红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

丹参转录因子SmbHLH93的克隆及表达模式分析

目的 克隆丹参碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类转录因子SmbHLH93,并初步探究该基因的功能.方法 采用PCR和RT-PCR技术分别从DNA和cDNA水平克隆得到了SmbHLH93基因,进一步通过BD Walking获得了该基因的5'启动子区.生物信息学分析SmbHLH93蛋白的理化性质、结构特点和系统进化关系.结合启动子区分析软件和qPCR,研究SmbHLH93在丹参不同部位和环境诱导下的表达模式.结果 获得SmbHLH93基因序列954 bp和5'启动子区1 583 bp,其中开放阅读框(ORF)657 bp,有3个内含子和4个外显子,编码218个氨基酸,含有bHLH和ACT_UUR-ACR-like结构域,无跨膜区域,可能定位于细胞核.表达模式分析结果显示该基因的表达量在根中最高,茎中最低,且随着花的形成逐渐降低.光和低温诱导SmbHLH93的高表达,而水杨酸(SA)抑制其表达.结论 克隆得到丹参bHLH类转录因子新成员SmbHLH93,初步预测其参与了丹参花的发育过程和丹参次生代谢途径的调控.     

雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR),以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后0~72 h TwMCT基因的相对表达量。克隆得到全长1318 bp TwMCT全长cDNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件。     

穿心莲糖苷水解酶基因ApGH的克隆、生物信息学分析及表达研究

目的 对穿心莲糖苷水解酶（ApGH）基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达和相对表达量分析。方法 取穿心莲新鲜叶片,提取RNA并反转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA）作为模板,以穿心莲转录组中筛选到的糖苷水解酶ApGH基因开放阅读框（ORF）设计特异性引物,进行聚合酶链式反应（PCR）扩增,经测序后获得的基因序列利用生物信息学软件预测基因编码蛋白特征,构建原核表达载体在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白质,并利用实时荧光定量PCR分析ApGH基因的表达模式。结果 克隆所得ApGH基因的ORF全长1734 bp,编码577个氨基酸（GenBank登录号：OR887606）。ApGH为稳定亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,属于糖苷水解酶家族;系统进化分析表明,ApGH归属于GH1家族。将ApGH基因构建到原核表达载体HIS-MBP-pET28a上,在大肠埃希菌Transetta（DE3）中成功表达出重组蛋白质。实时荧光定量PCR检测结果表明,ApGH基因在叶中表达量最高,茎和根中表达量较低。结论 克隆得到穿心莲ApGH基因并对其蛋白质序列特征进行了系统分析,证明其在大肠埃希菌中成功表达重组蛋白质,且主要在穿心莲叶中表达。研究结果为进一步探索穿心莲糖苷水解酶的催化功能提供了依据。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

铁皮石斛镁离子转运蛋白基因的克隆及表达分析

目的 克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛镁离子转运蛋白(magnesium transporter,MGT)基因(DoMGT1)并进行生物信息学和表达分析.方法 采用RT-PCR和RACE技术,获得基因cDNA全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特征;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助实时定量PCR(qPCR)检测基因表达模式.结果 克隆到DoMGT1(GenBank注册号KJ995532),cDNA全长1 625 bp,编码一条由425个氨基酸组成的肽链,相对分子质量47 400,等电点4.79;DoMGT1蛋白含有CorA家族镁离子转运蛋白保守结构域(313～420)和镁离子转运蛋白MRS2/LPE10保守域(27～420);DoMGT1与多种植物MGTs基因一致性为46%～63%,编码蛋白与水稻OsMGTD、OsMGTE、OsMGTF等聚在一起,与AtMGT4共同构成植物MGTs基因的一大类群;DoMGT1基因转录本在石斛根、茎、叶器官中为组成型表达,叶中相对表达量较高,为根中的3.46倍;茎次之,为根的1.54倍.结论 成功克隆到一个镁离子转运蛋白基因DoMGT1,其转录本在叶中高的表达特征暗示该基因可能在铁皮石斛叶的生长发育中发挥重要作用.     

雷公藤乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA克隆及表达分析

研究根据雷公藤悬浮细胞转录组数据库设计引物,对雷公藤悬浮细胞乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase)基因TwAACT进行全长cDNA(GeneBank:KP297934)克隆以及生物信息学分析和基因表达分析。克隆得到TwAACT cDNA全长为1 704 bp,编码405个氨基酸,等电点为6.10,相对分子质量为41.20 kDa,在线预测表明TwAACT具有2个催化活性位点。雷公藤悬浮细胞经茉莉酸甲酯(MeJA)外源诱导后,通过荧光定量PCR表明,TwAACT相对表达量明显增加,在24 h达到最高。研究首次克隆得到雷公藤AACT基因,为进一步阐述雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。     

珊瑚菜抗盐相关基因GlERF11克隆与盐胁迫表达分析＊

目的 鉴定珊瑚菜抗盐基因GlERF11并分析其在盐处理下的表达量变化。方法 对GlERF11基因进行全长克隆以及生物信息学分析，使用荧光定量PCR方法对GlERF11基因进行定量表达分析。结果 GlERF11基因cDNA全长1019 bp，开放阅读框全长537 bp，编码178个氨基酸。生物信息学分析显示，GlERF11蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构域，相对分子质量为19710.95 Da，包含AP2超家族保守结构域。系统进化树分析显示，GlERF11蛋白与伞形科植物胡萝卜ERF11蛋白亲缘关系较近。荧光定量分析显示，珊瑚菜幼苗的GlERF11基因受盐胁迫影响后表达量均有所提高，处理后12 h变化最为显著。结论 本研究针对珊瑚菜抗盐相关基因GlERF11开展生物信息学分析，研究为珊瑚菜品种改良以及育种提供了重要的理论基础与思路。     

温郁金法呢基焦磷酸合酶（CwFPPS）基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

目的 克隆温郁金Curcuma wenyujin萜类生物合成中的限速酶法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）的全长cDNA序列。方法 根据温郁金转录组数据设计特异引物，PCR扩增FPPS全长cDNA序列并对其进行生物信息分析；构建"基因-GFP"融合表达载体，利用农杆菌介导烟草叶片进行亚细胞定位分析；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因在植物组织中的特异性表达。结果 温郁金CwFPPS基因全长1196 bp，包含1个长为1071 bp的开放阅读框，编码356个氨基酸，GenBank登入号为MT489462；CwFPPS编码蛋白属于类异戊二烯生物合成酶超级家族（C1）成员，包含5个保守的功能域，其中2个是富含天冬氨酸（DDXXD）的活性中心；亚细胞定位显示该蛋白位于泡质、细胞膜或细胞核上。qRT-PCR分析表明，CwFPPS基因在根茎中特异表达，相对表达水平是叶片中的13.7倍。结论 克隆获得的温郁金CwFPPS基因全长及其特异表达信息，可为后续进行基因功能鉴定及倍半萜成分的代谢工程研究提供依据。     

铁皮石斛丙酮酸激酶基因的克隆与表达分析

目的 克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）基因（DoPK）,并进行生物信息学分析以及检测基因在不同器官中的表达情况。方法 采用RACE技术获得基因的全长cDNA;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助r实时荧光 (real-time quantitative) PCR (RT-qPCR)分析基因在不同器官中的表达情况。结果 克隆获得DoPK（GenBank注册号KC178572）的cDNA全长1 895 bp,编码一条由511个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为55 040,等电点7.00;DoPK基因与江南卷柏、拟南芥、马铃薯和葡萄等植物的PK基因有71%、86%、89%和91%的相似性;DoPK蛋白包含保守的丙酮酸激酶结构域（21～497）和活性位点（235～247）;DoPK属于胞质型的CYTOSOLIC-1亚类,与单子叶植物亲缘关系较近;DoPK基因为组成型表达,其转录本在石斛茎中的相对表达量较高,为叶中的2.29倍,根中次之,为叶中的1.28倍。结论 克隆了胞质型的铁皮石斛DoPK基因的全长cDNA序列,为进一步研究其在铁皮石斛生长发育中的作用奠定基础。     

牛樟芝鲨烯环氧酶基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆牛樟芝三萜合成途径中鲨烯环氧酶基因(AcSE),并进行生物信息学和表达差异分析。方法以牛樟芝菌丝体cDNA为模板,利用快速末端扩增(RACE)进行AcSE序列扩增,利用生物信息学分析AcSE基因的理化性质并预测其蛋白二级结构、三级结构及其功能;同时利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)测定不同培养时间的液体牛樟芝菌丝体及子实体中AcSE基因的表达情况。结果 AcSE的cDNA全长1 446 bp(Gen Bank编号:KT070558),编码481个氨基酸,相对分子质量为53 300,等电点为6.36。结构域分析表明AcSE内含3个跨膜的结构域,无卷曲螺旋结构,且疏水区和亲水区交替存在。AcSE的g DNA全长为1 607 bp,含4个外显子和3个内含子。AcSE在液体培养7 d的牛樟芝菌丝体中表达量最高,为子实体的7.89倍,且随着培养时间的延长逐渐下降。结论首次从牛樟芝中克隆了AcSE基因,为进一步阐明该基因在牛樟芝三萜合成途径中的作用奠定基础。     

白木香AsNINJA1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的茉莉酸甲酯诱导表达

目的 克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis互作蛋白(jasmonate Zim-domain,JAZ)基因(NINJA),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法 以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆白木香NINJA基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)处理的白木香愈伤组织中AsNINJA1基因的表达模式。结果 获得白木香NINJA基因全长cDNA,命名为AsNINJA1。序列分析表明,该基因的序列全长为1 982 bp,包含一个1 221 bp的开放阅读框,编码406个氨基酸,蛋白质相对分子质量为43 697,等电点为6.02。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理4 h后AsNINJA1基因相对表达量最高,是对照(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的近100倍,随后显著下降。结论 获得AsNINJA1基因全长cDNA序列,该基因对MeJA诱导极为敏感,且能在伤害早期响应。     

洋常春藤鲨烯合成酶基因HhSS的克隆与表达分析

目的克隆获得洋常春藤Hedera helix鲨烯合成酶基因(HhSS)cDNA全长序列并进行生物信息学分析及表达分析。方法根据洋常春藤转录组数据信息设计引物,通过RACE克隆方法获得HhSS基因序列;采用DNAMAN、PROTPARAM、TMHMM、PSORT、Scan Prosite、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学工具分析序列信息及编码蛋白的理化特性、结构域等特征;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术进行HhSS基因的检测分析。结果 RACE克隆获得HhSS(Gen Bank登录号KX056078)基因cDNA序列全长1 889 bp,包含一个从248~1 477 bp的完整开放阅读框(ORF)以及247 bp的5’非编码区(5’UTR)和412 bp的3’非编码区(3’UTR)。该基因编码409个氨基酸,相对分子质量为46 800,等电点为5.68。HhSS蛋白具有植物SS蛋白的特征结构域和跨膜区,与刺五加、人参等同科植物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明洋常春藤叶片中HhSS基因的相对表达量与常春藤皂苷含量存在正相关性。结论洋常春藤HhSS基因的成功克隆及表达分析研究,为阐明HhSS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的作用及代谢调控研究提供理论依据和技术基础。     

调控红花类黄酮合成MYB转录因子基因克隆及表达分析

目的在红花Carthamus tinctorius中克隆调控类黄酮合成的MYB转录因子基因,通过序列及表达分析初步鉴定参与调控类黄酮合成的MYB转录因子基因。方法对已报道调控类黄酮合成MYB转录因子进行序列比对,设计简并引物克隆核心序列,采用RACE技术克隆MYB转录因子基因全长,利用生物信息学方法分析基因序列,采用半定量PCR分析基因在红花不同组织及不同花期的表达情况。结果克隆得到3个调控类黄酮合成候选MYB转录因子基因,命名为CtFRMYB1、CtFRMYB2及CtFRMYB3。序列全长分别为1 223、1 080、1 348 bp,蛋白质相对分子质量分别为17 878.15、28 766.45、27 987.89。序列分析表明3个转录因子都具DNA结合功能,属MYB转录因子家族。进化分析表明CtFRMYB1和CtFRMYB2同AtMYB12关系较近。表达分析表明CtFRMYB1和CtFRMYB2仅在花中表达且在花期3(开花第3天)表达量较高。结论成功克隆3个调控类黄酮合成候选MYB转录因子基因CtFRMYB1、CtFRMYB2及CtFRMYB3,经生物信息学及表达分析初步鉴定到2个调控红花类黄酮合成MYB转录因子基因CtFRMYB1及CtFRMYB2,为红花类黄酮合成的调控机制研究奠定基础。     

卷叶贝母环阿屯醇合成酶基因的克隆及表达分析

目的对卷叶贝母Fritillaria cirrhosa中参与生物碱合成的关键酶环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)基因进行克隆,并对其进行生物信息学和表达分析。方法基于转录组测序结果,通过PCR技术克隆卷叶贝母CAS基因(FcCAS)开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,并基于在线工具对cDNA序列进行生物信息学分析。通过荧光定量(q RT-PCR)手段检测FcCAS在野生鳞茎与愈伤组织(通过激素组合刺激获得的组织培养物)中的表达情况并测定总生物碱的含量。结果 FcCAS编码区ORF长为2 271 bp,编码756个氨基酸,并与NCBI上公布的天门冬、芭蕉、油棕等植物CAS蛋白的相似性达80%以上;qRT-PCR与总生物碱含量测定实验表明FcCAS的表达水平与总生物碱含量的变化趋势一致,都是愈伤组织高于野生鳞茎。结论 FcCAS在不同组织状态下表达量差异较大,FcCAS是一个有生物学功能的蛋白质,受激素组合诱导表达,为进一步研究CAS对卷叶贝母生物碱含量的影响和表达调控奠定基础。     

白木香JAZ1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的伤害诱导表达分析

目的克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis茉莉酸(JA)信号途径核心抑制蛋白基因(jasmonate-zim-domain protein,JAZ),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆JAZ基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qR T-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)和机械伤害处理的白木香愈伤组织中JAZ基因的表达模式。结果获得白木香JAZ基因全长cDNA,命名为AsJAZ1,GenBank登录号为KP677281。序列分析表明,该基因的序列全长为1507 bp,包含一个990 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸,蛋白质相对分子质量为34280,等电点为6.89。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理0.5 h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的27倍,随后显著下降;经机械处理2h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经机械处理的白木香愈伤组织)的17倍,随后又快速降低,到24h基本恢复正常。结论获得AsJAZ1基因全长cDNA序列,该基因对伤害诱导极敏感,且能在伤害早期响应。     

丹参中转录因子SmMYB87基因的克隆、亚细胞定位和表达分析

目的克隆丹参Salvia miltiorrhiza中第14亚群R2R3 MYB转录因子基因SmMYB87的全长序列,并对其进行生物信息学和表达分析。方法以丹参总RNA为模板,利用同源克隆和c DNA快速扩增(RACE)技术获得SmMYB87 cDNA全长序列。运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析,利用q RT-PCR测定SmMYB87在各器官中的表达并构建融合表达载体pTF-486-SmMYB87分析SmMYB87蛋白的亚细胞定位。结果 SmMYB87基因含有2个内含子和1个732 bp的开放阅读框(ORF),编码243个氨基酸。该基因在根、茎、叶和花中均有表达,且4个器官中的表达量没有显著差异。SmMYB87蛋白在细胞核和细胞膜上均有分布。结论 SmMYB87的序列结构和表达分析为进一步研究其在丹参中的生物学作用奠定了理论基础。     

马蓝色氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

目的 克隆马蓝Baphicacanthus cusia吲哚类生物碱合成途径的色氨酸合成酶（tryptophan synthase,TSB）基因,命名为BcTSB（GenBank登录号AYM45644.1）,对其生物信息学和表达进行分析。方法 基于前期马蓝转录组数据库,获得BcTSB基因开放阅读框（ORF）,运用生物信息学手段对基因功能做出初步预测,构建pET32a-BcTSB原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测马蓝不同组织（根、茎、叶）中TSB表达水平。结果 克隆的BcTSB基因ORF长度为1 452 bp,编码483个氨基酸,生物信息学预测为亲水性蛋白,定位于叶绿体,该蛋白相对分子质量为51 665.89,pET-32a载体包含18 000的标签。SDS-PAGE分析在70 000处出现目的蛋白条带,与理论预期值大小一致。qRT-PCR分析显示BcTSB基因在马蓝不同组织中均有表达,且在茎中的表达量最高。结论 通过对BcTSB基因的克隆及表达分析,为进一步研究该基因功能及调控奠定了实验基础。     

温郁金中茉莉酸氨基酸合酶关键基因JAR的克隆及生物信息学分析

目的 克隆温郁金茉莉酸氨基酸合酶关键基因JAR(JA-amino acid synthetase)的全长c DNA序列,并进行生物信息学和表达分析。方法 根据温郁金转录组数据设计特异性引物。以温郁金根茎的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增获得JAR全长c DNA序列,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的特征;利用ClustalW和MEGA 6.06软件构建温郁金JAR的系统进化树;构建原核表达载体PET-22B(+)-JAR,纯化重组蛋白JAR5,并进行鉴定。结果 扩增后的基因编码582个氨基酸,全长1749 bp,且具有典型的GH3特征结构域,不具跨膜域,不存在信号肽,属于不稳定蛋白;PCR扩增后得到约1 800 bp大小的片段,经凝胶过滤色谱纯化,最终得到基于蛋白印迹实验(Western blotting)验证正确的66 200大小的重组蛋白。结论 首次克隆并分析了温郁金JAR基因,纯化了JAR5蛋白,为进一步研究温郁金JAR基因蛋白功能研究提供依据。