诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了 Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断 ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在 OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34＋造血祖细胞。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养条件的优化及其鉴定

背景:相对于骨髓间充质干细胞来说,脐血间充质干细胞是一种较为理想的新的组织工程种子细胞来源,但其培养成功率较低.目的:通过对培养基的选择、离心速度及时间、接种密度、生长因子的选择、首次换液时间等条件进行优化,拟建立一种稳定可靠的人脐血间充质干细胞的体外分离培养方法.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在白求恩国际和平医院输血科完成.材料:健康足月剖宫产新生儿脐带血20份,由白求恩国际和平医院干细胞中心提供,产妇及其家属均知情同意.方法:无菌条件下采集脐血,采用密度梯度离心法(1500 r/min离心15 min)结合直接贴壁法体外分离脐血间充质干细胞,加入含体积分数为10%人脐带血血清、5 μg,L GM-CSF、15 μg/L白细胞介素3的DMEM/F12培养基,调整细胞密度为1×1010L-1接种于人脐带血血清包被过的塑料培养瓶中,置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度环境下培养,3 d后首次换液,去除未贴壁细胞,以后每隔24 h换液1次.当培养瓶中的细胞生长到80%融合时,胰酶-EDTA混合液消化传代.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞免疫表型.结果:24 h后可见有少量细胞贴壁,48 h后贴壁细胞增多,并出现少量单极梭形细胞,7d后可见细胞形成集落,培养两三周形成平行排列、辐射状或漩涡状细胞界限不清楚的成纤维样细胞,且80%～90%呈现融合.第2代细胞接种后12 h开始贴壁,10 d即可达80%～90%融合.流式细胞仪分析显示,此类细胞稳定地表达相关抗原标记CD29及CD44,但不表达造血细胞系表面标记CD34.结论:实验在体外改良培养条件下成功分离出人脐血间充质干细胞,培养周期较短,细胞纯度较高,贴壁细胞稳定表达间充质干细胞表面相关抗原.     

人脐血非造血干细胞的基本特性

目的:通过对体外培养人脐血来源非造血干细胞生长特性的观察和对细胞免疫表型的检测,探讨人脐血来源非造血干细胞的一般特性,为进一步研究人脐血来源非造血干细胞提供依据。方法:实验于2005-01/10在首都医科大学北京神经科学研究所和首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。脐带血由首都医科大学附属天坛医院提供,经密度梯度离心法分离新鲜脐带血,获取的单个核细胞进行培养。①倒置显微镜下观察细胞形态。②培养基中加入白血病抑制因子或用Mescencult间充质干细胞培养基进行培养,记录细胞生长状况。③流式细胞术分析脐血单个核细胞的免疫表型。结果:①人脐血非造血干细胞形态观察:较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞,而以5×106细胞密度接种则在48～72h后出现贴壁的梭形细胞,培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。②生长特性:人脐血非造血干细胞接种5d后增殖速度加快,随后的几天内保持较快的增殖速度,15d后进入平台期。高糖DMEM培养基 胎牛血清和高糖DMEM培养基 胎牛血清 白血病抑制因子,两种培养体系在细胞增殖上未显示差异,白血病抑制因子并没有显著改善人脐血非造血干细胞生长增殖速度。③免疫表型:新鲜脐血经分离得到的单个核细胞中有少量CD34阳性细胞,CD90,CD166阳性细胞比例分别为(24.18±5.46)%和(36.44±6.26)%;人脐血非造血干细胞体外培养10d左右无CD34阳性细胞,CD166阳性细胞的比例达(76.48±4.54)%,较单个核细胞中CD166阳性细胞比例明显增高,并且表达HLA-ABC,而少量表达HLA-DR。结论:合适的细胞接种密度有利于人脐血非造血干细胞贴壁生长。白血病抑制因子并不能增加体外培养的人脐血非造血干细胞的生长增殖速度。人脐血非造血干细胞体外培养10d左右可以获得纯度较高的CD166阳性细胞。     

成人骨髓多能成体祖细胞生物学性状及向成软骨样细胞的诱导分化(英文)

背景:骨髓多能成体祖细胞具有比骨髓间充质干细胞更强的分化潜能和扩增能力并具有胚胎干细胞样的多向分化潜能,但分化为成软骨样细胞的研究目前少见报道。目的:观察成人骨髓成体多能祖细胞的体外培养条件、生物学特性及其向成软骨样细胞分化的可能性。方法:观察体外培养成人骨髓成体多能祖细胞的形态、生长情况,并鉴定;以分化培养基诱导成人骨髓成体多能祖细胞向无软骨细胞分化。结果与结论: 光学显微镜下观察培养的成人骨髓多能成体祖细胞体积偏大,长多角型,数个细长伪足,细胞核大,细胞质丰富,细胞增殖能力旺盛;可见转录因子 4、阶段特异性胚胎表面抗原 1表达,未见 T 细胞表面黏附分子 CD44,CD45,CD133 和主要组织相容性抗原系统Ⅱ的表达;诱导分化后,分化细胞经甲苯胺蓝染色后呈异染性,可表达Ⅱ型胶原。证实,实验成功体外培养了成人骨髓多能成体祖细胞,骨髓多能成体祖细胞在一定诱导条件下具有向成软骨样细胞分化的潜能。     

优化骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的优化方法.方法:全骨髓贴壁法分离、体外培养原代大鼠骨髓MSC,种植后3h首次换液,培养前72 h内频繁换液;通过流式细胞学方法检测原代培养细胞的MSC特征性表面标记的表达及比例;通过体外培养诱导成脂、成骨、成软骨分化,确立原代培养骨髓MSC的多向分化潜能.结果:早期、频繁换液的方法分离培养大鼠骨髓MSC,P0 MSC以单克隆生长,呈典型漩涡状排列,细胞形态均一;P1细胞均一表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45;原代培养骨髓MSC具有成脂、成骨、成软骨分化潜能.结论:全骨髓贴壁法分离培养大鼠原代骨髓MSC,早期、频繁换液有助于在早期获得高纯度细胞,原代细胞具有多向分化潜能.早期、频繁换液的全骨髓贴壁法是体外分离培养骨髓MSC的优化方法.     

SD大鼠脂肪源间充质干细胞分离培养特性及影响因素

背景：脂肪源间充质干细胞因为容易大量获得、抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩增、供区的损伤小等优点,成为干细胞生物工程研究的理想种子细胞来源。但是,脂肪源间充质干细胞分离培养有较大困难。目的：探索脂肪源间充质干细胞的分离培养方法及其生长特性。方法：分别取4周龄和10月龄不同性别的SD大鼠腹股沟、肩部和腹腔脂肪组织,经细胞培养液洗涤、离心后接种于细胞培养瓶,放置体积分数5%CO2孵箱中培养,分别于24,48,72h后换液。待细胞密度达到约80%时,用0.25%胰酶-EDTA消化,传代培养。分析SD大鼠的年龄、性别、采集脂肪组织的部位、胶原酶Ⅰ的浓度和消化时间,以及原代细胞的首次换液时间等对脂肪源间充质干细胞培养的影响。结果与结论：原代脂肪源间充质干细胞呈梭形或多角形。随着传代和培养时间的延长,脂肪源间充质干细胞由多边形、成巢分布,逐渐连接成片,伸展为梭形或多角形。培养48h后,含脂滴的细胞数量逐渐增多,但仍有90%的脂肪源间充质干细胞始终不表现向脂肪细胞自发分化的趋势。4周龄雌性SD大鼠腹腔脂肪组织在一定条件下传代培养最佳。提示,从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离的脂肪源间充质干细胞可在体外稳定传代,SD大鼠的年龄、性别、采集脂肪组织的部位、胶原酶Ⅰ的浓度和消化时间,以及原代细胞的首次换液时间等均影响脂肪源间充质干细胞的分离培养效果。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

背景:骨髓基质干细胞的多向分化性不利于向软骨细胞单一方向分化,植入体内后成骨系细胞分泌的骨形态发生蛋白作用于非定向分化的前体细胞,使其向成骨细胞分化,而已定向分化的细胞则不受骨形态发生蛋白的影响,形成相应的组织.目的:体外诱导犬骨髓基质干细胞定向分化为软骨细胞,探讨体外诱导成软骨的方法和条件.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-03/2006-01在中山大学组织工程实验室完成.材料:选取4个月龄雄性家犬1只,骨髓基质干细胞取自犬肋骨.方法:自犬肋骨取骨髓2.0～3.0mL行体外原代骨髓基质干细胞分离培养.8～11d细胞接近融合时,加入胰酶消化,用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM合成培养液终止消化,收集细胞悬液,离心后,用培养液悬浮细胞,按1:3接种传代.取第3代细胞培养扩增,换液时加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子2mL,换液2次后,再加入1mg/L转化生长因β1 2mL诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化.主要观察指标:行甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.结果:骨髓基质干细胞体外行原代和传代培养至P4代生长良好,经碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1扩增诱导的细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性,显示被诱导的骨髓基质干细胞具备软骨细胞特性.结论:应用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1体外可以诱导犬骨髓基质干细胞分化为软骨细胞,诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞.     

体外诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞

背景:脐血间充质干细胞在特定的诱导条件下可以分化成为多种类型的细胞,易于体外培养扩增,但脐血中间充质干细胞的建立时间长、频率低是其主要缺点.目的:体外分离培养脐血间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞方向分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008 06/2009 01在青岛大学医学院试验室完成.材料:脐血取自足月正常分娩的产妇,由青岛市立医院妇产科提供.方法:采用percoll密度梯度法体外分离培养人脐血间充质干细胞,当细胞汇合90%单层细胞后胰蛋白酶消化传代.取第3代脐血间充质干细胞,以1×106密度接种,当细胞达50%～60%融合时,加入含0.1 μmol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的DMEM成骨细胞诱导液;对照组加入普通低糖DMEM培养液培养.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,细胞生长曲线分析,透射电镜观察细胞超微结构,von Kossa染色和碱性磷酸酶染色检测向成骨细胞诱导分化情况.结果;原代培养的脐血间充质干细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,传代后细胞形态均一,呈梭形旋涡状排列.第3代脐血间充质干细胞高表达CD29,CD44,CD13,不表达CD34.生长潜伏期为两三天,第三四天进入对数增殖期,1个月后进入平台期.胞核呈类圆形或不规则形,核膜清晰,有一两个核仁,染色质较粗,胞质中细胞器丰富,细胞表面有微绒毛.第3代脐血间充质干细胞成骨诱导7 d后逐渐汇合呈铺路石状,14 d后von Kossa染色出现钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阳性;对照组未见钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阴性.结论:采用percoll密度梯度法可成功从人脐血中分离出间充质干细胞,并在体外诱导分化为成骨细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、纯化与培养适宜条件的筛选

目的:为获得大量、高纯度的骨髓间充质干细胞,筛选体外分离、纯化和培养的适宜条件。方法:实验于2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院进行。①实验材料:2月龄SD大鼠,雄性,体质量(100±20)g,由解放军兰州军区兰州总医院实验动物科提供。②实验方法:分别采用全骨髓法(贴壁筛选法)和密度梯度离心法分离和纯化大鼠骨髓间充质干细胞。将采用密度梯度离心法获得的单个核细胞按1×107,1×108,1.5×108,2×108,1×109,2×109L-1的接种密度分别分成1～6组,接种在24孔板内,每组接种6孔。比较细胞出现伸展时间、原代培养时间。于细胞接种后第1,2,3,4,5,6天进行首次换液。将换下的部分细胞置于新的培养皿中进行培养,至少培养3d,观察是否还有新的贴壁细胞出现,以确定首次换液时间。观察体积分数为0.10,0.12,0.15,0.18,0.20血清对原代及传代后细胞生长的影响,比较不同浓度血清中细胞数量、集落形成率。集落形成率=集落数目/接种细胞数目×100%。采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞细胞周期。选取第5代扩增的骨髓间充质干细胞,接近完全融合后进行成骨和成脂肪诱导培养。诱导剂分别为:10nmol/L地塞米松、0.05nmol/L抗坏血酸及10nmol/Lβ-甘油磷酸钠;1μmol/L地塞米松、0.5mmol/LIBMX、0.01mmol/L人胰岛素、0.01mmol/L吲哚美辛。并设未加诱导剂培养液培养的骨髓间充质干细胞对照。③实验评估:采用碱粒酶测定成骨诱导后细胞,采用油红O染色鉴定成脂肪诱导后细胞。结果:①细胞出现伸展时间、原代培养时间:密度梯度离心法培养细胞出现伸展时间与全骨髓法相比,差异无显著性意义。密度梯度离心法原代培养时间较全骨髓法长[(9.41±1.11),(14.73±2.86)d,P<0.05]。②不同接种密度对密度梯度离心法所获细胞生长影响:1×109L-1组细胞出现伸展时间及原代培养细胞融合时间较早。1×107L-1组培养20d内不能传代。③首次换液时间对细胞生长的影响:第5天开始在换下的液体中,很少有再贴壁的细胞出现。因此首次换液时间应为第5天。④不同体积分数血清对细胞生长的影响:在其他条件相同的前提下,骨髓间充质干细胞在含体积分数为0.12胎牛血清中细胞集落形成率最高。⑤成骨及成脂诱导:成骨诱导的骨髓间充质干细胞经碱粒酶测定,结果钙化结节呈蓝色。成脂诱导的骨髓间充质干细胞经油红O染色,苏木精-伊红复染后胞内脂滴呈桔红色,核呈蓝色。结论:采用密度梯度离心法分离纯化的骨髓间充质干细胞以1×109L-1密度接种,在含体积分数为0.12胎牛血清的MEM培养基中培养,生长状况良好,增殖速度快。     

人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

目的探索体外培养和鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcell,MSC）的方法,为人骨髓间充质干细胞移植于受损心脏、改善心脏功能的研究打下基础。方法采用Percoll（1．073g／ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞,用含10％的胎牛血清低糖DMEM培养液体外培养扩增骨髓MSC,并通过FCM对其纯度进行鉴定。结果Percoll液能成功分离出骨髓间充质干细胞。原代及传代培养显示人骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力。体外扩增的人骨髓间充质干细胞表达CD29、CD166等表面抗原,不表达CD34、CD45等表面抗原。结论人骨髓间充质干细胞作为一种具有多分化潜能的多能干细胞,具有强大的分裂增殖能力,体外培养无明显的分化倾向．     

人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1×10^6／cm^2的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

背景：采用胎牛血清扩增培养及冷冻保存的间充质干细胞,在临床应用中存在一定的风险。目的：探讨以脐血血浆替代胎牛血清体外分离培养、扩增及冷冻保存脐带间充质干细胞的可行性。方法：选择符合广州脐血库供者合格性筛选标准的脐血,收集脐血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养。采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得脐带间充质干细胞,分为两组,分别以DMEM/F12为基础培养基,添加胎牛血清或混合脐血血浆,经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行间充质干细胞成骨、成脂分化鉴定。在含有10%二甲基亚砜的DMEM/F12培养基中,分别添加体积分数为20%的胎牛血清或混合脐血血浆作为冷冻保存液,对扩增至第3代的细胞冷冻保存至6个月以上,观察复苏后细胞的活率、贴壁情况、增殖、免疫表型及向成骨细胞分化的能力。结果与结论：两种培养体系下的脐带间充质干细胞均呈现典型的梭形漩涡状生长,间充质干细胞免疫表型的表达谱系基本无差异,均具有成骨、成脂分化的能力,但脐血血浆培养条件下细胞的增殖速度显著高于胎牛血清。冻存复苏后的细胞可正常贴壁,且具有向成骨细胞分化的能力,采用脐血血浆冻存的细胞具有更高的贴壁效率及扩增能力。上述结果表明,脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的扩增培养及冷冻保存,并维持了间充质干细胞的基本生物学特性,是大量扩增间充质干细胞用于临床治疗较为安全的选择。     

脐血混合培养纯化人间充质干细胞及生物学特性研究

目的探讨体外分离、混合培养纯化人脐血间充质干细胞的适宜体系,观察该人脐血间充质干细胞生物学特性。方法收集孕足月新生儿脐血,每3份脐血[(70—100)ml/份]混合;采用1.077 g/ml的淋巴细胞分离液(Ficoll)以1 500 r/min密度梯度离心法分离脐血中的单个核细胞,在Mesencult培养基中贴壁培养筛选人脐血间充质干细胞,显微镜下观察细胞生长形态变化,细胞计数并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞抗原表达,分析细胞周期;体外诱导脐血间充质干细胞成脂、成骨分化。结果密度梯度离心法所获得的单个核细胞,在培养基中培养约3—5 h开始出现贴壁生长,24 h后贴壁细胞增多,呈明显纺锤状,10 d后开始出现细胞克隆,3周后呈漩涡状生长。原代培养时间为15 d,P1代倍增时间为26 h。流式细胞仪鉴定:贴壁生长的细胞表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45。分化潜能鉴定体外培养细胞可以成脂、成骨分化。结论所贴壁培养出的细胞的生长形态、流式表形、分化潜能具有人脐血间充质干细胞生物学特征,混合培养可以提高间充质干细胞培养成功率,实验中采用的培养体系适宜人脐血间充质干细胞的分离培养。     

胰岛干细胞和脐血间充质干细胞体外分离培养的形态学特征观察

背景:干细胞是具有自我更新能力和高度增殖能力和多种分化潜能的较原始细胞,在一定的条件下,干细胞可以分化成机体内的多种功能细胞。胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以治疗相应系统的疾病,但是目前有关这两类干细胞的培养仍有困难。目的:探讨胰岛干细胞和脐血间充质干细胞分离和培养的方法,并观察在培养过程中两类干细胞的形态学变化。设计:完全随机分组设计,重复测量实验。单位:郑州大学医学院生理学教研室干细胞研究中心材料:实验于2004-04/2005-01在郑州大学医学院干细胞中心完成。选用鼠龄1～3d新生SD大鼠10～15只进行胰岛干细胞培养,采集年龄24～35岁的足月妊娠健康产妇(经过产妇知情同意)新鲜脐带血进行脐血间充质细胞的培养。方法:取新生SD大鼠,无菌条件下剖腹取胰,眼科剪反复剪切后V型胶原酶消化分离胰岛。连续转瓶法纯化胰岛。取新鲜采集脐带血,用1.077g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。将胰岛细胞和脐血单个核细胞接种于37℃,体积分数0.05CO2培养箱内培养。于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况。主要观察指标:胰岛干细胞和脐血间充质干细胞的分离培养方法以及在细胞生长过程中的形态学变化。结果:①培养中可见梭形胰岛祖细胞贴壁呈极性生长,并且不断增殖,约12～14d长满瓶底,可连续多次传代。撤去生长因子和血清后有圆形细胞团开始形成。②从脐血中分离出的单个核细胞,培养中先出现大量的造血细胞集落,瑞士染色显示这些细胞大多数为粒系的集落,7d后出现贴壁的扁平状的上皮样细胞和长梭形的成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂。随着培养时间的延长,细胞数目不断增加。结论:胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以在体外分离和培养,用于进一步相关实验工作。     

体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞

背景：人脐带间充质干细胞具有获取容易、免疫原性低等优点,目前尚缺乏体外诱导其分化为胰岛样细胞的成熟方案。目的：探讨人脐带间充质干细胞在体外一定条件下分化为胰岛样细胞的可能性。方法：无菌条件下分离培养人脐带间充质干细胞,细胞传3代后,采用两步法诱导其向胰岛样细胞分化：第1步,加入含100pg／L13-神经生长因子,4nmol／LActivinA,10mmol/L尼克酰胺,25pg／L表皮生长因子,体积分数为10％胎牛血清的DMEM／F12培养基中培养7d;第2步,将诱导液换为含10mmoI／L尼克酰胺,10pg／L碱性成纤维细胞生长因子,1％胰岛素一转铁蛋白一硒的DMEM／F12培养基,诱导时间为14d。对照组单纯加入DMEM／F12培养基进行培养。结果与结论：诱导2周后脐带间充质干细胞开始聚集成团,诱导3周后,葡萄糖刺激试验阳性、PDX-1和Insulin基因表达。而对照组细胞无胰岛素分泌,胰岛细胞相关基因表达阴性。实验成功地将脐带间充质干细胞诱导成了胰岛样细胞。     

脐血间充质干细胞体外定向诱导心肌样细胞超微结构特征研究

目的:研究脐血间充质干细胞(umbilicalcordbloodstemcells)经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导在体外定向分化为心肌样细胞超微结构特征,为心肌样细胞鉴定提供依据。方法:取脐静脉血50mL、分离并培养间充质干细胞,用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化。相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征。结果:5-aza诱导后,部分细胞体积增大,呈“棒状”或“珠状”结构,有肌管样结构形成,透射电镜下有肌丝、心房颗粒及线粒体等心肌样细胞超微结构形成。结论:经5-aza诱导脐血间充质干细胞具有心肌样细胞超微结构特征。     

脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。     

人脐血间充质干细胞培养方法的比较

背景：脐血中含丰富的间充质干细胞,可以作为组织工程中一种新的种子细胞来源。目的：应用两种培养基体外培养、扩增、分离纯化脐血间充质干细胞,比较其生物学特性的差异。方法：无菌条件下采取40份足月顺产的脐血,肝素抗凝。应用Ficol 密度梯度离心法分离脐血单核细胞,随机分为两组,其中20份用MesenGro人间充质干细胞培养基进行培养,20份用DMEM培养基进行培养。对比两组梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、培养时间、原代细胞数量。选用生长情况良好的原代脐血间充质干细胞,用流式细胞仪检测间充质干细胞表面特异性标记表达情况。结果与结论：MesenGro组梭形的间充质干细胞平均出现时间、细胞集落平均出现时间、原代细胞平均培养时间、原代细胞平均数量为均优于DMEM组（P 〈0.01）。流式细胞仪检测显示,培养的细胞强表达间充质干细胞表面标志CD73和CD105,阳性率99.1%,不表达造血干细胞表面标志CD45和CD34,阴性率99.3%。结果提示在培养间充质干细胞的数量、形态、生长速度和培养时间诸方面,MesenGro 人间充质干细胞培养基均优于DMEM培养基。选用MesenGro人间充质干细胞培养基可以更纯、更快、更好地从脐血中培养出表达间充质干细胞表面标志的细胞。     

用于造血干细胞移植的人骨髓间充质干细胞体外扩增研究

本研究旨在检查4种不同培养液体外培养人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）的效果，建立一种基于临床移植需要的分离、培养人BM-MSC的方法，为BM-MSC联合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础。采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离BM—MSC，分别用含10％脐带血血清、胎牛血清、成人血清的DMEM／F12培养液和MesenCuh培养液培养，用流式细胞术检测细胞表面抗原，以成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组BM-MSC定向分化，通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。结果表明：4种培养液都能从成人骨髓液中分离培养出BM—MSC，脐带血血清组和Mesen Cuh组培养的BM—MSC在增殖数量和速度上相似，但均优于FCS组和AB型血清组。脐带血血清组和Mesen Cuh组培养的BM-MSC表达CD29、CD73、CD105的阳性率比FCS组和AB型血清组高（P〈0．05），而CD31阳性率低于FCS组和AB型血清组（P〈0．05），脐带血血清组和MesenCuh组培养的BM—MSC诱导为成骨细胞和脂肪细胞阳性率高于FCS组和AB型血清组（P〈0．05）。结论：4种不同培养液能够从成人骨髓液中分离出BM—MSC，脐带血血清组和MesenCuh组培养的BM-MSC的纯度和体外诱导分化能力比FCS组和AB型血清组高，含有脐带血血清的培养体系具有临床应用价值。     

两种分离脐血间充质干细胞的方法比较

背景：目前分离脐血间充质干细胞的方法很多,尚没有确定一种为最有效的方法。目的：寻找一种最为可靠的脐血间充质干细胞分离方法。方法：应用Percoll分离液法和羟乙基淀粉沉降法对脐血进行分离得到单核细胞,在含体积分数15%新生牛血清的DMEM/F12培养基中进行培养并传代。观察不同分离方法脐血单核细胞的回收率,每次传代的时间和细胞增值速度,培养过程中间充质干细胞形态的变化情况,并用流式细胞仪检测第3代细胞表面标志物CD90、CD44、CD34的表达。结果与结论：与Percoll分离液法相比羟乙基淀粉沉降法获得的单核细胞多,单核细胞回收率高（P〈0.01）,第1次传代时间短（P〈0.01）。然而两种方法获得的细胞经培养在形态的变化和表面标志物CD90、CD44、CD34的表达上差异并无显著性意义（P〉0.05）。所以羟乙基淀粉沉降法的分离效率较高,培养时间短,但是并不能获得质量较高的脐血间充质干细胞。