TNFR1／RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义

【目的】构建肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）膜外部分和核转录因子NF-κB受体激动剂（RANK）跨膜及膜内部分相结合的嵌合体，探讨其在破骨细胞（OC）分化中的意义。【方法】克隆TNFR1／RANK嵌合体的cDNA，用plat E将其包装成逆转录病毒。通过感染将这种逆转录病毒转染到敲除TNFRl／R2基因的小鼠（TNFR1-／R2-）骨髓巨噬细胞（BMM）中；用TNFQ刺激，分别观察OC的分化及骨的重吸收能力；用Western Blot方法证实TNFR1／RANK是通过NF-κB、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能。【结果】在TNFa刺激下，BMM能分化成OC，而且分化出的OC能明显地导致骨质破坏。TNFQ刺激BMM5min后磷酸化的NF-κB、JNK、P38和ERK蛋白的表达明显增强。【结论】TNFR1／RANK嵌合体具有完整的分子结构和生物功能，可作为研究RANK结构、功能及其信号途径的一个简便、有效的生物工具。     

调节破骨细胞分化的RANK特异性cDNA片段的研究

【目的】在生理条件下寻找调节破骨细胞（OC）分化的核转录因子NF-κB受体激动剂（RANK）的特异性cDNA功能片段,为研究OC分化机制提供理论基础。【方法】先将RANK膜内部分的1.2kb大小的cDNA分成20个片段,用缺失突变的方法构建出20个由肿瘤坏死因子受体1和RANK跨膜和膜内部分组成的TNFR1/RANK嵌合体的突变体,每一个突变体在RANK膜内部分含60bp缺失。再将RANK-cDNA第1561～1680bp之间的120bp片段分为10个片段,构建10个新的TNFR1/RANK突变体,每一个突变体在其RANK膜内部分含12bp缺失。用包装细胞PlatE分别将各突变体包装成逆转录病毒,通过感染分别将这些逆转录病毒转染到肿瘤坏死因子受体1和2基因敲除小鼠的骨髓巨噬细胞（BMM）中。用TNFɑ刺激后、观察哪一个突变体不能诱导OC形成。【结果】首先发现表达TNFR1/RANK^1561-1620或TNFR1/RANK^1621-1680的逆转录病毒感染的BMM不能分化成OC,然后在RANK-cDNA第1561～1680bp这个大的片段中又发现表达TNFR1/RANK^1597-1608、TNFR1/RANK^1609-1620、TNFR1/RANK1621-1632或TNFR1/RANK^1633-1644的逆转录病毒感染的BMM也不能分化成OC。【结论】RANK-cDNA第1597～1644bp之间的48bp片段（5′-gggcaggtgatgaacttcaagggtgacatcatcgtggtgtatgtcagc-3′）对OC形成起决定性作用。     

调节破骨细胞分化的RANK特异性cDNA片段的研究

【目的】 在生理条件下寻找调节破骨细胞(OC)分化的核转录因子NF-κB受体激动剂(RANK)的特异性cDNA功能片段,为研究OC分化机制提供理论基础。【方法】 先将RANK膜内部分的1.2 kb大小的cDNA分成20个片段,用缺失突变的方法构建出20个由肿瘤坏死因子受体1和RANK跨膜和膜内部分组成的TNFR1/RANK嵌合体的突变体,每一个突变体在RANK膜内部分含60 bp缺失。再将RANK-cDNA第1 561 ~ 1 680 bp之间的120 bp片段分为10个片段,构建10个新的TNFR1/RANK突变体,每一个突变体在其RANK膜内部分含12 bp缺失。用包装细胞Plat E分别将各突变体包装成逆转录病毒,通过感染分别将这些逆转录病毒转染到肿瘤坏死因子受体1和2基因敲除小鼠的骨髓巨噬细胞(BMM)中。用TNFɑ刺激后。观察哪一个突变体不能诱导OC形成。【结果】 首先发现表达TNFR1/RANK1561-1620或TNFR1/RANK1621-1680的逆转录病毒感染的BMM 不能分化成OC,然后在RANK-cDNA第1 561 ~ 1 680 bp这个大的片段中又发现表达TNFR1/RANK1597-1608。TNFR1/RANK1609-1620。TNFR1/RANK1621-1632或TNFR1/RANK1633-1644的逆转录病毒感染的BMM也不能分化成OC。【结论】 RANK-cDNA第1 597 ~ 1 644 bp之间的48 bp片段(5′-gggcaggtgatgaacttcaagggtgacatcatcgtggtgtatgtcagc-3′)对OC形成起决定性作用。     

番茄红素对脂多糖诱导巨噬细胞炎症反应的作用及其分子机制

 【目的】 探讨番茄红素对脂多糖(LPS)所诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子生成的影响及其作用的分子机制。【方法】 分别用1、5、10 μmol/L 的番茄红素孵育细胞1 h,再用1 μg/mL LPS 处理细胞不同时间,分别用Griess法和ELISA法检测RAW264.7巨噬细胞培养基中NO及IL-6的含量,用Western-blot检测核因子-κB(NF-κB) p65、磷酸化和非磷酸化I-κBα、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的蛋白表达量。【结果】 番茄红素能有效地降低炎性因子NO和IL-6分泌,进一步研究显示番茄红素能够抑制LPS诱导I-κBα磷酸化和降解、NF-κB核转移,阻断ERK1/2和p38 MAPK激活,而对JNK活化没有影响。【结论】 番茄红素能够通过抑制ERK1/2 和p38 MAPK信号通路的激活而抑制巨噬细胞NF-κB依赖的炎症因子NO和IL-6生成,这可能是番茄红素防治一些炎症相关性疾病的作用机制之一。     

WT161抑制小鼠破骨细胞分化及骨吸收的研究

目的 研究WT161对破骨细胞分化及骨吸收功能的作用及机制。方法 取8周龄雄性C57BL/6小鼠的骨髓巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMM）进行原代培养，通过CCK-8细胞毒性试验探究不同浓度WT161对BMM增殖的作用；通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察各浓度WT161对破骨细胞分化的影响；通过骨吸收试验探究各浓度WT161对破骨细胞骨吸收功能的作用；通过蛋白质印迹试验检测WT161对核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65、p-NF-κB p65及活化T细胞核因子（nuclear factor-activated T cell 1，NFATc1）信号通路的影响。结果 CCK-8结果显示当WT161浓度>0.63μmol/L时，WT161对BMM具有显著的抑制增殖作用；诱导破骨细胞分化时，WT161抑制BMM分化为破骨细胞，破骨细胞数目及铺展率明显减少；骨吸收试验显示WT161可显著抑制破骨细胞骨吸收功能；蛋白质印迹试验结果表明，WT161抑制NF-κB p65的磷酸化及下游NFATc1的表达。结论 WT161通过抑制NF-κB及下游的NFATc1信号通路从而抑制破骨细胞的分化及骨吸收功能。     

刺糖多糖对小鼠腹腔巨噬细胞核转录因子、丝裂原活化蛋白激酶及氨基末端激酶信号通路相关基因和蛋白表达的影响

目的探讨刺糖多糖对小鼠腹腔巨噬细胞中核转录因子(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及cJun氨基末端激酶(JNK)信号通路相关基因和蛋白表达水平的影响。方法将处于对数生长期的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264. 7按1×108L-1接种至24孔细胞培养板中,24 h后更换细胞培养液。将细胞分为0. 0、12. 5、50. 0、100. 0 mg·L-1刺糖多糖组,每组细胞加入相应浓度的刺糖多糖干预24 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组细胞中p38、NF-κB p65、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、JNK1/2/3 mRNA的表达,采用Western blot法检测各组细胞中磷酸化p38 (p-p38)、p38、磷酸化NF-κB p65 (p-NF-κB p65)、NF-κB p65、磷酸化ERK1/ERK2 (p-ERK1/ERK2)、ERK1/ERK2、磷酸化JNK1/2/3(p-JNK1/2/3)及JNK1/2/3蛋白的表达。结果刺糖多糖干预巨噬细胞24 h后,与0. 0 mg·L-1刺糖多糖组比较,50. 0、100. 0 mg·L-1刺糖多糖组细胞中ERK1、NF-κB p65 mRNA表达量显著升高(P <0. 05); 12. 5、50. 0、100. 0 mg·L-1刺糖多糖组细胞中p38 mRNA表达量显著升高(P <0. 05)。与12. 5 mg·L-1刺糖多糖组比较,50. 0、100. 0 mg·L-1刺糖多糖组细胞中ERK1、p38、NF-κB p65 mRNA表达量显著升高(P <0. 05)。与0. 0、12. 5 mg·L-1刺糖多糖组比较,50. 0、100. 0 mg·L-1刺糖多糖组细胞中p-p38、p-NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2蛋白表达量显著升高(P <0. 05)。结论刺糖多糖能上调p38、NF-κB p65、ERK1/2蛋白的磷酸化水平,从而激活MAPK信号通路和NF-κB信号通路;刺糖多糖的免疫机制可能与NF-κB p65、p38、ERK1mRNA表达上调有关。     

免疫抑制剂姜黄素逆转胰岛素抵抗的研究

 【目的】为探讨姜黄素（curcumin）对胰岛素抵抗的治疗作用及其机制。【方法】利用胰岛素抵抗的小鼠模型,观察姜黄素对小鼠胰岛素抵抗的水平、转录因子I-κBα、循环细胞因子的变化。【结果】①姜黄素能抑制TNFα刺激Fao细胞NF-κB激活;②姜黄素治疗后小鼠的空腹血糖水平没有明显下降,但空腹胰岛素的水平下降约30%,葡萄糖耐量曲线的水平也明显下降;③循环中TNFα[（34.5±3.4）pg/mL vs（31.3±1.1）pg/mL]水平没有明显改变,而IL-1β[（33.9±3.2）pg/mL vs（15.6±1.1）pg/mL]和IL-6[（72.1±9.8）pg/mL vs（47.2±5.3）pg/mL]水平明显被抑制;④胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明显升高,而胰岛素受体的磷酸化水平没有明显改变。与IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行,P85的磷酸化水平也明显升高,AKT的磷酸化的水平也明显升高。【结论】姜黄素能提高小鼠胰岛素敏感性,有治疗改善肥胖诱导的胰岛素抵抗的作用。     

黄芩素对阿霉素致乳鼠心肌细胞损伤的保护作用机制研究

目的：观察黄芩素对阿霉素所致心肌细胞损伤的保护作用及其NF-κB及JNK信号通路的关系。方法：采用乳鼠心肌细胞培养法,实验分为空白对照组、阿霉素处理组、阿霉素合并黄芩素高中低剂量组。MTT法检测心肌细胞存活率,Westernblot法检测NF-κBp65和JNK磷酸化水平。结果：高剂量组黄芩素能够显著对抗阿霉素所致心肌细胞损伤（P〈0．05）,并显著抑制炎症通路NF-κB和细胞凋亡通路JNK的磷酸化水平。结论：黄芩素能抑制NF-κB和JNK的磷酸化水平,以对抗阿霉素所引起的心肌细胞损伤。     

黄芪皂苷III抑制小鼠动脉平滑肌细胞TNFR1介导信号转导

目的 研究黄芪皂苷III（astragaloside III,ASⅢ）对小鼠动脉平滑肌细胞（arterial smooth muscle cells,ASMCs）中I型TNF-α受体（TNF-α receptor type 1,TNFR1）介导信号通路的抑制作用,为中药黄芪的抗炎作用和抗动脉粥样硬化作用提供证据。方法 以不同浓度ASⅢ预处理ASMCs,之后以TNF-α诱导细胞。采用WST-1实验检测细胞活力变化;采用实时定量RT-PCR技术检测细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）、凝集素样氧化低密度脂蛋白受体（lectin-like oxidized LDL receptor-1,Lox-1）和ATP结合盒转运蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）mRNA表达变化;采用Western Blot方法检测ICAM-1、Lox-1和ABCA1蛋白表达变化,并检测ASⅢ对转录因子NF-κB（nuclear factor-κB）上游抑制蛋白IκBα（NF-κB inhibitor-α）、以及对信号分子AKT、细胞外受体活化激酶（extracellular receptor-activated kinases,ERKs）和p38磷酸化的影响。结果 （1）ASⅢ在30 nM~10 μM范围内不抑制细胞活力;（2）ASⅢ剂量依赖性抑制TNF-α对ICAM-1、Lox-1和ABCA1 mRNA表达的调控;（3）ASⅢ剂量依赖性抑制TNF-α对ICAM-1、Lox-1和ABCA1 蛋白表达的调控;（4）ASⅢ显著抑制TNFR1介导的IκBα磷酸化和降解;（5）ASⅢ显著抑制TNFR1介导的AKT、ERKs和p38磷酸化。结论 ASⅢ可全面抑制ASMCs中TNFR1介导信号通路激活,参与其抗炎和抗动脉粥样硬化作用。     

曲古抑菌素A下调人肺腺癌细胞A549内IDO表达的分子机制

【目的】研究曲古抑菌素A (-TSA)抑制γ干扰素（IFN-γ）诱导的人A549细胞内吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达的分子机制。【方法】 采用蛋白质免疫印迹技术检测TSA在IFN-γ诱导的A549细胞中IDO的表达、信号转导及转录激活子1（STAT1）的磷酸化和干扰素调节因子1（IRF-1）的激活等过程中的作用,在激光共聚焦显微镜下观察TSA对STAT1核转位的影响,利用双荧光素酶报告基因系统检测TSA对γ-干扰素激活位点（GAS）、干扰素刺激应答元件（ISRE）和核因子-κB （NF-κB）的激活的影响。【结果】 TSA以浓度依赖方式下调A549细胞中IFN-γ诱导的IDO表达,并能明显抑制STAT1第701位酪氨酸的磷酸化和STAT1的核转位。双荧光素酶报告基因分析和Western blot结果表明：TSA能显著抑制GAS、ISRE和IRF-1 的激活却不能抑制NF-κB的激活。【结论】TSA能下调IFN-γ诱导的A549细胞中IDO的表达,其机制可能是与其抑制STAT1的磷酸化和核转位,以及抑制STAT1与GAS的结合有关。     

2005年广西流动人口疟疾监测结果分析

目的了解广西流动人员疟疾流行现状,进而提出针对性防治措施。方法收集全区网络直报疫情资料和各级疾病预防控制机构疟疾监测数据进行分析。结果2005年广西流动人口发热病人平均疟原虫阳性率为0·33%。80·62%的病人为本地居民外出到疟疾流行区务工感染所致。以从事护林/砍伐比例最高,占44·19%。结论加强返乡流动人口疟疾监测是巩固广西疟疾防治的关键所在。     

2004年邹城市中小型饮食行业餐具消毒效果调查

为确保消费的饮食安全，更好地了解饮食业餐具消毒效果卫生状况，从而为进一步加强监督管理提供依据，于2004年4～7月对邹城市所属中小型饮食业进行餐具消毒效果检测，共检测876份，现将结果报告如下。     

2007～2009年铜陵市人民医院产科抗生素应用分析

目的了解产科抗生素的应用情况并评价其合理性以加强临床使用的管理。方法随机抽查铜陵市人民医院2007～2009年产科出院患者病历中的抗生素使用情况,进行回顾性的调查统计分析。结果抗生素使用率达67%,头孢类药物是主要种类,以单独用药情况最多;多数品种DUI接近1。结论该院产科抗生素使用基本合理,但尚须建立有效的监管制度,控制过度使用。     

2005年汕头市登革热定点监测结果分析

目的 通过定点监测为汕头市登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。方法收集监测点的登革热疫情、人群抗体水平和媒介伊蚊等监测资料，用EPI2002软件统计分析。结果2005年汕头市无登革热疫情，抗登革热病毒IgG、IgM阳性率低，伊蚊幼虫孳生密度高峰在6、8、9、10月份，低谷在4、7、11月份，孳生情况随着月平均降水量、平均气温变化而变化；孳生场所以农村、暂时性容器为主。结论汕头市有登革热流行的自然、社会环境条件，人群普遍对登革热易感，8～10月是发动爱国卫生运动，清除伊蚊孳生地，预防、控制登革热流行的适当时机。     

广东高州市2005年医疗机构消毒质量监测分析

目的评价辖区内医疗机构消毒灭菌质量，督促各医疗单位提高消毒灭菌效果，防止医源性感染的发生。方法对辖区内的医疗单位已消毒或灭菌的用品进行抽样检测，将检测结果进行统计学分析。结果这次采集使用中消毒液、无菌器械、物体表面、手术室空气和医务人员手共3556份，检测达卫生标准2955份，符合率为83、10％，不同样品检测达卫生标准百分率依次为97．37％、95．56％、86．25％、75．41％和62、49％。结论高州市医疗机构消毒灭菌质量用卫生指标评价，卫生站的符合卫生标准率低于医院，手术室空气和医务人员手的监测合格率低于使用中消毒液和无菌器械。     

惠州市车间空气中有毒物检测结果分析

目的 了解惠州市电子、五金、电镀等企业生产车间中有毒物污染情况，以便提出有效的预防措施。方法根据中华人民共和国国家标准中气相色谱法、原子吸收分光光度法、分光光度法对车间空气中有毒物质进行检测。结果2003～2004年共检测车间空气样品3625份，舍格3511份，总合格率为96．8％。其中锰尘舍格率最低，为82．2％；其次是三氯乙烯91．0％，氰化氢93．4％，甲苯97．1％，硫酸97．2％，铅烟98．2％，正己烷99．2％。苯99．3％，二甲苯99．6％，其他合格率为100％。结论惠州市部分电子、五金、电镀企业车间空气中有毒物的浓度较高，应改善生产车间的通风设施，做好工人的个人防护。     

2004年海南省医疗机构消毒效果监测分析

目的 了解海南省医疗机构消毒工作质量，以防止医院感染。方法按《医院消毒技术规范》中《医院消毒与灭菌的效果监测》方法对医疗机构各科室的紫外线灯、高压蒸汽灭菌器、医护人员手、物体表面、使用中消毒液、室内空气的消毒效果进行监测。结果紫外线灯合格率为91．07％高压蒸汽灭菌器合格率为95．98％物体表面及医护人员手细菌总数合格率为84．78％，室内空气细菌总数合格率为66．4％，使用中消毒液细菌总数合格率为95．07％。结论医院消毒质量合格率与各级医护人员认真落实工作的制度化、规范化、标准化有密切关系，应加强乡镇级卫生院和个体诊所的监测工作，提高消毒质量。     

儋州市2005年餐具消毒状况分析

为了防止经餐具引起疾病的传播，引起人们对餐具传播疾病的重视，了解《食品卫生法》颁布发几年以来，餐饮餐具的消毒状况，儋州市于2005年对239家大中型宾馆酒店、中小型排档、个体饮食店进行抽查分析。     

2005年广东省碘缺乏病监测结果分析

目的进一步了解广东省消除碘缺乏病工作的进展情况,为落实 2010年实现消除碘缺乏病措施修订提供依据. 方法根据卫生部办公厅下发的《关于开展全国第五次碘缺乏病监测的通知》要求进行监测. 结果居民户合格碘盐食用率为75.0%,非碘盐率20.1%;8～10岁儿童甲状腺肿大率为5.3%;尿碘中位数为140μg/L,《20μg/L的比例为1.7%;8～10岁儿童智商平均为101.1. 结论广东沿海及珠江三角洲部分地区非碘盐冲销问题依然存在,碘缺乏病病情也未出现明显回升,非碘盐冲销严重地区学生的碘营养水平未达到消除碘缺乏病的标准,2010年实现全省消除碘缺乏病的目标十分艰巨.     

2009年海南省农村生活饮用水监测报告

目的了解海南省农村生活饮用水卫生状况,为提高农村水质提供科学依据。方法每个监测点一年分枯水期和丰水期各检测1次,每次采集出厂水、末梢水水样各一份。按现行《生活饮用水卫生标准》（GB/T5749-2006）进行评价。结果地面水58.90%比地下水33.20%合格率高;枯水期39.18%比丰水期25.95%合格率高,监测项目合格率最低的是总大肠菌群47.7%,菌落总数86.60%,不同处理方式水厂的监测结果 ,完全处理水厂合格率65.66%比未处理水厂合格率26.12%高。结论海南省农村饮用水微生物超标严重,农民饮用的绝大多数是未消毒处理的水,饮用水卫生安全隐患多。