复方中药益肝康抑制肝星状细胞增殖的作用机制

目的:探讨活血化瘀复方中药益肝康抑制大鼠肝星状细胞(HSC)增殖的作用机制.方法:采用IL-1β激活HSC,应用Westernblot检测JNK的活化程度;应用活细胞计数试剂盒-CCK-8检测HSC增殖并观察JNK特异性阻断剂SP600125对IL-1β促HSC增殖的影响.应用凝胶电泳移动抑制法测定AP-1的活性.结果:IL-1β有明显促大鼠HSC增殖作用,IL-1β作用培养的HSC24h后,吸光值明显高于对照组(1.573±0.026vs1.339±0.073,P=0.000);经JNK特异性阻滞剂SP600125预处理后,IL-1β促HSC增殖作用受到抑制,SP600125浓度为10,20及40μmol/L时,吸光值分别为1.427±0.113,0.772±0.093,0.675±0.074,与对照组(1.560±0.110)相比其增殖反应均明显降低(P=0.03;P=0.000;P=0.000);IL-1β可激活大鼠HSCsJNK信号蛋白,并呈现出一定的时相变化.IL-1β作用HSCs后0,5,15,30,60及120min,JNK活性分别为0.982±0.299,1.501±0.720,2.133±0.882,3.360±0.452,2.181±0.789,1.385±0.368.与0(未加IL-1β)相比,15min,30min及60min均有显著差异(P=0.002,P=0.000,P=0.001).益肝康可抑制IL-1β诱导的HSCsJNK活性(1.610±0.242vs3.360±0.452,P=0.000);益肝康可抑制IL-1β诱导的HSCsAP-1活性,经益肝康预处理HSCs1h后,AP-1活性明显受到抑制(342.43±85.77vs597.70±83.96,P=0.005).结论:IL-1β可刺激HSC增殖,细胞内JNK信号转导通路参与了IL-1β促HSC增殖作用;益肝康可通过阻滞JNK/AP-1通路,抑制HSC增殖.     

sp600125对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖及bcl-2、c-myc蛋白表达的影响

肝星状细胞（HSC）的活化与增殖是肝纤维化发生的关键环节。乙醛刺激HSC活化与增殖，是导致酒精性肝纤维化发生的关键因素。研究表明，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），包括细胞外信号调节激酶（ERK）、JNK、P38是HSC活化与增殖导致肝纤维化发生的主要信号传导通路之一。乙醛刺激HSC中JNK磷酸化水平随sp600125（JNK信号传导通路特异性阻断剂）浓度增加而减少。本实验用sp600125处理乙醛刺激的HSC，观察sp600125对HSC增殖以及bcl-2、c-myc蛋白表达的影响，以探讨酒精性肝纤维化的发生机制。     

IL-1β诱导肝星状细胞IL-1Ⅰ型受体及AP-1表达的研究

目的探讨白细胞介素1β（IL-1β）对大鼠肝星状细胞（HSC）IL-1Ⅰ型受体（IL-1RⅠ）及激活蛋白-1（AP-1）表达的诱导作用。方法应用流式细胞技术检测IL-1RⅠ蛋白表达;应用凝胶电泳移动抑制法测定AP-1的活性。结果IL-1β刺激HSC 2min后即见IL-1RⅠ表达增强,10min时达到高峰（P〈0．01）,随后有所降低,60min时仍保持较高的活化状态（P〈0．01）,120min后则基本接近初始水平;IL—1β作用HSC1、2和4h后,AP-1活性均较对照组明显增高（P〈0．01）。结论IL-1β以时间依赖方式诱导HSCIL-1RI及AP-1的表达。     

益肝康抑制肝星状细胞Ⅰ型胶原合成的作用机制

目的:探讨活血化瘀中药复方“益肝康”抑制肝星状细胞Ⅰ型胶原合成的作用机制。方法:应用West-ern印记检测p38的活化程度;3H-Pro掺入法检测Ⅰ型胶原合成。结果:IL-1β有明显促大鼠HSCⅠ型胶原合成作用,IL-1β(10μg/L)作用培养的HSC24小时后,3H-Pro掺入量明显高于对照组(618.33±52.69vs388.83±49.72,P<0.01),阻断p38通路后,IL-1β的促HSCⅠ型胶原合成作用受到抑制。经不同浓度p38特异性阻断剂SB203580(10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L)预处理的各组细胞,3H-Pro掺入量分别为487.33±42.75、408.50±27.47、400.83±19.49,与对照组(未用SB203580预处理,629.67±69.88)相比,其掺入量均明显降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。益肝康可抑制IL-1β诱导的HSC中p38活性,与未用IL-1β处理组相比,在分别刺激HSCs5分钟、15分钟、30分钟和60分钟,HSC p38活性受到明显抑制(P<0.05,P<0.01)。经益肝康浸膏预孵育的益肝康 IL-1β组与单纯IL-1β组相比,p38活性明显受到抑制(1.550±0.410vs2.973±0.953,P<0.01)。结论:IL-1β可促进大鼠HSCⅠ型胶原合成;细胞内p38信号蛋白参与了IL-1β促HSCⅠ型胶原合成;益肝康可通过阻断p38通路,从而发挥抑制HSCⅠ型胶原合成作用。     

JNK信号转导通路在β-淀粉样蛋白25-35诱导PC12细胞凋亡中的作用机制

目的研究β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)诱导大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞凋亡的机制以及c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂SP600125的保护作用，探讨在Aβ25-35细胞毒性中JNK—c-Jun信号转导通路的可能作用机制。方法在培养的PC12细胞中加入Aβ25-35共孵育，用磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V)方法和流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡，用免疫印迹法检测不同时间点的JNK及c-Jun蛋白活性。结果PC12细胞经过Aβ25-35处理后发生凋亡，呈时间依赖性细胞生存率下降，免疫学方法检测显示细胞在Aβ25-35处理早期出现磷酸化JNK和磷酸化c-Jun的表达增高，且这一过程可被SP600125抑制。流式细胞仪检测显示在使用SP600125后，细胞生存率上升，差异具有统计学意义。结论体外PC12细胞培养显示Aβ25-35可诱导细胞凋亡，SP600125对Aβ25-35的细胞毒性具有保护作用，JNK—c-Jun信号转导通路可能参与了上述细胞毒作用机制。     

JNK MAPK信号通路在食管癌细胞系Eca-109细胞中的作用机制

目的探讨c-jun氨基末端激酶1/2（c-jun N-teuninal kinase,JNK 1/2）信号通路在食管癌细胞系Eca-109细胞中的作用。方法体外培养Eca-109细胞,以特异性JNK信号转导通路抑制剂SP600125处理Eca-109细胞;RT-PCR的方法检测JNK1和JNK2基因的表达,Western blot法检测JNK和p-JNK蛋白的表达,MTT（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-di-phenyltetrazolium bromide）法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果 Eca-109细胞经SP600125分别处理24h和48 h后,分别与对照组比较,JNK1 mRNA的表达无统计学差异（均P〉0.05）,JNK2 mRNA的表达也无统计学差异（均P〉0.05）,但活化的JNK即P-JNK1/2蛋白的表达显著减少,细胞的增殖显著被抑制,细胞的凋亡率有统计学差异（均P〈0.05）。结论 JNK信号通路可能在Eca-109细胞的发生发展中发挥重要作用。     

阻断细胞外信号调节激酶活性对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞功能的影响

细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路参与调控细胞增殖与分化，其在乙醛刺激的肝星状细胞（HSC）活化中的意义鲜见报道。我们观察了特异性阻断剂PD98059阻断ERK活性后对乙醛刺激的HSC增殖、Ⅰ型胶原分泌、转化生长因子β1（TGFβ1）mRNA及Na^＋／Ca^2＋交换蛋白表达的影响，以探讨ERK在调控乙醛刺激HSC激活及其活化后功能改变中的作用，为肝纤维化的防治提供理论依据。     

细胞外信号调节激酶调控乙醛对肝星状细胞的影响

目的 观察PD98059(特异性丝裂原细胞外信号反应激酶阻断剂)调控乙醛刺激大鼠肝星状细胞(HSC)周期，影响细胞增殖、Ⅰ型胶原蛋白分泌及转化生长因子(TGF)β1 mRNA表达。方法 不同浓度PD98059对乙醛刺激的HSC进行处理；流式细胞仪检测细胞周期，MTT法检测细胞增殖变化，ELISA法检测HSC内Ⅰ型胶原蛋白分泌，RT-PCR法检测HSC内TGFβ1 mRNA表达。结果 PD98059能剂量依赖性地影响乙醛刺激的HSC周期，使G0／G1期细胞百分比增高，S期细胞减少，从而抑制乙醛刺激的HSC增殖、HSC内Ⅰ型胶原蛋白分泌及TGFβ2mRNA表达。结论 细胞外信号调节激酶信号通路影响乙醛刺激的大鼠HSC增殖Ⅰ型胶原蛋白分泌及TGFβ1mRNA表达。     

IL-1β上调大鼠HSCs TIMP-1 mRNA表达与JNK和P38通路的关系

目的探讨IL-1β调控大鼠HSCsTIMP-1mRNA表达与JNK、p38 MAPK通路的关系。方法RT-PCR用于检测大鼠HSCs TIMP-1 mRNA表达；Western blot用于测定IL-1刺激HSCs后JNK、p38的活化程度。结果IL-1β（10ng／mL）作用培养的HSCs 24h后，TIMP-1 mRNA表达（1．191±0．079）明显高于对照组（0．545±0．091），有统计学意义（P〈0．01）；IL-1β以时间依赖方式激活JNK、p38通路。用不同浓度JNK阻断剂-SP600125预处理HSCs后，IL-1β上调HSCs TIMP-1 mRNA表达作用受到抑制，分别为10μmol／L，1．022±0．113;20μmol／L，0．8694±0．070；40μmol／L，0．666±0．123，与对照组相比（1．163±0．107），各浓度组均有显著性差异（P〈0．05，P〈0．01，P〈0．01）。用不同浓度p38阻断剂-SB203580预处理HSCs后，HSCs表达TIMP-1 mRNA逐渐增多，分别为10μmol／L，1．507±0．099；20μmol／L，1．698±0．107；40μmol／L，1．857±0．054。与对照组相比（1．027±0．061），各浓度组均有显著性差异（P均〈0．01）。结论IL-1β可通过上调HSCs TIMP-1 mRNA的表达来加速肝纤维化的发生发展，JNK和p38信号蛋白参与了此过程，HSCs中两条通路均可被IL-1激活，但所起作用完全不同，它们相互作用相互调节，共同调控TIMP-1 mRNA的表达。     

活化蛋白1在高糖诱导MC3T3-E1成骨细胞凋亡中的作用

目的观察活化蛋白1(AP-1)在高糖诱导MC3T3-E1成骨细胞凋亡中的作用。方法将体外培养的MC3T3-E1细胞分为正常对照组和实验组,实验组包括22.0 mmol/L D-葡萄糖组(高糖组)、P38MAPK-shRNA慢病毒转染组、P38MAPK信号转导阻断剂组、无关shRNA转染组、AP-1抑制剂SP600125组。采用TUNEL和流式细胞术检测细胞凋亡,用EMSA检测MC3T3-E1细胞AP-1的活性。结果与正常对照组相比,高糖组MC3T3-E1成骨细胞P38MAPK表达、AP-1活性、细胞凋亡显著增加。P38MAPK-shRNA慢病毒转染组和P38MAPK信号转导阻断剂组MC3T3-E1细胞AP-1活性较高糖组分别下降57.9%(P0.01)和45.6%(P0.05)。AP-1抑制剂组MC3T3-E1细胞凋亡率较高糖组下降39.7%(P0.01)。结论高糖通过激活P38MAPK增加AP-1活性,诱导MC3T3-E1成骨细胞凋亡,抑制AP-1活性后高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡显著下降。     

氧化苦参碱对转化生长因子-β1促肝星状细胞活化及跨膜信号转导影响

目的观察低浓度氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞(HSC)培养活化和转化生长因子-β1,(TGF-β1)促活化作用影响,并探讨该作用与TGF-β1受体后信号通路的关系.方法原代分离培养2d HSC,MTT法检测低浓度氧化苦参碱(0.25～8 mg/L)对HSG细胞毒作用(作用12 h)和增殖影响(作用48 h),或给予TGF-β1(5 ng/m1)和/(或)氧化苦参碱(2 mg/L)干预,相差显微镜观察HSC形态变化,分别以RT-PCR或Western blot法检测TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体、Smad 2/3、Smad 7以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和/(或)蛋白表达.结果氧化苦参碱(0.25～8 mg/L)对HSC无明显细胞毒作用,大于8 mg/L能抑制HSC增殖.氧化苦参碱(2 mg/L)抑制TGF-β1诱导HSC激活时的α-SMA表达和形态转化,伴随TGF-β1受体mRNA表达升高,Smad 7 mRNA表达上调及TGF-β1mRNA表达下降(与单纯TGF-β1处理组相比,分别上升1.25、0.87倍或下降1.92倍,P均＜0.05),但不影响TGF-β1Ⅱ型受体和Smad 3 mR-NA表达.Western blot检测Smad 2/3、Smad 7蛋白表达,与RT-PCR结果相似.氧化苦参碱对单纯培养激活的HSC有类似作用.结论低浓度氧化苦参碱(2 mg/L)上调Smad 7表达并抑制TGF-β1表达、上调TGF-β1Ⅰ型受体、恢复正常的TGF-β1跨膜信号转导,抑制HSC培养活化和TGF-β1促活化作用.     

机械应力对MG63成骨样细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的 观察力学刺激对MG63成骨样细胞的结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径在这一过程中的作用.方法 应用Western印迹法检测MG63细胞CTGF蛋白表达及细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38磷酸化水平,应用RT-PCR检测CTGF mRNA表达.结果 环状应力刺激可显著上调CFGF蛋白及mRNA表达,3～6 h达高峰,升高2～3倍;并且激活ERK及JNK信号途径,刺激10 min开始活化,ERK在60 min达高峰,而JNK在15～30min达高峰,对p38信号途径没有明显活化作用.JNK信号通路阻断剂SP600125能够阻断应力刺激对CTGF的上调作用,而ERK信号阻断剂PD98059及p38信号阻断剂SB203580却无此作用.结论 环状机械应力通过JNK依赖的途径上调了MG63细胞的CTGF表达.     

醛固酮对肝星状细胞激活蛋白- 1通路调控的体外研究

目的 探讨醛固酮（Aldo）对肝星状细胞（HSC）激活蛋白-1（AP—1）信号转导通路的影响。方法 采用HSCT6细胞株，分别予Aldo 1μmol／L处理10、30、60、120、180min，蛋白质印迹法检测磷酸化P42／44蛋白的表达。另外，观察细胞外信号调节激酶（ERK）特异性抑制剂-U0126，抗氧化剂-乙酰半胱氨酸（NAC）（均先预处理60min，再予Aldo刺激）和肿瘤坏死因子α（TNFα）对磷酸化P42／44蛋白表达的影响。Aldo在干预30、60、120、240min后，电泳迁移率变更分析（EMSA）检测AP-1 DNA结合活性的变化；予U0126和NAC干预后，EMSA检测AP-1 DNA结合活性；逆转录聚合酶链反应检测α1-1型前胶原基因的表达。结果 Aldo可诱导磷酸化P42／44的表达，并呈时间依赖性，10min达到峰值，之后逐渐减低。U0126可抑制磷酸化P42／44的表达。Aldo可增强HSC的AP-1的DNA结合活性。U0126可以显著抑制Aldo诱导的AP—1的活化，NAC部分抑制Aldo诱导的AP-1的活化。Aldo可诱导α1-1型前胶原mRNA的表达。U0126和NAC可显著抑制Aldo诱导的α1-1型前胶原mRNA表达增强。结论 Aldo可经ERK通路诱导HSC AP-1结合活性增强。Aldo可经AP-1通路调控α1-1型前胶原基因的表达。     

丹参素对大鼠肝星状细胞氨基末端蛋白激酶信号转导的影响

目的 探讨丹参素抗肝纤维化作用的机制. 方法分离大鼠原代肝星状细胞(HSC),用0.0312、0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000 mmol/I.不同浓度丹参素作用于HSC,四甲基偶氮唑黼法检测丹参素对HSC生长增殖的抑制作用;应用免疫细胞化学法观察Ⅰ型胶原合成,酶联免疫吸附法观察Ⅰ型胶原分泌.Western blot法观察丹参索对白细胞介素-1 β(IL-1 β)刺激的HSC内氨基末端蛋白激酶(JNK)蛋白及其磷酸化表达的影响.采用随机设计的方差分析,SNK-q进行统计学处理. 结果与0 mmol/L组比较,丹参素其他浓度组明显抑制了HSC增殖,并旱剂量依赖性.丹参素(0.0625～0.2500 mmol/L)对IL-1 β引起的HSC增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性.0.25 mmol/L丹参素对正常培养的和经IL-1 β刺激的HSC作用24 h能下调Ⅰ型胶原的合成和分泌.IL-1 β能刺激ttSC中p-JNK的明显表达,丹参素能下凋亡IL-1 β诱导的ItSC中P-JNK的表达,但其对JNK表达水平没有明显影响. 结论丹参索可抑制正常传代培养的和经IL-1 β刺激的人鼠HSC增殖、Ⅰ型胶原合成与分泌,其机制可能与抑制JNK信号转导通路有关.     

JNK信号转导通路与糖尿病

c-jun氨基末端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员。JNK信号转导通路参与细胞的胚胎发育、分化、凋亡等。JNK相互作用蛋白-1/(JIP-1)/IB1(islet-brain-1)是哺乳动物JNK信号转导通路的支架蛋白,通过蛋白质之间的相互作用对JNK信号转导通路起关键的调节作用。JNK信号转导通路参与β细胞凋亡、胰岛素基因表达障碍和胰岛素抵抗的发生机制。通过改变细胞中JIP-1的含量等方法抑制JNK的活性或干扰JNK与胰岛素受体底物(IRS)-1的相互作用可成为糖尿病治疗的新靶点。     

sp600125对乙醛刺激的HSC-T6细胞株的影响

肝星状细胞(HSC)的增殖与凋亡在肝纤维化的形成缮中起作十分重要的作用.乙醛刺激的HSC增殖是导致酒精性肝纤维化发生的关键因素 [1-2].丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)包括细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38,是HSC激活、增殖并导致肝纤维化发生的主要信号传导通路之一,其中,JNK信号传导通路参与了细胞增殖、分化以及凋亡的调控.我们既往对肝纤维化发病机制的研究结果证实,乙醛刺激的HSC中,p-JNK水平随JNK信号传导通路特异阻断剂sp600 125浓度增加而减少[3].     

姜黄素激活PPARγ下调肝星状细胞α-SMA和Ⅰ型胶原的基因表达

[目的]研究姜黄素抑制大鼠肝星状细胞（HSC）活化作用与过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPARγ）信号转导途径之间的关系。[方法]肝脏原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心方法分离培养大鼠HSC，并使用姜黄素对细胞进行相应处理，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色分析法检测姜黄素对细胞增殖的影响。收集裂解细胞并抽提细胞总RNA，采用半定量RT-PCR检测姜黄素处理对α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原的基因表达水平的影响。[结果]姜黄素在10-50μmol／L范围内呈剂量依赖性抑制体外培养大鼠传代HSC的增殖，且能在基因水平显著降低α-SMA（P〈0．05）和Ⅰ型胶原的基因表达水平（P〈0．01）。这些作用均可以被PPARγ特异性阻断剂GW9662阻断。[结论]姜黄素抑制HSC增殖、活化和合成Ⅰ型胶原的作用依赖于PPARγ信号转导途径的激活。     

白细胞介素7对转化生长因子β1诱导的大鼠肝星状细胞的影响

肝星状细胞(HSC)的活化和增殖是肝纤维化形成的关键环节[1].转化生长因子(TGF)β1可通过HSC内的TGFβ/Smads信号通路促进纤维化的发生发展,被认为是调控肝纤维化的核心物质.抑制TGFβ1合成或其信号传导已证明能拮抗HSC活化与细胞外基质的产生,成为抗肝纤维化的主要目标[2].IL-7是在骨髓中最早发现的一种细胞因子,以往研究证实其能通过上调成纤维细胞Smad7的表达抑制TGFβ/Smads信号通道,具有抗纤维化的作用[3-5].本实验旨在了解IL-7在肝纤维化中的作用,并探讨其作用的分子机制.     

血小板源生长因子BB通过JNK调控大鼠主动脉平滑肌细胞β-catenin核内外分布

目的探讨阻断JNK后对血小板源生长因子BB引起的细胞增殖的影响以及JNK对血小板源生长因子BB(50μg/L)刺激导致的β-catenin核内外分布的影响。方法应用CCK8法测定不同浓度JNK抑制剂SP600125(10、20和40μg/L)对血小板源生长因子BB诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响。应用WesternBlotting法检测血小板源生长因子BB刺激后不同时间点p-JNK、JNK及胞浆和胞核β-catenin的表达变化,以及在应用不同浓度SP600125(10、20和40μg/L)后对p-JNK以及胞核β-catenin表达的影响。免疫荧光法检测血小板源生长因子BB刺激后和给予JNK抑制剂后β-catenin的核内外分布变化。结果血小板源生长因子BB(50μg/L)显著促进大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖(0.876±0.041比0.370±0.082,P0.01),在给予不同浓度(10、20和40μg/L)JNK抑制剂SP600125后平滑肌细胞增殖成浓度依赖性下降(0.635±0.063、0.470±0.044和0.381±0.054比0.876±0.041,P0.01)。血小板源生长因子BB刺激15 min后p-JNK及60 min后细胞核内β-catenin的表达达峰值,在给予不同浓度SP600125后p-JNK和细胞核内β-catenin的表达成浓度依赖性下降。免疫荧光检测提示血小板源生长因子BB刺激60 min后β-catenin核内聚集明显,而在给予SP600125(40μg/L)后β-catenin核内聚集受到了抑制。结论 JNK磷酸化在血小板源生长因子BB刺激引起的β-catenin核内聚集中起关键调节作用。     

皮肤老化相关的信号转导分子研究进展

多种信号转导分子如NF-κB、IGF、TGF-β、AP-1、EGFR等参与皮肤老化过程。研究表明,紫外线等内外源信号刺激皮肤时,可引起这些信号转导分子结构及活性的改变,从而影响其相关信号通路,最终改变靶基因的表达而影响皮肤细胞的结构和功能。本文从NF-κB、IGF、TG-β、AP-1、EGFR的结构特点及其活性或通路的改变阐述了信号转导分子与皮肤老化的相关性。