为6组,即新生组、生后3天组、5天组、7天组、14天组和成年组,用免疫印记技术和光密度分析法对各组大鼠生后肾内皮型一氧化氮合酶进行定量检测,以测得的一氧化氮合酶最大量为1(100%),计算蛋白相对含量,SPSS10.0统计软件包统计分析。结果显示,新生组酶含量最高为1,随年龄增长酶含量逐渐减少,至第7天达到最少为44.60±2.41%,以后又增高至14天达成年水平为71.55±4.35%。提示大鼠生后不同年龄组肾内皮型一氧化氮合酶有明显的变化规律,NO可能在肾脏的成熟与发育中起重要作用。     

胚胎小鼠肾脏发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析

目的:探讨神经型一氧化氮合酶在胚胎小鼠妊娠不同时期肾脏发育中的意义。方法:选用成年健康昆明小白鼠,按雌雄比例3:1同窝饲养,采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。选取胚龄12天(ED12)、14天(ED14)、16天(ED16)、18天(ED18)的胎鼠及出生时(PD0)仔鼠,分5组,每组各6只母鼠,每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠,剖腹取肾脏,用免疫印迹技术(Westernblot)及光密度分析系统分别对各组胎鼠或仔鼠肾脏内nNOS进行定量检测。结果:Western blot及光密度分析显示,ED14组肾脏nNOS含量最少,随后逐渐增多,PD0组肾脏nNOS含量最多。结论:胚胎小鼠肾脏nNOS在胚胎第14天开始呈阳性表达,以后含量逐渐升高,出生时含量最高,表明nNOS在胚胎小鼠肾脏发育的早期阶段起重要作用。     

缺血再灌注对小鼠肠神经丛nNOS和iNOS表达的影响

目的 观察缺血再灌注后小鼠回肠神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达，探讨肠缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）的发生机制。方法 采用小鼠肠系膜上动脉缺血再灌注模型，根据不同再灌注时间对小鼠随机分1d组、3d组、5d组、7d组、对照组和假手术组，用SP法检测小鼠回肠nNOS和iNOS的表达情况。结果 与对照组和假手术组相比较，nNOS在再灌注1d后开始在肌间神经丛持续高表达（P〈0．01）；而iNOS在再灌注3d后开始在肌间神经丛持续高表达（P〈0．05）。结论 nNOS和iNOS在肠缺血再灌注后的表达增强，提示一氧化氮及一氧化氮合酶与肠神经节细胞在缺血再灌注中的损伤有着密切关系。     

雪莲提取物对脑缺血再灌注损伤小鼠皮层区一氧化氮合酶亚型表达的影响

目的 探讨雪莲提取物对脑缺血再灌注损伤后小鼠皮层3种一氧化氮合酶(NOS)亚型表达的影响.方法 32只健康雄性ICR小鼠完全随机分为假手术组、生理盐水组、雪莲注射液组和依达拉奉组,每组8只,分别给予生理盐水、雪莲注射液或依达拉奉7d后,制作大脑中动脉阻塞模型,缺血60 min再灌注24h后应用免疫组化染色观察计算缺血皮层区每个高倍镜视野下3种NOS亚型的表达.结果 脑缺血再灌注损伤后24h,生理盐水组小鼠皮层神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达分别为(14.0±4.8)个/HP、(15.0±5.5)个/HP、(18.2±5.5)个/HP,较假手术组[(2.1±0.8)个/HP,(1.3±0.6)个/HP,(3.3±1.9)个/HP]均明显上调(P均为0.000).雪莲注射液组模型制作后皮层nNOS及iNOS阳性细胞表达分别为(7.5±3.8)个/HP、(7.1±3.7)个/HP,较生理盐水组明显减少(P均为0.000);eNOS阳性细胞表达为(22.3±2.3)个/HP,与生理盐水组比较差异无统计学意义(P=0.072).结论 雪莲提取物通过抑制脑缺血再灌注损伤后nNOS及iNOS表达,从而发挥神经保护作用.     

丹参和三七对实验性糖尿病小鼠心肾组织纤维化病变的影响及其作用机制研究

目的:探讨丹参和三七对实验性糖尿病小鼠心肾组织纤维化病变的影响及其可能的作用机制。方法:采用一次性尾静脉注射四氧嘧啶造成小鼠糖尿病模型,饲养6周后随机分为7组,其中组1为糖尿病对照组(DM组),其余6组加用左旋N硝基精氨酸制备糖尿病小鼠心、肾组织纤维化模型。然后将组2设为糖尿病-组织纤维化模型对照组(DML组),3～7组则分别给予格列奇特(组3)或格列奇特加高、低剂量的丹参(组4、组5)和三七(组6)及依那普利(组7)。计算用药前后各组的心、肾脏器系数,检测血浆和心肾组织中一氧化氮、羟脯氨酸及丙二醛的含量和诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶的活性。结果:与DML模型组比较,丹参高剂量组(组4)血浆、心、肾组织中的一氧化氮含量显著增加,其提高率分别为298.4%、143.1%和189.5%;内皮型一氧化氮合酶的活性显著提高,其提高率分别为64.3%、67.6%和113.0%;心、肾组织中丙二醛、羟脯氨酸的含量也明显降低,丙二醛的降低率分别为45.5%和40.3%,羟脯氨酸的降低率分别为19.3%和17.6%。结论:在给予基础降糖药的基础上,合并给予丹参能对抗实验性糖尿病小鼠心肾组织纤维化,而合并给予三七的药效相对较弱。     

一氧化氮在缺血性脑损伤中作用的实验研究进展

一氧化氮 (NO)在缺血性脑损伤中具有双重作用 ,既表现为神经保护作用 ,又有神经毒性作用。在脑缺血过程中 ,源于内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)产生的NO有神经保护作用 ,源于神经元型一氧化氮合酶 (nNOS)和诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)过度表达所形成的NO有神经毒性作用。利用NO的双重作用 ,找到防治脑缺血的药物及给药时间和剂量等一直是研究的热点。     

雌激素对血管紧张素Ⅱ引起的高血压的保护作用:中枢NO的作用

爱荷华大学最近的研究验证了两个假设:(1)一氧化氮(NO)参与减弱雌性小鼠对血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)的反应。(2)雌性和雄性小鼠在全身给予ANGⅡ后,下穹窿体(SFO)和室旁核(PVN)神经元型一氧化氮合酶(nNOS)表达不同。     

石榴皮鞣质对大鼠乙醇性胃黏膜损伤的保护作用研究

目的:研究石榴皮鞣质对大鼠乙醇性胃黏膜损伤的保护作用。方法:乙醇灌胃(1.5mL/只)以复制大鼠乙醇性胃黏膜损伤模型。实验分为正常(等容生理盐水)、模型(等容生理盐水)、枸橼酸铋钾(100mg·kg-1)和石榴皮鞣质高、中、低剂量(500、150、50mg·kg-1)组,观察对胃黏膜的影响;测定一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量;通过免疫组化法测定神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达。结果:150、500mg·kg-1石榴皮提取物可显著修复胃黏膜损伤,且可显著抑制模型大鼠MDA含量增高和NO含量降低(P<0.01),也可抑制nNOS、eNOS的表达下降,但无显著性差异。结论:石榴皮提取物对大鼠乙醇性胃黏膜损伤具有良好的保护作用,这种作用可能与抗脂质过氧化反应,抑制nNOS、eNOS表达下降有关。     

铅对海马神经元型一氧化氮合酶及其基因表达的影响

目的　观察实验性铅中毒对小鼠海马神经元型一氧化氮合酶 (nNOS)及其基因表达的影响 ,探讨铅致学习记忆损害的分子毒理学机制。方法　小鼠用 5g L醋酸铅溶液染毒。采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法 ,半定量分析染毒 2、4和 8周小鼠海马nNOS基因表达的变化。采用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶 (NADPH d)组织化学染色法分析铅染毒对小鼠海马NOS阳性神经元的影响。结果　nNOSmRNA存在于正常小鼠海马组织中 ;铅染毒后仅 2周 ,海马nNOSmRNA的含量显著减少 ;随着染毒时间的增加 ,海马nNOSmRNA的含量逐渐下降。镜下观察 ,视野中正常小鼠海马平均NOS阳性细胞数为 ( 5 7 63± 11 5 )个 ,而铅染毒组仅为 ( 2 9 3 5± 9 10 )个。结论　铅可使小鼠海马nNOS及其基因表达下降     

异丙酚对大鼠脑内nNOS表达及NO含量的影响

目的通过观察异丙酚对大鼠海马以及基底前脑内神经型一氧化氮合酶(nNOS)的表达和一氧化氮(NO)释放量的影响,探讨异丙酚的中枢麻醉机制。方法选择正常雄性Wistar大鼠30只随机分为三组,分别腹腔注射异丙酚50mg/kg(P50组)、100mg/kg(P100组)及生理盐水10mL/kg(NS组)。10min后,各组大鼠经主动脉灌注生理盐水,随机选取5只取新鲜鼠脑,分离海马及基底前脑,分光光度法测其NO释放量;每组另5只大鼠继续灌注固定液后取脑,免疫组化检测海马及基底前脑内nNOS的表达。结果与对照组NS组相比,海马及基底前脑内nNOS表达量、NO释放量都显著减少(P<0.05)。结论异丙酚可能通过抑制海马及基底前脑内nNOS表达,使NO的释放减少而发挥麻醉作用。     

尿酸对大鼠局灶性脑缺血保护作用及其机制研究

目的初步探讨外源性给予尿酸对脑缺血的保护作用及其机制。方法大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。动物随机分为假手术组、缺血模型组、溶媒对照组、尿酸(62.5 mg·kg-1.d-1,93.75 mg·kg-1.d-1)治疗组、阿司匹林阳性对照组。手术后断头取脑,行神经行为学评分和TTC染色法判断神经元损伤程度。取缺血侧皮质组织,分光光度法测定丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、黄嘌呤氧化酶(XO)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧物酶(GSH-Px)活力的变化;用ELISA方法检测神经元型一氧化氮合酶(nNOS)含量变化。结果尿酸可以改善脑缺血再灌注大鼠神经行为学评分(P<0.05)、降低脑缺血再灌注大鼠皮质损伤(P<0.05),从而起到神经保护作用。尿酸可减少缺血侧皮质组织MDA,XO含量(P<0.05)、抑制SOD,GSH-PX活力升高(P<0.05),并降低nNOS含量。结论尿酸可通过其抗氧化应激效应以及降低nNOS和XO含量对大鼠局灶性脑缺血发挥保护作用。     

小檗碱对高糖培养的背根神经节中疼痛相关因子的影响

目的探讨小檗碱对痛性糖尿病神经病变疼痛相关蛋白P2X3、TRPV4、神经型一氧化氮合酶(nNOS)表达的影响及意义。方法新生大鼠离体培养背根神经节神经元,免疫组织化学法、蛋白质印迹法检测细胞表达阳性率及蛋白表达。结果 P2X3、TRPV4、nNOS正常条件下在背根神经节中均有表达。免疫组织化学法检测高糖培养条件下P2X3、TRPV4、nNOS可看到阳性表达神经元增多,受体表达升高。小檗碱处理后,P2X3、TRPV4、nNOS表达均下降。蛋白质印迹法检测结果显示高糖条件下P2X3、nNOS表达高于对照组(P<0.01),小檗碱处理后,P2X3、TRPV4、nNOS均较高糖组降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。结论小檗碱可降低背根神经节神经元高糖环境下P2X3、TRPV4、nNOS的高表达,对糖尿病受损神经元有保护作用,可能为改善痛性糖尿病神经病变提供新途径。     

异丙酚预处理对大鼠海马神经元凋亡的影响

目的探讨异丙酚预处理对缺氧/复氧后大鼠海马神经元凋亡的影响。方法取离体培养的大鼠海马神经元,随机分成5组:正常组(A)组。CoCl2组(B)组:加入300μmol·L-1(下同)CoCl2处理4h,然后更换正常的培养基培养24h,之后更换无血清的培养基培养。脂肪乳组(C)组:加入10%脂肪乳剂90μl预处理1h后同B组。异丙酚组(D)组:加入100μmol·L-1异丙酚1h后同B组。7-NI组(E)组:如D组,但加入CoCl2的同时加入3·3μl7-NI(25g·L-1)处理4h。MTT法测定细胞增殖,流式细胞技术测定细胞的凋亡。RT-PCR技术检测神经型一氧化氮合酶和凋亡相关基因的表达情况。结果脂肪乳组与CoCl2组比较,各项指标相似(P>0·05);异丙酚可增加神经元的增殖能力,减少凋亡(P<0·05或P<0·01),上调神经型一氧化氮合酶和凋亡抑制基因bcl-2的表达,下调促凋亡基因cyclinD1的表达。而这些调节作用可被神经型一氧化氮合酶抑制剂7-NI抑制(P<0·05或P<0·01)。结论100μmol·L-1异丙酚预处理对缺氧/复氧后大鼠海马神经元有保护作用,神经型一氧化氮合酶和凋亡相关基因在其中起重要作用。     

专题五、其他神经-精神疾病及其药物治疗——Ciproxifan镇痛作用及其中枢机制

目的：观察H3受体阻断药ciproxifan的镇痛作用，并探讨其可能的中枢机制。方法：选用小鼠formalin痛觉模型，观察ciproxifan对formalin引起的Ⅰ相和Ⅱ相小鼠痛觉行为的影响；formalin痛觉模型半小时后，取小鼠脑和脊髓，超声破胞后分离神经元胞浆和胞膜，用western blot的方法观察神经型一氧化氮合酶（nNOS）往膜上转移的情况，即nNOS的活化情况。formalin痛觉模型1小时后，取小鼠脑和脊髓，做冰冻切片。     

ZX-5对一氧化氮合酶表达和活性的调节作用

目的前期研究表明ZX-5中的一个异构体(R,R)ZX-5,能够促进脉络膜血流和增加NO的释放量。该研究是为了进一步阐明ZX-5是通过上调哪种一氧化氮合酶(NOS)的表达或活性而达到增加NO释放和促进脉络膜血流的作用。方法 Western blot和一氧化氮合酶活性检测试剂盒测定不同一氧化氮合酶表达和酶活性。结果 (S,S)ZX-5能够上调诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达,而不影响内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和神经型一氧化氮合酶(nNOS)表达;而(R,R)ZX-5能够上调eNOS表达,并且iNOS表达也有轻微上调作用,但是不改变nNOS的表达;酶活性测定研究发现(S,S)ZX-5仅仅能通过激活iNOS酶活而增加NO释放量;而(R,R)ZX-5也仅仅能够通过激活eNOS的酶活而增加NO释放。结论和(S,S)ZX-5相比,(R,R)ZX-5能够通过上调eNOS表达和活力,增加NO的释放,进而增加脉络膜的血流;因此(R,R)ZX-5也更加适合开发为治疗年龄相关性黄斑变性的药物。     

多发性脑梗死大鼠乳头体一氧化氮合酶改变

目的探讨乳头体中神经元型一氧化氮合酶（nNOS）与多发性脑梗死的关系。方法建立多发性脑梗死动物模型,用一氧化氮合酶组织化学方法结合显微图像分析观察大鼠乳头体神经元型一氧化氮合酶变化。结果 MCI术后4h实验组大鼠乳头体nNOS阳性神经元数量与平均灰度值（43.09±3.95,183.69±3.80）均大于正常对照组（39.33±2.27,179.70±2.60）（P〈0.05）。结论乳头体nNOS神经元与多发性脑梗死密切相关。     

甲基苯丙胺所致的大鼠神经毒性损伤及nNOS抑制剂的保护作用

目的探讨神经元型一氧化氮合酶(nNOS)在甲基苯丙胺(METH)所致大鼠中枢神经系统氧化应激损伤中的作用机制。方法建立METH中毒动物模型,并给予nNOS抑制剂7硝基吲唑(7-NI)预处理,观察各组间动物行为学的变化,并检测nNOS表达、多巴胺(DA)含量、硝基化蛋白表达及凋亡等指标。结果 METH组大鼠纹状体中nNOS蛋白表达水平明显升高,而METH+7-NI组nNOS表达水平较METH组明显降低。METH组DA明显降低(P<0.01),而METH+7-NI组、7-NI组与对照组比较,DA无差异(P>0.05)。METH组硝基化蛋白含量明显升高(P<0.01),而METH+7-NI组硝基化蛋白表达较METH组明显降低(P<0.05)。METH组与对照组相比,凋亡细胞数明显升高(P<0.01),而7-NI对凋亡的增高表现出明显的保护作用(与METH组相比P<0.01)。METH组和METH+7-NI组的动物刻板行为评分均明显高于7-NI和对照组(P<0.01),METH、METH+7-NI组间差异无显著性(P>0.05)。结论METH可导致大鼠大脑纹状体nNOS蛋白表达水平增高、DA含量的降低、硝基化蛋白水平升高及细胞凋亡增多等多种神经毒性表现,7-NI能部分减轻其神经毒性作用。METH明显增加大鼠的不自主刻板运动,而应用7-NI预处理后,对刻板行为的改善并不明显。     

NO和iNOS在大鼠糖尿病早期肾脏中的变化

目的:观察糖尿病大鼠早期肾脏中一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide syn-thase,iNOS)活性变化,探讨NO/iNOS在糖尿病早期肾脏损害中的作用机制。方法:取成年健康SD大鼠60只,随机分成糖尿病组(DM组)和正常对照组(NC组),每组30只。DM组大鼠采用一次性腹腔内注射STZ制造糖尿病大鼠模型,成模后和NC组分别于第1、2、4周麻醉取左肾,用硝酸还原酶法和吸光光度法测定肾组织中NO含量、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)和iNOS活性。所有数据用SPSS11.5统计软件进行统计学处理。结果:①DM组大鼠肾组织中NO含量、NOS和iNOS活性分别较同批NC组有显著性差异(P<0.05);②各组大鼠中NO含量与NOS活性、iNOS活性呈正相关。结论:糖尿病大鼠早期肾脏中iNOS活性增强,催化生成的NO在糖尿病早期肾脏损害中发挥重要作用。     

氯沙坦对糖尿病大鼠肾皮质血管紧张素Ⅱ2型受体及诱生型一氧化氮合酶基因表达的影响

目的研究氯沙坦对糖尿病大鼠肾组织血管紧张素系统与一氧化氮系统的影响及其二者之间的关系。方法SD大鼠随机分成3组:对照组、糖尿病组和氯沙坦(30 m.gkg-1.d-1×8周,ig)治疗组。应用RT-PCR技术检测大鼠肾皮质血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2)、Ⅳ型胶原及诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达。并同时检测大鼠肾皮质血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、NO含量及一氧化氮合酶(NOS)活性。结果糖尿病组大鼠尿蛋白排泄率、肾皮质AngII含量、Ⅳ型胶原mRNA及iNOS mRNA表达较对照组明显升高;糖尿病大鼠肾皮质NOS活性也较对照组明显增强;然而糖尿病大鼠肾皮质NO含量及AT2mRNA水平却较对照组大鼠明显降低;氯沙坦治疗能显著降低糖尿病大鼠尿蛋白排泄率及肾皮质Ⅳ型胶原mRNA表达;并能明显增加肾皮质AT2及iNOS mRNA表达及总NOS活性及NO含量。结论AT2的激活与氯沙坦的肾脏保护作用有关,并可能参与了对肾脏iNOS mRNA表达的上调。     

山麦冬总皂苷对局灶性脑缺血损伤的保护及抗凝血作用研究

目的:研究山麦冬总皂苷(TSL)对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护及抗凝血作用。方法:采用三氯化铁局部涂抹损伤血管的方法复制大鼠大脑中动脉血栓模型,观察TSL对大鼠行为障碍、脑梗死范围、相关脑区组织病理变化、神经型一氧化氮合酶(nNOS)阳性细胞表达率等指标的影响;采用毛细管法及断尾法观察TSL对小鼠出、凝血时间的影响。结果:10、40mg.kg-1TSL可显著减少大鼠脑梗死范围,改善行为学障碍,降低nNOS阳性细胞表达率;20、60mg.kg-1TSL可使小鼠凝血时间及出血时间显著延长。结论:TSL对大脑中动脉血栓所致局灶性脑缺血损伤具有保护作用,并具有显著的抗凝血作用。