骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养在组织工程化软骨中的研究进展

关节软骨几乎不能自我修复,而组织工程的发展为关节软骨的修复提供了可能,但目前没有任何种子细胞能完全满足组织工程化软骨的要求。骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养作为种子细胞,是目前组织工程研究的热点,现就骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养研究现状作一综述。     

兔骨髓基质细胞体外培养的操作技术特征

目的：探讨原代细胞取材、分离方法及首次换液时间对体外培养兔骨髓基质细胞生长、增殖的影响。方法：实验于2004-01／06在山东中医药大学细胞学实验室完成。选择普通级4周龄雌性新西兰大白兔1只，抽取其两侧股骨大转子部骨髓液2mL，加入到盛有等体积Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中分离单个核细胞，进行首次提纯获取骨髓基质单细胞，置培养箱中培养传代，逐日在倒置显微镜下观察细胞生长情况。培养5d后，轻轻振荡培养瓶，吸除培养液，以后每两三天换液1次。继续传代。观察、记录、绘制细胞生长曲线并测定细胞群体贴壁及融合单层时间，观察细胞形态变化和生长增殖情况。在操作方法中注重了以下3点：①原代细胞培养取材于4～8周龄的新西兰大白兔。②分离方法采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞进行初次提纯获取骨髓基质细胞，消化时间不宜超过5min。在分离、纯化操作减少离心次数和时间，减少吹打和抽吸的次数，以避免对细胞的机械性损伤。③首次换液时间：选择在原代细胞接种后5d行初次换液比较合适。结果：①兔骨髓基质细胞体外培养生长增殖及形态变化：原代培养细胞接种后见大量悬浮呈圆形的细胞，轮廓清晰。24～36h后开始贴壁，呈不规则形态或呈类圆形或椭圆形。48～72h时呈集落生长，显示为短梭形或星形。4d时每个细胞集落中心部位细胞轮廓不清，体积较小，周边细胞呈细梭形，向周围呈辐射状排列。6d时贴壁细胞呈长梭形外观，部分区域融合成片。13～16d细胞融合单层，呈典型细长梭形外观，成集束状排列。传代细胞形态一周左右融合成单层。②第1代细胞生长曲线：从传代后第1天细胞数量开始增加，第4天增加幅度最大，至第6天细胞数量最大。以后数量略有下降。说明其潜伏期&;lt;24h，传代培养对数增殖期为2～5d，对数增殖期结束后，第6天细胞生长缓慢，进入平台期。由此可以得出细胞群体倍增时间约为24h。③第1代细胞贴壁率：传代细胞接种2h已有部分细胞贴壁，12h细胞基本贴壁完全，14h已有部分细胞开始增殖。传代细胞接种存活率为98％。④兔骨髓基质细胞镜下形态观察：苏木精一伊红染色可见骨髓基质细胞呈梭形、多角形等，有的有多个树状突起。胞浆呈细网状，淡红色略带蓝色。并见较多胞浆颗粒。细胞核清晰、深蓝色，位于中央，中间可见深染的数个点状染色质，可见分裂相。结论：取材于4～8周龄的新西兰大白兔的骨髓基质细胞采用密度梯度离心法培养传代，以原代细胞接种后5d行初次换液，在此体外培养条件模式下，兔骨髓基质细胞早期生长性状稳定，增殖速度快，适应性强，呈典型的成纤维细胞样外观，可连续观察10代以上仍具有以上特征，未出现明显衰老现象，适合用作骨组织工程学的种子细胞。     

兔骨髓基质细胞的体外培养及鉴定

背景:骨髓基质细胞的分离纯化、细胞培养、细胞标记、诱导因子、基因转染对细胞生物学影响、细胞载体构建及细胞复合物回植时间的选择等尚处于实验研究阶段。目的:摸索一种较为简便且可有效获得骨髓基质细胞的体外培养方法。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2006-06/2007-01在中国科学院北京基因组研究所完成。材料:SPF级6周龄新西兰大白兔8只,由中国科学院遗传发育研究所实验动物中心提供。方法:无菌条件下抽取兔骨髓1mL,D-Hanks液稀释后,离心弃上清,DMEM培养基重悬,制备单细胞悬液,叠加在密度为1.077的等体积淋巴细胞分离液的液面上,离心后取界面云雾状的单个核细胞层,用含有20%胎牛血清的DMEM培养基重悬。以1×10/cm2接种后贴壁法纯化细胞,待70%~80%长满单层后消化传代。主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞生长情况,锥虫蓝染色计数活细胞,苏木精-伊红染色对细胞进行鉴定,MTT法检测细胞活性,观察传代培养的细胞冻存后复苏情况。结果:接种24h后细胞开始贴壁,呈短梭形或三角形,且有长短不等的细胞突起;3d后贴壁细胞开始分裂增殖,部分区域形成细胞团簇;1周后大部分细胞呈成纤维状散落在培养瓶底生长;传代后细胞均匀分布,形态呈细长梭形,并沿一定方向排列,1mL骨髓基质细胞悬液传3代后的贴壁细胞数可达5×106~1×107数量级。骨髓基质细胞成活率约为90%,经鉴定为单核细胞,接种后1~6d细胞持续旺盛生长,至第8天细胞活性最高,随后生长活性下降。复苏冻存56d的细胞,其生长良好,增长迅速。结论:以淋巴细胞分离液梯度离心后可获得纯度较高的骨髓基质单核细胞,经体外扩增培养能够得到足够数量的种子细胞,冻存复苏后细胞活性无变化。     

自体骨髓间充质干细胞和同种异体软骨细胞共培养优化软骨组织工程种子的细胞源

背景：至今尚无一种细胞能完全满足组织工程对种子细胞的要求。目的：探讨自体骨髓间充质干细胞和同种异体软骨细胞共培养的可行性。方法：酶消化分离法获得兔软骨细胞,使用密度梯度离心和贴壁筛选的方法获得骨髓间充质干细胞。取细胞浓度为3×108L-1的第2代骨髓间充质干细胞和软骨细胞,随机分为3组,共培养组：将骨髓间充质干细胞和软骨细胞按2：1比例混匀;实验组：取同代同浓度的软骨细胞（浓度与共培养细胞的终浓度相同）;对照组：取低浓度软骨细胞1×108L-1（与共培养组中软骨细胞终浓度相同）。结果与结论：共培养组、实验组及对照组细胞平均群体倍增时间分别为3,7,8d;共培养组共培养细胞增殖比其他2组明显增快（P〈0.05）;糖胺多糖水平明显多于其他2组（P〈0.05）;自体骨髓间充质干细胞与同种异体软骨细胞共培养未见明显排异反应,提示自体骨髓间充质干细胞与同种异体软骨细胞为种子细胞共培养,骨髓间充质干细胞能促进软骨细胞的增殖和细胞外基质合成,缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数,同时软骨细胞可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向转化,节省大量软骨细胞。     

大剂量阿糖胞苷对人骨髓基质细胞合成蛋白聚糖的影响

大剂量阿糖胞苷对人骨髓基质细胞合成蛋白聚糖的影响顾小锋，马伴吟，吴外周血干细胞移植成功的关键之一是能采集到足够数量的外周血造血干细胞。应用大剂量阿糖胞苷（ＨＤＡｒａ－Ｃ）等可动员造血干细胞出髓，而使外周血造血干细胞升高达动员前的５０倍或更高。但ＨＤＡ...     

诱导骨髓基质细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的 探索用骨形态发生蛋白(BMP)—2和高分子透明质酸在体外诱导骨髓基质细胞(MSC)向软骨细胞分化的可能性。方法 自兔双侧股骨粗隆处抽取4—6ml骨髓后在体外行原代和传代培养，实验分为两组，实验组培养液中含BMP—2(100ng／ml)，培养瓶底预涂高分子透明质酸；对照组常规培养及传代。传代细胞玻片行苏木精—伊红染色、甲苯胺蓝染色、碱性磷酸酶染色(ALP)、免疫组织化学染色：培养细胞与聚乳酸／聚乙醇酸(PLGA)复合后植入自体兔股部肌内，大体及组织学观察形成的结节。结果 实验组传代细胞，尤其是第3代细胞甲苯胺蓝染色阳性，免疫组织化学染色S—100蛋白阳性，兔股部植入PLGA—细胞后3周形成软骨结节；而对照组免疫组织化学染色个别细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原染色阳性，植入PLCA—细胞后主要形成纤维组织。结论 应用BMP-2和高分子透明质酸有效诱导MSC向软骨细胞分化，MSC源性软骨细胞可作为软骨组织工程修复关节软骨损伤的较理想的种子细胞。     

兔骨髓基质细胞分离操作基础

目的 建立简单有效的兔骨髓基质细胞分离方法,从而获得较多的骨髓基质细胞.方法 采用密度梯度离心法与细胞贴壁法相结合,充分分离骨髓中的杂质细胞.结果 可以获得较多的骨髓基质细胞.结论 此方法简单有效,可以为进一步实验提供基本条件.     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

背景:骨髓基质干细胞的多向分化性不利于向软骨细胞单一方向分化,植入体内后成骨系细胞分泌的骨形态发生蛋白作用于非定向分化的前体细胞,使其向成骨细胞分化,而已定向分化的细胞则不受骨形态发生蛋白的影响,形成相应的组织.目的:体外诱导犬骨髓基质干细胞定向分化为软骨细胞,探讨体外诱导成软骨的方法和条件.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-03/2006-01在中山大学组织工程实验室完成.材料:选取4个月龄雄性家犬1只,骨髓基质干细胞取自犬肋骨.方法:自犬肋骨取骨髓2.0～3.0mL行体外原代骨髓基质干细胞分离培养.8～11d细胞接近融合时,加入胰酶消化,用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM合成培养液终止消化,收集细胞悬液,离心后,用培养液悬浮细胞,按1:3接种传代.取第3代细胞培养扩增,换液时加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子2mL,换液2次后,再加入1mg/L转化生长因β1 2mL诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化.主要观察指标:行甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.结果:骨髓基质干细胞体外行原代和传代培养至P4代生长良好,经碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1扩增诱导的细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性,显示被诱导的骨髓基质干细胞具备软骨细胞特性.结论:应用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1体外可以诱导犬骨髓基质干细胞分化为软骨细胞,诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞.     

兔骨髓基质细胞体外培养的操作技术特征

目的:探讨原代细胞取材、分离方法及首次换液时间对体外培养兔骨髓基质细胞生长、增殖的影响。方法:实验于2004-01/06在山东中医药大学细胞学实验室完成。选择普通级4周龄雌性新西兰大白兔1只,抽取其两侧股骨大转子部骨髓液2mL,加入到盛有等体积Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中分离单个核细胞,进行首次提纯获取骨髓基质单细胞,置培养箱中培养传代,逐日在倒置显微镜下观察细胞生长情况。培养5d后,轻轻振荡培养瓶,吸除培养液,以后每两三天换液1次。继续传代。观察、记录、绘制细胞生长曲线并测定细胞群体贴壁及融合单层时间,观察细胞形态变化和生长增殖情况。在操作方法中注重了以下3点:①原代细胞培养取材于4～8周龄的新西兰大白兔。②分离方法采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞进行初次提纯获取骨髓基质细胞,消化时间不宜超过5min。在分离、纯化操作减少离心次数和时间,减少吹打和抽吸的次数,以避免对细胞的机械性损伤。③首次换液时间:选择在原代细胞接种后5d行初次换液比较合适。结果:①兔骨髓基质细胞体外培养生长增殖及形态变化:原代培养细胞接种后见大量悬浮呈圆形的细胞,轮廓清晰。24～36h后开始贴壁,呈不规则形态或呈类圆形或椭圆形。48～72h时呈集落生长,显示为短梭形或星形。4d时每个细胞集落中心部位细胞轮廓不清,体积较小,周边细胞呈细梭形,向周围呈辐射状排列。6d时贴壁细胞呈长梭形外观,部分区域融合成片。13～16d细胞融合单层,呈典型细长梭形外观,成集束状排列。传代细胞形态一周左右融合成单层。②第1代细胞生长曲线:从传代后第1天细胞数量开始增加,第4天增加幅度最大,至第6天细胞数量最大。以后数量略有下降。说明其潜伏期<24h,传代培养对数增殖期为2～5d,对数增殖期结束后,第6天细胞生长缓慢,进入平台期。由此可以得出细胞群体倍增时间约为24h。③第1代细胞贴壁率:传代细胞接种2h已有部分细胞贴壁,12h细胞基本贴壁完全,14h已有部分细胞开始增殖。传代细胞接种存活率为98%。④兔骨髓基质细胞镜下形态观察:苏木精-伊红染色可见骨髓基质细胞呈梭形、多角形等,有的有多个树状突起。胞浆呈细网状,淡红色略带蓝色,并见较多胞浆颗粒。细胞核清晰、深蓝色,位于中央,中间可见深染的数个点状染色质,可见分裂相。结论:取材于4～8周龄的新西兰大白兔的骨髓基质细胞采用密度梯度离心法培养传代,以原代细胞接种后5d行初次换液,在此体外培养条件模式下,兔骨髓基质细胞早期生长性状稳定,增殖速度快,适应性强,呈典型的成纤维细胞样外观,可连续观察10代以上仍具有以上特征,未出现明显衰老现象,适合用作骨组织工程学的种子细胞。     

与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较

背景:骨髓间充质干细胞体外转化很大程度上依赖于合适的培养条件。目的:比较与软骨细胞共培养和条件培养液2种不同的诱导方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点。方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞,采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养及条件培养液诱导成软骨的方法,诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。以MTT法及流式细胞仪检测细胞活性及周期,糖胺多糖、甲苯胺蓝以及免疫组化染色检测细胞生物学特性,以RT-PCR法检测诱导后的软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达情况。结果与结论:采用共培养方式诱导的软骨细胞,其生物学特性与采用条件培养液诱导的软骨细胞相比,前者优于后者,如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。提示共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞,更有利于作为组织工程软骨的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。目的:体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。方法:密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导(含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子110μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110μg/L、转铁蛋白6.25mg/L、地塞米松10mmol/L、维生素C0.05mmol/L),倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。结果与结论:培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达C...     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。方法：密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导（含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子110μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110μg/L、转铁蛋白6.25mg/L、地塞米松10mmol/L、维生素C0.05mmol/L）,倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达CD44,有2.62%的细胞表达CD45。骨髓间充质干细胞诱导后体外扩增能力明显降低,诱导21d后形态变化比较显著,Ⅱ型胶原阳性细胞较多。结果显示应用密度梯度离心法可成功分离并扩增骨髓间充质干细胞,第3代细胞纯度较高,在适当的条件下,具有分化为成软骨细胞的潜能。     

人骨髓基质干细胞的单细胞克隆培养与鉴定

背景：骨髓基质干细胞缺乏特异的表面识别分子,其鉴定一直是研究中的难题。目的：探索人骨髓基质干细胞培养条件,获得体外克隆化培养的成人骨髓基质干细胞,并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法：外科手术取髂骨术中抽取骨髓,采用密度梯度离心法初步分离骨髓基质干细胞,用极限稀释法进行克隆化培养;流式细胞仪对克隆化培养的骨髓基质干细胞进行细胞表面标志检测,并进行体外成软骨、成骨及心肌细胞诱导,免疫组织化学及RT-PCR检测成软骨、成骨及心肌细胞表达,确定其表型及分化潜能。结果与结论：单个细胞来源骨髓基质干细胞在体外1：3传代一般可以传28代左右,24代以前生长状态良好;经流式细胞仪检测,骨髓基质干细胞表达CD29,CD44,CD106,不表达CD14,CD34,CD45,HLA-DR;骨髓基质干细胞体外可向成骨、成软骨及心肌细胞分化,提示体外克隆化培养的骨髓基质干细胞能维持良好的成体干细胞生物学特性。     

细胞因子在体外诱导骨髓基质细胞向软骨细胞分化过程中的作用

背景:骨髓基质细胞持续稳定地向软骨细胞转化一过程中,物理、化学和生物等诸多因素均发挥着作用,某些因素的共同作用会更有利于细胞的转化,而转化生长因子β1和胰岛素样生长因子等均可诱导骨髓基质细胞向软骨细胞分化.目的:拟验证转化生长因子β1与胰岛素样生长因子在体外联合诱导犬骨髓基质细胞向软骨细胞分化的效果.设计、时间及地点:细胞观察,于2006-05/10在中山大学附属第三医院中心实验室完成.材料:清洁级12月龄雄性成年杂种犬1只,用于分离培养骨髓基质细胞.转化生长因子β1、胰岛素样生长因子I由美国Sigma公司生产.方法:自犬髂后嵴处抽取骨髓10mL,密度梯度法分离培养骨髓基质细胞,传至第3代,调整细胞密度为2×109L-1.诱导组向细胞内加入含10 μg/L转化生长因子β1、50 μg/L胰岛素样生长囚了I、50mg/L维生素C、10-7mol/L地塞米松、1%ITS-A、100U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM培养基.对照组仪加入含10%胎牛血清的高糖DMEM进行常规培养.主要观察指标:诱导后细胞形态学变化.诱导后组织化学及免疫组化检测结果.结果:与对照组比较,第3代骨髓基质细胞成软骨诱导48 h后能明显促进细胞集落生长,细胞增殖加快,但细胞形态无变化,仍为长梭形;诱导14 d后大部分细胞呈多角形或圆形,折光性增强.诱导后番红O染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性表达.结论:转化生长因子β1与胰岛素样生长因子I体外联合诱导可获得骨髓基质细胞源性软骨细胞.     

兔骨髓基质细胞的生物学特性及植入心肌后的存活状况

目的:观察兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,MSCs)的部分生物学特性及植入心肌后的存活状况。方法:密度梯度离心与贴壁粘附得到高纯度的兔下肢骨MSCs,建立体外培养体系,光镜、电镜、细胞周期等观察其生物学特性,4',6-二脒基-2-苯吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindone,DAPI)标记培养的MSCs,植入心肌后检测植入细胞在6周内不同时相点的存活状况。结果:体外培养的MSCs显示良好的贴壁扩增生长能力,88%的培养细胞为静止期细胞,96.4%细胞为活细胞,电镜证明培养细胞显示幼稚细胞的结构。标记的MSCs植入心肌后至少生存6周并且植入细胞扩散融合于植入区宿主心肌中。结论:体外培养的MSCs显示幼稚细胞形态,标记的培养MSCs植入心肌后可以长期存活并扩散融合于宿主心肌。     

骨髓基质细胞向软骨分化调控的研究进展

以往软骨组织工程中应用的种子细胞为成体软骨细胞,存在体外培养增殖能力有限且扩增后细胞容易老化的缺点.骨髓基质细胞是指骨髓基质内含有能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌细胞的前体细胞群,但软骨组织工程要求其单一向分化.所以对其定向诱导调控具有重要意义.在骨髓基质细胞向软骨诱导分化的过程中,各种生物诱导因子作为信号物质参与精细调节,已被证实的物理因素如生物力、超声波等可以和生物因子协同起到增强骨髓基质细胞形成软骨的作用.从组织修复的角度而言,体内软骨细胞微环境也是必不可少的.生物反应器是一种体外的组织培养装置.它将活体内取出的细胞或组织在模拟体内生理环境F进行孵育培养使之生长分化,现有的生物反应器主要是在原有细胞培养的基础上加以力学刺激以模拟关节软骨在体内的应力环境.     

三维支架中骨髓间充质干细咆及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景:软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现.目的:考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性.方法:抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增.取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例(10%,20%,50%,80%,100%)的胶原,透明质酸支架中,在无血清培养液中三维培养.2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况.结果与结论:种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱.结果提示,在同样条件下骨髓问充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能.     

三维支架中骨髓间充质干细胞及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景：软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现。目的：考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性。方法：抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增。取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例（10%,20%,50%,80%,100%）的胶原/透明质酸支架中,在无血清培养液中三维培养。2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况。结果与结论：种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱。结果提示,在同样条件下骨髓间充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能。     

Effect of stromal cells of the bone marrow on hematopoiesis in culture

The authors studied the effect of medullary fibroblasts on granulomonocytopoiesis in a semi-solid agar gel. Seventy-three untreated patients with the blood system diseases and 18 hematologically healthy subjects were entered into the study. The medium conditioned with fibroblasts and fibroblasts themselves are capable of stimulating granulomonocytopoiesis. In addition, fibroblasts can exert an inhibitory effect on granulomonocytopoiesis, with the degree of this effect being dependent on the agar layer thickness. Patients with chronic lympholeukemia and acute lymphoblastic leukemia showed a decrease in the stimulating activity of fibroblasts, whereas in patients with chronic myeloleukemia, that activity was elevated. In patients with neutropenic conditions, the stimulating activity of fibroblasts depended on a factor that produced neutropenia. The role of the alterations in question in the pathogenesis of the blood system diseases and other possible influences of fibroblasts on myelopoiesis are discussed.     

兔骨髓源性神经干细胞分化为成熟神经元样细胞的特征研究

目的:探讨兔骨髓源性神经干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)经体外培养及诱导分化成的神经元样细胞,能否合成分泌5-羟色胺神经生物活性物质成分。方法:分离兔BMSCs,应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化,免疫细胞化学鉴定;并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其5-羟色胺生物活性物质的含量。细胞培养所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸。结果:BMSCs培养12d可见大而圆细胞,免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性;培养20d可见长突起神经元样细胞,神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性,高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液及L-02肝细胞阴性对照组未测到5-羟色胺生物活性物质,经体外培养增殖14d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20d的神经元样细胞及培养液则可检测到5-羟色胺分别为:每1×107细胞中(1.7940±0.0095),(4.010±0.1170)μg/L,差异有非常显著性意义(t=30.6323,P=0.001)。方差分析显示:随着骨髓基质细胞培养天数的增加,其所含的5-羟色胺浓度也渐增加,组间5-羟色胺含量差异有显著意义(P<0.01)。结论:兔BMSCs能在体外增殖,并表达Nestin抗原;而且,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,并表达成熟神经元特异性核蛋白,合成、分泌5-羟色胺神经递质。