重组人骨形态发生蛋白7腺病毒载体构建及在小鼠成肌细胞中的表达

目的:构建重组人骨形态发生蛋白7的腺病毒载体(AdBMP7),并观察其在小鼠成肌细胞C2C12细胞中的表达情况。方法:实验于2004-05/10在北京大学医学部完成。RT-PCR方法从HKE293细胞中克隆出hBMP7cDNA并亚克隆入穿梭质粒pAdtrackcmv中,构建pAdtrackcmv-hBMP7质粒。该质粒和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组后挑选阳性重组体pAd-hBMP7质粒。线性化pAd-hBMP7质粒转染293A细胞后检测病毒噬斑形成情况,并于转染后9d收获病毒,大量扩增并制备高纯度、高滴度的AdBMP7。将AdBMP7按MOI=100来感染C2C12细胞,48h后分别应用RT-PCR和免疫组化方法来检测hBMP7在mRNA和蛋白水平的表达。结果:成功克隆出hBMP7cDNA,酶切鉴定pAdtrackcmv-hBMP7和pAd-hBMP7质粒正确重组,获得纯化后滴度达到5×1012vp/mL的AdBMP7。AdBMP7能有效感染C2C12细胞并表达hBMP7蛋白。结论:应用AdEasy-1腺病毒载体系统可在短期内制备高滴度的携带GFP和hBMP7的重组腺病毒AdBMP7,并在为进一步研究BMP7基因治疗促进骨愈合打下基础。     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的构建及鉴定

目的：采用多聚酶链反应及酶切鉴定，拟构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体，以便利用局部基因治疗方法进一步在体内获得重组人骨形态发生蛋白7。 方法：实验于2004-05／2005-10在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成。含人骨形态发生蛋白7基因全长cDNA质粒pUC118．BMP-7由第一作者构建并保存。将人骨形态发生蛋白7基因克隆至pcDNA3．1／CT-GFP质粒中。酶切回收的BMP-7／GFP基因片段，克隆人pAxCAwt腺病毒载体后，共转染大肠杆菌LE393，获得腺病毒重组质粒，大量扩增后转入293细胞包装，获得重组腺病毒。用病毒上清液感染293细胞及Hela细胞，293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判定为重组腺病毒株。 结果：①骨形态发生蛋白7基因的获得：KpnI及XbaI双酶切、琼脂凝胶电泳检测可见2条带，略小于500bp的条带是长度为430bp的骨形态发生蛋白7基因，略大于2500bp的条带是长度约为2600bp的pUC118。②重组质粒pcDNA3．1BMP-7／GFP的构建：所挑选的5个转化子均可见略大于1000bp的条带，全部为阳性克隆。③重组粘粒pAxCAwT．BMP-7．GFP的构建：所挑选的5个转化子中2个可见大于1000bp的条带，为正向插入的阳性克隆。 结论：多聚酶链反应及酶切鉴定证明骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建，并包装出重组腺病毒，为骨损伤疾病进行原位组织工程修复奠定基础。     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的构建及鉴定

目的:采用多聚酶链反应及酶切鉴定,拟构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体,以便利用局部基因治疗方法进一步在体内获得重组人骨形态发生蛋白7。方法:实验于2004-05/2005-10在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成。含人骨形态发生蛋白7基因全长cDNA质粒pUC118.BMP-7由第一作者构建并保存。将人骨形态发生蛋白7基因克隆至pcDNA3.1/CT-GFP质粒中,酶切回收的BMP-7/GFP基因片段,克隆入pAxCAwt腺病毒载体后,共转染大肠杆菌LE393,获得腺病毒重组质粒,大量扩增后转入293细胞包装,获得重组腺病毒。用病毒上清液感染293细胞及Hela细胞,293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判定为重组腺病毒株。结果:①骨形态发生蛋白7基因的获得:KpnI及XbaI双酶切、琼脂凝胶电泳检测可见2条带,略小于500bp的条带是长度为430bp的骨形态发生蛋白7基因,略大于2500bp的条带是长度约为2600bp的pUC118。②重组质粒pcDNA3.1BMP-7/GFP的构建:所挑选的5个转化子均可见略大于1000bp的条带,全部为阳性克隆。③重组粘粒pAxCAwT.BMP-7.GFP的构建:所挑选的5个转化子中2个可见大于1000bp的条带,为正向插入的阳性克隆。结论:多聚酶链反应及酶切鉴定证明骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建,并包装出重组腺病毒,为骨损伤疾病进行原位组织工程修复奠定基础。     

构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒在兔骨髓基质干细胞中的表达

目的：构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞中的表达。 方法：实验于2005-03／12在解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所完成。①分别克隆人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因，分别依次亚克隆至穿梭载体构建重组穿梭质粒pAdT-B2V并酶切鉴定；后经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1 Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定。②PacI酶切线性化后的pAdBMP-7腺病毒质粒转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7，在荧光显微镜下计算表达绿色荧光蛋白细胞个数，测定AdB2V滴度。③将AdBMP-7体外感染兔骨髓基质干细胞后，以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达及反转录-聚合酶链反应方法鉴定外源基因的表达，以B-肌动蛋白为内参照，未感染细胞为对照。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后72h以免疫细胞化学染色方法检测外源基因的表达，以未感染组为对照。 结果：①酶切鉴定表明外源基因已插入到pAdTrack—CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功。②经293细胞包装3d后可观察到绿色荧光蛋白表达，氯化铯梯度离心法最终获得约3&;#215;10^9 efu／L滴度的重组腺病毒。③体外感染兔骨髓基质干细胞后荧光显微镜观察及反转录-聚合酶链反应证实外源基因可在兔骨髓基质干细胞中表达，未感染组为阴性。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后以免疫细胞化学染色均观察到外源基因的阳性表达，未感染组呈阴性表达。 结论：成功构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒，证实了其在兔骨髓基质干细胞的表达，为骨再生的局部联和基因治疗打下基础。     

重组人骨形态发生蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定

背景:目前报道的重组腺病毒构建方法较复杂,构建周期长,导致重组腺病毒构建的成功率较低.GatewayTM技术是基于λ噬菌体的位点特异性高效重组系统,其构建重组病毒载体具有快捷高效的特点.目的:构建含人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体,为应用骨形态发生蛋白2基因治疗的研究奠定基础.设计、时间及地点:单一样本规察,实验于2008-02/06在深圳市第二人民医院中心实验室完成.材料:pOTB7-BMP-2质粒、HEK293为ATTC产品;BLOCK-iTTMAdenovirus Expression System为Invitrogen产品;大肠杆菌DH5 α为Biontex产品.方法:用聚合酶链反应方法扩增骨形态发生蛋白2目的基因,并插入载体pMD19-T Simple Vector中进行测序分析.将骨形态发生蛋白2基因亚克降到穿梭载体pEC3.1(+)中,构建pEC3.1-BMP-2穿梭质粒,再将其中的表达盒通过重组克隆到pAd/BLOCK-iTTM-DEST腺病毒载体中,线性化后转293细胞进行包装获得重组腺病毒rAd-BMP2.主要观察指标:①目的基因骨形态发生蛋白2的聚合酶链反应扩增.②重组质粒TS-BMP2的构建.⑨重组pEC3.1-BMP2的构建.④重组pAd-BMP2的构建.⑤重组腺病毒的制备与鉴定.结果:正确扩增长约1.2 kb的骨形态发生蛋白2 cDNA,并成功地构建其腺病毒载体,经线性化的pAd-BMP2 DNA转染HEK293细胞,包装、扩增后得到入骨形态发生蛋白2重组腺病毒(rAd-BMP2),其滴度约为1×1010PFU/mL,该滴度可满足进一步的骨形态发生蛋白2成骨作用的研究.结论:成功地构建重组人骨形态发生蛋白2腺病毒载体.     

动物模型中人骨形态发生蛋白2重组腺病毒活性观测

目的：利用基因工程技术构建人骨形态发生蛋白2重组腺病毒，并进行体内表达，测定活性；为深入开展的基因治疗研究创造条件。方法：实验于2000—05／2002—06在西安交通大学第一附属医院骨科实验室完成。应用PcR技术扩增出人骨形态发生蛋白2全长基因，体外同源重组构建重组腺病毒后，随机将30只SD大鼠分为治疗组和对照组，每组15只，将纯化后的重组腺病毒50μL注入sD大鼠股部肌肉陷窝病损处，通过组织学染色、X射线片对动物模型的组织变化进行观测。结果：6周后治疗组可见明显骨诱导形成，2周时治疗组碱性磷酸酶活性明显高于对照组，重组腺病毒治疗组有明显的诱导成骨活性。结论：应用于动物实验中目的基因表达，并具有生物学活性。本研究是在骨缺损基因治疗的一次尝试，且人骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功，也为国内骨科疾病基因治疗的进一步研究提供了基础。     

构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒在兔骨髓基质干细胞中的表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞中的表达。方法:实验于2005-03/12在解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所完成。①分别克隆人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因,分别依次亚克隆至穿梭载体构建重组穿梭质粒pAdT-B2V并酶切鉴定;后经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定。②PacI酶切线性化后的pAdBMP-7腺病毒质粒转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,在荧光显微镜下计算表达绿色荧光蛋白细胞个数,测定AdB2V滴度。③将AdBMP-7体外感染兔骨髓基质干细胞后,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达及反转录-聚合酶链反应方法鉴定外源基因的表达,以β-肌动蛋白为内参照,未感染细胞为对照。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后72h以免疫细胞化学染色方法检测外源基因的表达,以未感染组为对照。结果:①酶切鉴定表明外源基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功。②经293细胞包装3d后可观察到绿色荧光蛋白表达,氯化铯梯度离心法最终获得约3×109efu/L滴度的重组腺病毒。③体外感染兔骨髓基质干细胞后荧光显微镜观察及反转录-聚合酶链反应证实外源基因可在兔骨髓基质干细胞中表达,未感染组为阴性。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后以免疫细胞化学染色均观察到外源基因的阳性表达,未感染组呈阴性表达。结论:成功构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒,证实了其在兔骨髓基质干细胞的表达,为骨再生的局部联和基因治疗打下基础。     

重组人骨形态发生蛋白7腺病毒载体构建及在原代培养兔髓核细胞中的表达

目的：研究表明，外源性重组骨形态发生蛋白7具有促进椎间盘细胞增殖以及促进细胞外基质合成的能力，为探讨骨形态发生蛋白7基因疗法治疗椎间盘退变的可行性，本实验拟构建重组人骨形态发生蛋白7的腺病毒载体，并观察其在原代培养的兔椎间盘髓核细胞中的表达情况。 方法：实验于2005—12／2006—06在长海医院胸心外科研究所完成。从整合有人骨形态发生蛋白7全长cDNA的真核表达质粒pcDNA3．1（＋）－骨形态发生蛋白7中聚合酶链反应扩增骨形态发生蛋白7基因的开放读码框，通过穿梭质粒整合到腺病毒载体pAd－Easy系统上，在293细胞中包装成熟、扩增，酶切鉴定人骨形态发生蛋白7基因整合到该载体中；该载体转染原代培养的兔髓核细胞，并采用反转录－聚合酶链反应和蛋白免疫印迹的方法检测其表达情况。 结果：①实验成功建立了安全、稳定、有效的复制缺陷重组腺病毒Ad－骨形态发生蛋白7的构建方法，经鉴定后证实有骨形态发生蛋白7全长cDNA整合，并且为正向插入。②体外培养的兔原代髓核细胞表现出代谢活性低、增殖能力弱等特点；髓核细胞能够被腺病毒载体高效感染并能够高效表达不同的目的基因，感染效率随感染倍数值的增加而增加；当感染倍数=100时，95％以上的髓核细胞可以被感染，且细胞毒性较小，为最佳感染倍数。③采用最佳感染倍数转染髓核细胞后骨形态发生蛋白7基因在转染后3d就开始表达，并可以持续表达3周以上，几乎所有髓核细胞都可以表达骨形态发生蛋白7。 结论：腺病毒载体可以作为进行骨形态发生蛋白7基因治疗椎间盘退变研究的有效载体。     

骨髓基质细胞分化状态对腺病毒介导骨形态发生蛋白2表达效应的影响

目的:利用骨形态发生蛋白2腺病毒转染向成骨细胞分化的骨髓基质细胞,在体外观察骨形态发生蛋白2的表达量和反应成骨细胞特性的指标变化。方法:实验于2002-04/12在北京大学第三医院中心实验室进行。6周龄雄性BALB/c小鼠60只用于骨髓基质细胞提取,小鼠骨髓基质细胞分别用Dulbecco改良的Eagle培养基液和骨诱导培养基(含地塞米松10-8mol/L、L-抗坏血酸50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/LDulbecco改良的Eagle培养基液)培养。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞的碱性磷酸酶比活性的比较:取原代培养的骨髓基质细胞,分别加入转染指数25,50,100,200骨形态发生蛋白2腺病毒,以不加骨形态发生蛋白2腺病毒的骨髓基质细胞作为对照。6d后收集细胞,测定碱性磷酸酶活性。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较:实验分5组:骨髓基质细胞组,用Dulbecco改良的Eagle培养基培养9d;骨诱导培养3d组,骨诱导培养3d改用Dulbecco改良的Eagle培养基培养6d;骨诱导培养9d组,骨诱导培养9d;骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒组,骨诱导培养3d,加入转染指数50的骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d;骨形态发生蛋白2腺病毒组,用Dulbecco改良的Eagle培养基培养3d,加入同量骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d。收集细胞,测定碱性磷酸酶比活性。③骨形态发生蛋白2与骨桥蛋白检测:采用免疫组织化学染色与蛋白印迹方法。实验采用拉丁方设计。结果:应用骨诱导培养基或转染骨形态发生蛋白2腺病毒均使细胞碱性磷酸酶比活性明显增加(P<0.05)。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞碱性磷酸酶比活性的比较:骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=50)组碱性磷酸酶比活性显著高于骨髓基质细胞组和骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=25,100,200)组犤(7658.53±1600.32)比(1932.89±665.30),(4311.53±1108.89),(5360.90±1374.61),划内(2661.86±653.46)nkat/(g·L),P<0.01犦。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较:骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=50)组与骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=50)组差异无显著性(P>0.05),显著高于骨诱导培养3d组和骨诱导培养9d组(P<0.05)。③骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白检测结果:骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒组两指标表达量均最高。结论:单纯用诱导Dulbecco改良的Eagle培养基以及先诱导培养再加入骨形态发生蛋白2腺病毒均可促进骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化,但是骨髓基质细胞用骨诱导培养基作用3d再加入骨形态发生蛋白2腺病毒能分泌表达更多的骨形态发生蛋白2,从而提高了目的基因表达的效应。     

骨形态发生蛋白在大段同种异体骨移植中的表达

目的:通过动物实验来探讨骨形态发生蛋白在大段同种异体骨移植愈合中的表达及其意义。方法:实验于2005-10/2006-01在南京军区总院动物实验中心完成。①24只新西兰大白兔随机分为实验组和对照组各12只。实验组,手术移植用梯度降温深低温保存的同种异体兔股骨半髁植入,以金属螺钉固定;对照组将取下的自体股骨半髁原位植入,用与实验组相同的内固定方法固定。②术后4,8,12周取标本行大体标本观察,苏木精-伊红及骨形态发生蛋白免疫组织化学染色,观察骨形态发生蛋白在大段同种异体骨愈合过程的表达情况。结果:24只兔均进入结果分析。①两组移植骨段大体观察:第12周,实验组与对照组移植骨段已与宿主完全连接成一整体,外周骨痂已塑形。②两组自体骨与异体骨苏木精-伊红染色结果:第12周,实验组自体骨与异体骨间见较多成熟骨小梁,自体骨与异体骨连接处髓腔基本融合,于异体骨外侧新形成皮质骨结构。对照组已形成新皮质结构,有大量成熟的骨小梁结构,髓腔基本融合。③骨形态发生蛋白免疫组织化学染色结果:第4周:实验组皮质骨外周见较强的骨形态发生蛋白表达,阳性染色主要位于不成熟的骨细胞、成骨细胞、软骨细胞的胞浆及其分泌的基质中,表明骨形态发生蛋白通过“旁分泌”和“自分泌”的形式使得间质细胞分化为软骨细胞和骨细胞。对照组骨折断端两侧均有骨形态发生蛋白表达。第8周:异体皮质骨周围的骨痂中可见阳性表达,新形成的管状结构中呈“镶边”样排列的成骨细胞为阳性表达,其周围尚有一些软骨细胞核阳性表达。对照组与实验组相似,新生血管和新骨生成较实验组为多。第12周:实验组及对照组骨形态发生蛋白表达均较少。深低温保存的同种异体骨移植过程中骨形态发生蛋白表达与自体骨相似。骨形态发生蛋白染色在新生骨及其周围类基质表达阳性。结论:①骨形态发生蛋白在同种异体骨移植愈合早期起重要作用,其通过“旁分泌”和“自分泌”的形式使得间质细胞分化为软骨细胞和骨细胞,从而促使新骨形成。②大段同种异体骨移植愈合早期(4周)过程中骨诱导与骨吸收同时存在时,骨形态发生蛋白发生重要作用。     

动物模型中人骨形态发生蛋白2重组腺病毒活性观测

目的:利用基因工程技术构建人骨形态发生蛋白2重组腺病毒,并进行体内表达,测定活性;为深入开展的基因治疗研究创造条件。方法:实验于2000-05/2002-06在西安交通大学第一附属医院骨科实验室完成。应用PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白2全长基因,体外同源重组构建重组腺病毒后,随机将30只SD大鼠分为治疗组和对照组,每组15只,将纯化后的重组腺病毒50μL注入SD大鼠股部肌肉陷窝病损处,通过组织学染色、X射线片对动物模型的组织变化进行观测。结果:6周后治疗组可见明显骨诱导形成,2周时治疗组碱性磷酸酶活性明显高于对照组,重组腺病毒治疗组有明显的诱导成骨活性。结论:应用于动物实验中目的基因表达,并具有生物学活性。本研究是在骨缺损基因治疗的一次尝试,且人骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功,也为国内骨科疾病基因治疗的进一步研究提供了基础。     

三种不同载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应

目的：比较牛松质骨粒、磷酸三钙、天然珊瑚载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应。方法：实验于1998-12／2002—06在第四军医大学骨科实验室完成。①重组人骨形态发生蛋白2与牛松质骨粒、天然珊瑚和磷酸三钙按相同比例复合形成3种载体释放系统。②取昆明小鼠90只，随机分为3组，牛松质骨粒组、天然珊瑚组和磷酸三钙组，每组30只。于小鼠股部肌袋一侧植入重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统，另一侧单纯植入0．2mg重组人骨形态发生蛋白2。③分别于植入后7，14，21d周麻醉状态下每组各处死10只，取材行组织学检查、成骨量分析和碱性磷酸酶活性测定。结果：90只小鼠全部进入结果分析。①组织学检查术后不同时间牛松质骨粒组和磷酸三钙组成软骨和成骨能力较强，而天然珊瑚组成骨能力稍差。21d的成骨量分析显示牛松质骨粒组、磷酸三钙组和天然珊瑚组分别较对照组成骨量放大了5．47倍、4．90倍和1，65倍。②牛松质骨粒组、磷酸三钙组之间碱性磷酸酶活性没有显著差异（P〉0．05），均显著大于天然珊瑚组（P〈0．05），3组的碱性磷酸酶活性高峰出现在术后第21天[依次为（285．09&;#177;52．29），（256．48&;#177;45．99），（177．92&;#177;22．69）nkat／g]。结论：比较3种不同的重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统。异种松质骨粒表现较强的成骨能力，提出载体放大效应应成为重组人骨形态发生蛋白2载体选择标准之一。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒的构建与鉴定

背景:骨形态发生蛋白2是诱导成骨关键物质,参与调节从细胞增殖、决定种系分化方向到细胞死亡等一系列的生物过程。目的:利用AdMax系统构建人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法:以人cDNA为模板PCR扩增人骨形态发生蛋白2基因,转化E.coli感受态细胞,经菌落PCR鉴定阳性转化子、阳性克隆测序无误后,扩增、抽提。将带有目的基因的腺病毒表达载体和携带有腺病毒大部分基因的辅助包装质粒共转染293细胞进行病毒包装扩增,PCR检测目的基因、Western Blot检测目的蛋白及终点稀释法检测病毒滴度。结果与结论:PCR获得长度为1223bp的人骨形态发生蛋白2目的基因片段,同源重组表达载体经阳性克隆PCR及测序鉴定,结果正确。293细胞内包装、扩增,经Westernblot及PCR鉴定无误后,获得病毒滴度为5×1013pfu/L的重组腺病毒。实验成功构建携带有人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体（Ad-BMP-2/GFP）转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

三种不同载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应

目的:比较牛松质骨粒、磷酸三钙、天然珊瑚载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应。方法:实验于1998-12/2002-06在第四军医大学骨科实验室完成。①重组人骨形态发生蛋白2与牛松质骨粒、天然珊瑚和磷酸三钙按相同比例复合形成3种载体释放系统。②取昆明小鼠90只,随机分为3组,牛松质骨粒组、天然珊瑚组和磷酸三钙组,每组30只。于小鼠股部肌袋一侧植入重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统,另一侧单纯植入0.2mg重组人骨形态发生蛋白2。③分别于植入后7,14,21d周麻醉状态下每组各处死10只,取材行组织学检查、成骨量分析和碱性磷酸酶活性测定。结果:90只小鼠全部进入结果分析。①组织学检查术后不同时间牛松质骨粒组和磷酸三钙组成软骨和成骨能力较强,而天然珊瑚组成骨能力稍差。21d的成骨量分析显示牛松质骨粒组、磷酸三钙组和天然珊瑚组分别较对照组成骨量放大了5.47倍、4.90倍和1.65倍。②牛松质骨粒组、磷酸三钙组之间碱性磷酸酶活性没有显著差异(P>0.05),均显著大于天然珊瑚组(P<0.05),3组的碱性磷酸酶活性高峰出现在术后第21天犤依次为(285.09±52.29),(256.48±45.99),(177.92±22.69)nkat/g犦。结论:比较3种不同的重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统,异种松质骨粒表现较强的成骨能力,提出载体放大效应应成为重组人骨形态发生蛋白2载体选择标准之一。     

骨髓基质细胞分化状态对腺病毒介导骨形态发生蛋白2表达效应的影响

目的：利用骨形态发生蛋白2腺病毒转染向成骨细胞分化的骨髓基质细胞，在体外观察骨形态发生蛋白2的表达量和反应成骨细胞特性的指标变化。方法：实验于2002-04／12在北京大学第三医院中心实验室进行。6周龄雄性BALB／c小鼠60只用于骨髓基质细胞提取，小鼠骨髓基质细胞分别用Dulbecco改良的Eagle培养基液和骨诱导培养基（含地塞米松10^-8mol／L、L广抗坏血酸50mg／L、β-甘油磷酸钠10mmoL／L Dulbecco改良的Eagle培养基液）培养。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞的碱性磷酸酶比活性的比较：取原代培养的骨髓基质细胞，分别加入转染指数25，50．100．200骨形态发生蛋白2腺病毒，以不加骨形态发生蛋白2腺病毒的骨髓基质细胞作为对照。6d后收集细胞，测定碱性磷酸酶活性。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较：实验分5组：骨髓基质细胞组，用Dulbecco改良的Eagle培养基培养9d；骨诱导培养3d组，骨诱导培养3d改用Dulbecco改良的Eagle培养基培养6d；骨诱导培养9d组，骨诱导培养9d；骨诱导培养3d＋骨形态发生蛋白2腺病毒组，骨诱导培养3d，加入转染指数50的骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d；骨形态发生蛋白2腺病毒组，用Dulbecco改良的Eagle培养基培养3d，加入同量骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d。收集细胞，测定碱性磷酸酶比活性。③骨形态发生蛋白2与骨桥蛋白检测：采用免疫组织化学染色与蛋白印迹方法。实验采用拉丁方设计。结果：应用骨诱导培养基或转染骨形态发生蛋白2腺病毒均使细胞碱性磷酸酶比活性明显增加（P〈0．05）。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞碱性磷酸酶比活性的比较：骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=50）组碱性磷酸酶比活性显著高于骨髓基质细胞组和骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=25，100，200）组[（7658．53&;#177;1600．32）比（1932．89&;#177;665．30），（4311．53&;#177;1108．89），（5360．90&;#177;1374．61）．划内（2661．86&;#177;653．46）nkat／（g&;#183;L），P〈0．011。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较：骨诱导培养3d＋骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=50）组与骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=50）组差异无显著性（P〉0．05），显著高于骨诱导培养3d组和骨诱导培养9d组（P〈0．05）。③骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白检测结果：骨诱导培养3d＋骨形态发生蛋白2腺病毒组两指标表达量均最高。结论：单纯用诱导Dulbecco改良的Eagle培养基以及先诱导培养再加入骨形态发生蛋白2腺病毒均可促进骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化，但是骨髓基质细胞用骨诱导培养基作用3d再加入骨形态发生蛋白2腺病毒能分泌表达更多的骨形态发生蛋白2，从而提高了目的基因表达的效应。     

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体的构建及鉴定

背景:内部核糖体进入位点序列载体能将上下游基因共同转录,故通过此载体可使连接在一起的人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2同时高表达,可为骨缺损的治疗提供新方法.目的:实验通过引入内部核糖体进入位点序列,采用基于attLXattR的λ噬茵体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应方法扩增人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2目的基因,将两个基因亚克隆至pIRES2-EGFP载体中,构建phBMP2-IRES-hFGF2载体,通过BP反应将hBMP2-IRES-hFGF2重组到载体pDONR221中,再通过LR反应将其转移到腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST中,线性化后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒Ad-hBMP2-IRES-hFGF2.结果与结论:phBMP2-IRES-hFGF2经酶切及测序鉴定正确,带hBMP2-IRES-hFGF2的载体在293细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,病毒滴度为2.82×1010 ifu/mL,证实成功构建了带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体.     

原核表达的重组人骨形态发生蛋白7增高牙槽嵴的实验

背景：牙齿缺失后，牙槽骨内成骨与破骨的动态平衡被打破，牙槽嵴呈现出不可逆转的骨吸收，其后果是大量的牙槽骨丢失；骨形态发生蛋白在骨及牙齿的生长发育和创伤修复中发挥重要作用。 目的：观察原核表达的重组入骨形态发生蛋白7对增强牙槽嵴的新骨形成、预防牙槽嵴吸收的作用。 设计：对照实验。 单位：济南市口腔医院正畸科，山东省医学科学院。 材料：实验于2003—06／2004—12在山东省医学科学院完成，采用新西兰大白兔28只，雌雄不限，体质量平均2kg。 方法：采用大白兔建立动物拔牙创模型，将大白兔分别拔除左、右下门牙，将骨形态发生蛋白7复合载体2块40μg植入右下门牙（为实验组），仅含磷酸盐缓冲液的空载体2块40μg植入左下门牙（为对照组），术后2，4，8及12周处死动物，取标本进行扫描电镜分析、钙含量及碱性磷酸酶活性测定。主要观察指标：①扫描电镜分析结果。②碱性磷酸酶活性及钙含量。 结果：①电镜照片结果：实验组的骨创愈合比对照组提前4～6周。②碱性磷酸酶活性：实验组均明显高于对照组[2周：（38．191&;#177;5．384），（19．821&;#177;2．084）μkat／g；4周：（160．815&;#177;9．669），（126．709&;#177;1．634）μkat／g；8周：（378．892&;#177;13．086），（225．212&;#177;1．884）μkat／g，P〈0．011。③钙含量：实验组均明显高于对照组[2周：（5．592&;#177;0．110），（0．913&;#177;0．064）mg／g；4周：（8.654&;#177;0．177），（1．702&;#177;40.071）mg／g；8周：（25326&;#177;0.287），（5980&;#177;0．145）mg／g．P〈0．01]。 结论：原核表达重组人骨形态发生蛋白7具有良好的增高牙槽嵴、促进拔牙创愈合的作用。     

骨形态发生蛋白在骨组织工程中的临床应用

目的:总结近年来骨形态发生蛋白在骨组织工程中应用研究的文献,阐明骨形态发生蛋白在骨科的临床应用前景及尚待解决的问题。资料来源:应用计算机检索Medline 1997-01/2005-12期间与骨形态发生蛋白在骨科临床试验研究有关的文章,检索词“BMP,fracture,bone”,并限定文章语言种类为“English”。同时检索清华同方中文系列数据库2000-01/2005-12期间相关文章,检索词“骨形态发生蛋白”。资料选择:对资料进行初筛,选取近年发表的针对性强的文献,同一领域的文献则选择近期发表或权威杂志的文章,排除较陈旧的和重复研究的文章。资料提炼:收集到54篇相关文章,其中35篇属于重复性研究文献,对其余19篇进行分类整理用于综述。资料综合:①骨形态发生蛋白具有促成骨活性:骨形态发生蛋白具有强大的促成骨活性,能够诱导间充质细胞不可逆地分化为骨、软骨组织。②骨形态发生蛋白用于治疗新鲜骨折、骨不连、股骨头坏死及脊柱融合的临床试验:美国食品和药物管理局于2004年认可骨形态发生蛋白2与可吸收胶原海绵复合物用于临床治疗开放性胫骨骨折,2001年正式批准骨形态发生蛋白7植入物(3.5mg骨形态发生蛋白7与1g胶原载体复合)上市用于治疗长骨骨不连,2002年批准美敦力公司的INFUSE/LT-CAGE腰椎融合装置用于前路腰椎融合。③骨形态发生蛋白的载体材料及基因治疗:目前骨形态发生蛋白仍没有最理想的载体,需要根据临床要求选择合适的材料,并对载体材料进行大量的试验研究以不断改进;基因治疗与直接应用骨形态发生蛋白同样具有促进骨缺损修复的能力,且前者具有后者所不具备的一些特点。结论:骨形态发生蛋白在一些国家已进入大规模的临床实验阶段,展现出良好的应用前景。骨形态发生蛋白的载体尚需不断改进。骨形态发生蛋白的基因治疗方法在动物实验阶段已初显成效,用于临床还需研究的进一步深入。     

骨形态发生蛋白2在骨修复中的应用

目的：回顾分析近年来国内外有关骨形态发生蛋白2在骨修复中应用的研究近况。 资料来源：应用计算机检索Medline1999-01／2005-06相关骨形态发生蛋白2的文献，检索词“bone morphogenetic protein-2．bone tissue engineering，gene therapy”并限定文献语言种类为English。同时计算机检索CNKI中文数据库1999-01／2005-06相关骨形态发生蛋白2的文献，检索词为“骨形态发生蛋白2，骨组织工程，基因治疗”。并限定文献语言种类为中文。 资料选择：对资料进行初审，选出包含研究目的的文献，筛选与目的有关的文献。纳入标准：①骨修复与骨组织工程。②骨形态发生蛋白2。排除标准：①文献中重复研究和综述文章。②Meta分析类文章。资料提炼：共收集到中文文献67篇，英文文献55篇，另有英文摘要近百篇。符合标准的文章15篇。排除的文献多为重复研究或非骨组织工程研究。 资料综合：骨形态发生蛋白2可诱导间充质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞而促进新骨形成，并具有强大的异位成骨作用。载体或基因释放的骨形态发生蛋白2可有效修复骨缺损。骨形态发生蛋白2的基因治疗研究为修复骨缺损提供了新途经。 结论：应用骨形态发生蛋白2修复骨缺损是肯定可行的，但方法有待进一步研究。