大鼠PnNOS基因修饰脂肪源性干细胞的构建

目的 构建过表达大鼠阴茎神经源性一氧化氮合酶（PnNOS）基因大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）,为基因修饰ADSCs移植治疗勃起功能障碍（ED）大鼠模型提供种子细胞.方法 获取大鼠PnNOS基因,并与线性化的腺病毒真核表达载体pDC315-EGFP定向克隆连接.构建正确的pDC315-PnNOS-EGFP穿梭质粒转染293 T细胞,采用Western Blot检测PnNOS基因在293 T细胞中的表达情况.利用AdMax腺病毒包装系统包装产生重组腺病毒,包装后扩增纯化并测定病毒滴度.PnNOS基因重组腺病毒转染大鼠ADSCs,观察GFP表达情况和Western Blot检测PnNOS基因表达情况.结果 经PCR鉴定、限制性酶切分析、测序鉴定和目的质粒Western Blot表达检测鉴定,证实pDC315-PnNOS-EGFP重组腺病毒载体构建成功.重组腺病毒包装成功且病毒滴度为5.0×109 PFU/ml.Western Blot于大鼠ADSCs中检测到约161 KDa大小条带,其与PnNOS蛋白分子量大小基本相一致.结论 大鼠PnNOS基因修饰的ADSCs构建成功,从而为基因修饰ADSCs移植治疗ED提供了良好的基因工程细胞.     

人血管生成素2原核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人血管生成素2( Angiopoietin2)原核表达载体.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获取Angiopoietin2基因片段,然后将其克隆入pET32a质粒载体表达系统,实现Angiopoietin2在大肠杆菌BL21中的稳定表达,并通过凝胶电泳、SDS-PAGE及基因测序等对表达蛋白进行鉴定.结果 从HUVEC中克隆出约1.5kb的Angiopoietin2基因,通过pET32a载体系统实现了Angiopoietin2蛋白的表达,SDS-PAGE、电泳及测序分析证实表达成功,融合蛋白相对分子质量为70×103.结论 应用基因重组技术成功构建了人Angiopoietin2原核表达载体.     

构建含有小鼠CD40-IgG2aFc-IRS-GFP融合基因腺病毒并体外检测

目的 构建载有小鼠CD40-IgG2aFc-IRS-GFP融合基因片段的腺病毒载体,并检测其转染293细胞后的融合蛋白表达及出毒情况.方法 提取小鼠CD40、IgG2aFc基因片段构建PDC316-IgG2aFc-GFP质粒,测序成功后包装构建Ad5-PDC316-CD40-IgG2aFc-GFP,转染293细胞.出毒后大量复制病毒并纯化,测定病毒滴度,体外感染细胞观察病毒复制及分泌目的 蛋白情况并检测目的 蛋白表达量.结果 成功构建了质粒及病毒,体外感染显示该病毒能有效的感染细胞并表达蛋白(荧光显示),检测目的 蛋白表达量随时间点及浓度增加而增加.当病毒浓度增加到一定程度时目的 蛋白表达趋于无明显差异性.结论 构建小鼠融合基因片段并成功转入细胞内,分泌表达目的 蛋白是可行的,为进一步研究该病毒在大鼠体内感染及表达CD40Ig、大鼠肝移植模型免疫耐受及其机制的研究奠定了基础.     

可体内、外示踪的BMP2真核表达载体的构建和表达

目的 拟构建双顺反子增强型绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)真核表达载体,为其在真核细胞体内外示踪定位打下基础.方法 以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法获得BMP2片段,将其分别与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定.将质粒转染CHO细胞后Western Blot检测BMP2蛋白表达,用RT-PCR检测BMP2mRNA表达.结果 琼脂糖电泳显示PCR产物为一条长约1216 bp的带,重组表达载体pSELECT-GFP zeo-hBMP2经双酶切可得到约1216 bp的片段,测序证实与Genebank中hBMP2序列完全相符,重组表达载体脂质体法转染CHO细胞48～72 h后荧光显微镜下证实转染成功,经RT-PCR证实CHO细胞中存在BMP2基因表达,采用免疫荧光化学方法证实载体中CHO细胞表达BMP2蛋白.经Western Blotting鉴定重组蛋白为分泌蛋白,相对分子质量在17×103左右.结论 成功构建可体内外示踪增强含双顺反子绿色荧光蛋白人BMP2真核表达载体.     

人PAX8与PPARγ的融合基因（PPFP）的克隆及其重组质粒的构建

目的 探讨人PAX8/FPARγ融合基因(PPFP)表达质粒在甲状腺上皮细胞中的表达及作用.方法 从含有PAX8基因和PPARγ基因的质粒克隆模板PAX8-pOTB7及PPARγ-pCMV-SPORT6中,利用PCR方法 调取目的 基因PAX8和PPARγ,将PAX8和PPARγ定向连接后克隆到pEGFP-C1载体上,构建融合基因的真核表达质粒pEGFP-C1-PAX8/PPARγ,在大肠杆菌E.coli DH5α中转化并提取质粒,通过PCR和测序、分析比对验证PPFP融合基因后,将真核表达载体pEGFP-C1-PAX8/PPARγ的质粒用脂质体包合并转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1,通过RT-PCR和Western blot鉴定PPFP融合基因于靶细胞内在mRNA和蛋白水平上的表达.结果 构建的质粒通过鉴定证实正确;该质粒转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1后,经验证显示PPFP融合基因在mRNA和蛋白水平上顺利表达.结论 成功克隆了PPFP融合基因并构建其重组质粒pEGFP-C1-PAX8/PPARγ;该质粒转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1后可顺利表达PPFP蛋白,为进一步研究PPFP基因致瘤作用的分子机制提供了实验基础.     

人附睾ESC42基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人附睾ESCA2(hESCA2)的真核表达载体,分析其在COS-7细胞中的表达.方法 从人附睾cDNA文库中PCR扩增hESCA2片段,通过DNA重组构建真核表达载体pEGFP-N1-hESC42,瞬时转染COS-7细胞,应用RT-PCR、激光扫描共聚焦技术和Western blot检测融合蛋白的表达.结果 成功地构建了真核表达载体pEGFP-N1-hESC42;以重组载体转染COS-7细胞后,RT-PCR结果 显示hESC42与EGFP在mRNA水平正确拼接;共聚焦证实有hESCA2融合蛋白的表达;转染细胞的培养上清浓缩后,进行SDS-PAGE及Western blot分析,可检出hESC42融合蛋白的表达.结论 成功地构建了hESC42基因,并可在COS-7细胞中分泌表达,为其功能研究提供线索.     

Tip30真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的：探讨人Tip30全长基因的真核表达载体pAAV-TIP30的构建,并观察其转染肝癌细胞株HepG2后的表达。方法：以正常人肝组织mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增Tip30,利用限制性内切酶BamH I和Xba I,将Tip30基因克隆到真核表达载体pAAV-MCS中,并经酶切和测序鉴定。重组质粒转染HepG2细胞,运用Western blot法检测Tip30蛋白表达。结果：RT-PCR方法正确地扩增出全长Tip30基因。限制性内切酶酶切和测序结果证实Tip30基因克隆完全正确。重组质粒转染肝癌细胞系HepG2后,Western blot证实Tip30蛋白表达增高。结论：成功构建了真核表达重组质粒pAAV-TIP30并转染HepG2细胞,为进一步研究Tip30基因对肝癌的影响及其机制打下了基础。     

人睾丸基因TDRG1重组真核载体的构建及其表达

目的 构建人睾丸基因TDRGl的真核表达质粒,并研究其表达.方法 取人新鲜正常睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录.聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增TDRG1基因编码序列;将该基因克隆到真核表达载体pYD5中,构建真核细胞表达载体pYD5-TDRG1,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的重组质粒pYD5-TDRG1在脂质体介导下转染293细胞,间接免疫荧光法和Western Blot法鉴定目的 蛋白质的表达.结果 RT-PCR扩增出TDRGl基因编码序列,目的 插入片段长约303bp:产物行限制性内切酶酶切后连接到真核表达载体pYD5,重组质粒pYD5-TDRG1经酶切及DNA测序鉴定构建成功:该质粒转染293细胞48h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,阳性细胞率96.42%;行Western blot分析检测到约39-8kD的目的 蛋白表达.结论 成功构建了人类睾丸基因TDRG1的真核表达载体pYD5-TDRG1,TDRG1基因在293细胞内成功表达.     

Lck反义RNA重组腺病毒载体的构建及其对肾小管上皮细胞Lck表达的影响

目的:观察淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)在肾小管上皮细胞中的表达及Lck反义RNA对其表达的影响.方法:采用RT-PCR方法从肾小管上皮细胞中获得Lck目的基因片段,将目的基因片段反向插入pDC 316质粒中,构建Lck反义RNA穿梭质粒(pDC 316-antisenseLck),经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将此穿梭质粒与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre 共转染HEK 293细胞,重组产生Lck基因反义RNA腺病毒载体(Ad-antisenseLck).用此重组腺病毒感染体外培养的肾小管上皮细胞,Western blotting方法观测此重组腺病毒载体对IL-2诱导的Lck蛋白表达的影响.结果:构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此重组腺病毒载体感染培养的肾小管上皮细胞后可明显抑制IL-2诱导的Lck蛋白表达(P<0.05),抑制率可达47%.结论:成功构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此载体可在肾小管上皮细胞内发挥生物学作用,显著阻抑肾小管上皮细胞的Lck蛋白表达.     

克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体

目的探讨构建人骨形成蛋白2(human bone morphgenetic protein 2,hBMP 2)真核表达载体的方法.方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM T hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒.分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1( )真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1( )真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序.结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP 2扩增条带,重组质粒pGEM T-hBMP 2经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP 2条带和4.0 kbp的载体片断;pcDNA3.1 hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与Gene Bank中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合.结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体.