幽门螺杆菌疫苗抗原的研究进展

幽门螺杆菌疫苗可能是防治幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的有效途径,而有效疫苗抗原的研制是关键和基础,本文综述了幽门螺杆菌疫苗尤其是各种保护性疫苗抗原的研究进展。     

幽门螺杆菌疫苗保护性抗原的研究进展

自Ｗａｒｒｅｎ和Ｍａｒｓｈａｌｌ于 1983年首次发现幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ)以来 ,经过近 2 0年全球性的研究 ,世界卫生组织已将其列为一类致癌因子〔1〕。目前全球近 5 0 %的人口感染了Ｈｐ ,在发展中国家 ,其感染率可高达 70 %以上。然而 ,对于Ｈｐ的抗感染治疗尚存在较大问题。使用单剂药物根除率低 ,使用多联药物又造成费用太高 ,有效率也不太高 ,而且不能有效阻止Ｈｐ的再次感染和复发。此外 ,耐药菌株的增加也使抗Ｈｐ治疗面临越来越复杂的难题。因而 ,Ｈｐ疫苗已成为防治Ｈｐ感染最有效的途径。美…     

幽门螺杆菌1pp20基因的克隆与表达

目的 克隆及表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori)lpp20基因，为探索高效的防治幽门螺杆菌感染的疫苗抗原和诊断抗原奠定基础。方法 用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp20基因片段，将目的基因插入的表达载体pMAL-C2X中，用重组质粒转化大肠杆菌（E.coli TB1），并在E.coli TB1中进行表达。用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果 用PCR方法扩增的lpp20基因长度约为540bp；经酶切、PCR和测序分析，插入到载体的基因片段与文献报道的基因序列一致；SDS-PAGE的结果显示，目的基因表达产物的相对分子质量为18kDa，融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的34%。结论 本研究中构建的pAML-C2X与lpp20基因重组质粒在E.coli TB1中能够高效表达目的基因。该重组子的构建为幽门螺杆菌lpp20基因的研究建立了重要的基础。     

幽门螺杆菌疫苗保护性抗原研究现状及展望

幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ,简称Ｈｐｙｌｏｒｉ)是目前发现的唯一能在人胃内定植、生存的细菌。Ｈｐｙｌｏｒｉ感染在世界范围内广泛流行 ,尤其在发展中国家 ,成年人Ｈｐｙｌｏｒｉ感染率高达 80～ 90 %。已证实Ｈｐｙｌｏｒｉ感染是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病因[1- 4] ,与胃癌和胃ＭＡＬＴ淋巴瘤的发病也有密切关系[5,6 ] 。目前 ,主要应用抗生素和质子泵抑制剂来治疗Ｈｐｙｌｏｒｉ,但广泛应用抗生素会导致耐药菌的不断增多[7,8] ,且价格昂贵 ,复发的机会也较大 ,不易被病人接受。因此 ,要在世界范围内完全根…     

幽门螺杆菌基因hpaA克隆、融合表达和鉴定

目的克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA,构建幽门螺杆菌hpaA基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据。方法利用PCR技术从H.pylori郑州分离株MEL-HP27染色体DNA上扩增出hpaA基因,序列分析后,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coliTB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果用PCR方法扩增的hpaA基因长度为783bp,编码260个氨基酸,经酶切鉴定和测序,插入到克隆载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为29kDa,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%。结论本研究成功构建了hpaA基因与麦芽糖结合蛋白基因融合原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础。     

幽门螺杆菌过氧化氢酶基因的克隆、高效表达及活性评价

目的：构建高效表达幽门螺杆菌（Hp）过氧化氢酶重组蛋白的候选菌株并测定其活性。方法：用PCR方法从Hp染色体DNA上扩增过氧化氢酶基因，将其定向插入表达pET-22b(＋），并在BL21（DE3）大肠杆菌中表达，进一步利用贝尔斯－西策尔斯法测定其活性。结果：DNA序列分析表明，所克隆的过氧化氢酶基因序列与基因库公布的一致。在37℃诱导表达3h后，过氧化氢酶重组蛋白表达量占苗体总蛋白的24．4％，并显示了良好的活性。结论：本研究获得了表达高活性Hp过氧化氢酶的克隆，为深入研究其相关功能奠定了良好基因。     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的应用基因工程方法构建表达幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的菌株．方法用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ上扩增出ＵｒｅＢ基因片段,将其克隆至ｐＳＫ（＋）质粒上,然后插入原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达．结果经测序ＵｒｅＢ片段有１７０７ｂｐ组成,为编码５６９个氨基酸残基的多肽．ＳＤＳＰＡＧＥ和免疫印迹分析检测发现,ＵｒｅＢ基因表达的蛋白质分子质量为６５０００Ｕ,并证实该重组蛋白质可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别,同时将其免疫小鼠可刺激机体产生抗该重组蛋白质的抗体．结论重组的ＵｒｅＢ可以作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗．     

人幽门螺杆菌VacA与HspA双价候选疫苗抗原的克隆表达及鉴定

目的　构建含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A(HspA)和细胞空泡毒素 (VacA)编码基因的重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,并在E coliBL2 1中表达 ,研究其抗原性 ,为疫苗的开发奠定基础。方法　利用分子克隆技术从HpDNA染色体中 ,扩增HspA、VacA编码基因片段 ,将目的基因HspA、VacA与载体 pET32a(+)分别进行双酶切后 ,连接、测序 ;同时将重组载体 pET32a(+) /HspA和 pET32a(+) /VacA分别经Xhol、BamHⅠ双酶切 ,通过凝胶电泳回收 pET32a(+) /HspA和VacADNA片段 ,经T4连接酶将HspA和VacA编码基因通过酶切粘端进行连接 ,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体 ,并在大肠杆菌BL2 1中表达 ,表达产物经纯化后 ,以Westernblot法检测其抗原性。结果　经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为HpHspA和VacA编码基因 ,由 10 80bp组成 ,与GenBank报道的相比较 ,本实验克隆的基因有 3 4 0 %的碱基发生变异 ,导致 1 10 %的氨基酸残基改变 ;经SDS -PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr为 5 9× 10 3 ,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为 2 0× 10 3 ,可溶性表达产物占全菌总蛋白的 18 96 % ;重组蛋白经Ni2 + -NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达95 %以上 ;用Westernblot法检测显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别 ,具有良     

幽门螺杆菌脂蛋白基因的重组表达和免疫活性鉴定

目的制备幽门螺杆菌(Hp)Lpp20重组蛋白(rLpp20),鉴定其免疫活性,为Hp疫苗和免疫诊断研究提供候选抗原。方法采用基因克隆技术将Hplpp20基因克隆到表达载体pMAL-c2X中,用重组质粒转化E.coliTB1。采用IPTG诱导lpp20基因与麦芽糖结合蛋白(Maltose binding protein,MBP)基因融合表达,用多糖树脂亲和层析方法纯化表达的融合蛋白(MBP-rLpp20)。将MAP-rLpp20用蛋白因子FactorXa酶切,得到不带MBP的rLpp20。分别用MAP-rLpp20、rLpp20和Hp全菌抗原免疫小鼠,用Western blot检测MBP-rLpp20和rLpp20的抗原活性。结果表达的MBP-rLpp20的相对分子质量为60×103,表达量占菌体总蛋白的34.1%,占可溶性蛋白的14.2%。经酶切和纯化得到的rLpp20的相对分子质量为15×103。纯化制备的MBP-Lpp20和rLpp20的纯度分别为90.4%和91.2%,且与相应免疫小鼠血清及Hp全菌抗原免疫小鼠血清均能发生阳性反应。结论该研究成功制备了纯度较高的MAP-Lpp20和rLpp20蛋白;这两种重组蛋白均具有免疫活性,对Hp疫苗和免疫诊断研究具有应用价值。     

幽门螺杆菌黏附素基因alpA的克隆及序列分析

目的　获取幽门螺杆菌黏附素基因alpA ,并将它克隆到质粒 pET - 2 2b(+)中进行核苷酸序列分析。 方法　利用PCR技术扩增alpA ,并将其定向插入pET - 2 2b(+)载体中通过DNA序列分析仪进行核苷酸分析。 结果　DNA序列分析表明 ,所克隆的alpA基因序列与GenBank公布的基本一致。 结论　本研究获得了序列正确的alpA基因 ,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。     

血清可溶性幽门螺杆菌抗原测定

目的　测定血清可溶性幽门螺杆菌抗原（ＳＨｐ） 并评价其意义。方法　采用双抗体夹心式酶免疫测定法。结果　６６ 例幽门螺杆菌（Ｈｐ） 感染患者血清ＳＨｐ 含量为８４９．４ ±３８３ ．３μｇ／Ｌ（－ｘ ±ｓ,下同）,阳性率为９０．９１％ ,显著高于２８ 例阴性对照组１９．４±６．２μｇ／Ｌ,阳性率为０％ （Ｐ值均＜ ０．００１） 。１６例Ｈｐ 阳性患者治疗前ＳＨｐ 为６２７ ．１±２１７ ．８μｇ／Ｌ,治疗后为１５．６ ±７．６μｇ／Ｌ（ Ｐ＜ ０ ．００１） 。且ＳＨｐ 含量与Ｈｐ 感染菌量呈正比。结论　本方法操作简单,成本低廉,弥补了现有Ｈｐ 感染诊断方法的不足,可用于临床。     

Construction of a recombinant attenuated Salmonella typhimurium DNA vaccine carrying Helicobacter pylori hpaA

AIM: To construct a recombinant attenuated Salmonella typhimurium DNA vaccine carrying Helicobacter pylori hpaA gene and to detect its immunogenicity. METHODS: Genomic DNA of the standard H pylori strain 17 874 was isolated as the template, hpaA gene fragment was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into pUCmT vector. DNA sequence of the amplified hpaA gene was assayed, then doned into the eukaryotic expression vector pIRES through enzyme digestion and ligation reactions. The recombinant plasmid was used to transform competent Escherichia coliDH5α, and the positive clones were screened by PCR and restriction enzyme digestion. Then, the recombinant pIRES-hpaA was used to transform LB5000 and the recombinant plasmid isolated from LB5000 was finally used to transform SL7207. After that, the recombinant strain was grown in vitro repeatedly. In order to identify the immunogenicity of the vaccine in vitro, the recombinant pIRES-hpaA was transfected to COS-7 cells using Lipofectamine~(TM)2000, the immunogenicity of expressed HpaA protein was detected with SDS-PAGE and Western blot. RESULTS: The 750-base pair hpaA gene fragment was amplified from the genomic DNA and was consistent with the sequence of H pylori hpaA by sequence analysis. It was confirmed by PCR and restriction enzyme digestion that H pylori hpaA gene was inserted into the eukaryotic expression vector pIRES and a stable recombinant live attenuated Salmonella typhimurium DNA vaccine carrying H pylori hpaA gene was successfully constructed and the specific strip of HpaA expressed by pIRES-hpaA was detected through Western blot. CONCLUSION: The recombinant attenuated Salmonella typhimurium DNA vaccine strain expressing HpaA protein with immunogenicity can be constructed and it may be helpful for further investigating the immune action of DNA vaccine in vivo.     

幽门螺杆菌感染对胃上皮细胞凋亡及调节基因表达的影响

目的 探讨幽门螺杆菌（Ｈｐ）感染对胃上皮细胞凋亡及调节蛋白表达的影响。方法 应用原位末端标记法及免疫组织化学技术对３７例ＨＰ阳性慢笥胃炎和３１例ＨＰ阴性慢性胃炎胃黏膜上皮细胞凋亡指数及Ｐ５３、ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｆａｓ蛋白表达进行观察和比较。结果 ＨＰ阳性慢性胃炎胃上皮细胞凋亡指数显著高于ＨＰ阴笥慢性胃炎（Ｐ〈０．０１）,ＨＰ阳性慢性胃上皮Ｐ５３表达显著高于ＨＰ阴性高于ＨＰ阴性慢性胃炎（Ｐ〈０．０     

Time-series gene expression prof iles in AGS cells stimulated with Helicobacter pylori

AIM: To extend the knowledge of the dynamic interaction between Helicobacter pylori (H. pylori) and host mucosa. METHODS: A time-series cDNA microarray was performed in order to detect the temporal gene expression prof iles of human gastric epithelial adenocarcinoma cells infected with H. pylori. Six time points were selected to observe the changes in the model. A differential expression prof ile at each time point was obtained by comparing the microarray signal value with that of 0 h. Real-time polymerase ...     

幽门螺杆菌临床菌株2148 bp的cagA基因片段克隆、表达及免疫性鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)临床菌株的cagA基因片段 ,构建原核表达系统 ,鉴定重组表达产物的免疫原性。方法　由于cagA基因核苷酸序列变异较大 ,选择序列相对稳定的 2 14 8bp为目的片段 (cagA1)。采用高保真PCR扩增幽门螺杆菌临床分离菌株Y0 6中的目的片段cagA1,T -A克隆后测序。构建 pET32a的cagA1片段表达载体 ,在E coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达。采用Ni-NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白 (rCagA1)。采用Hp全菌抗体的Westernblot鉴定rCagA1免疫反应性 ,免疫双扩散试验鉴定rCagA1免疫家兔的抗血清效价。 结果　PCR获得预期大小的目的扩增条带。与文献报道比较 ,克隆的cagA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 94 83%和93 30 %。所构建的原核表达系统 pET32a -cagA1-E coliBL2 1DE3目的重组蛋白 (rCagA1)表达量为细菌总蛋白的 30 %左右。Westernblot证实rCagA1能与Hp全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rCagA1血清的免疫双扩散效价为 1∶4。结论　本文成功地构建了HpcagA基因片段cagA1的高效原核表达系统 ,所表达的rCagA1具有良好的免疫原性和免疫反应性 ,为进一步研制cagA及其抗体检测试剂盒奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆与重组基因的表达

目的：获得大量纯化的尿素酶Ｂ蛋白,为下一步的幽门螺杆菌疫苗研制作准备。方法：采用ＰＣＲ方法克隆尿素酶Ｂ基因,利用基因工程技术进行基因重组,构建表达工程菌。结果：通过对载体、培养条件的优化选择,实现了尿素酶Ｂ编码基因在大肠杆菌中的高效表达。结论：克隆到的尿素酶Ｂ编码基因和表达的蛋白,其氨基酸序列与文献报道一致。