卡氏肺孢子菌55kDa抗原的原核表达与纯化

目的体外扩增卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,Pc)55kDa抗原(p55)570bp的基因片段,构建原核表达载体pGEX-570,诱导表达并纯化重组蛋白。方法以卡氏肺孢子菌DNA为模板,扩增其基因片段,连接至pGEM-T载体,随后构建pGEX-570重组表达质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定后将其转化入BL21大肠杆菌中,经IPTG诱导表达融合蛋白。采用透析袋电泳法纯化融合蛋白。结果重组表达质粒pGEX-570经酶切,PCR鉴定及测序结果表明构建成功。IPTG诱导表达融合蛋白GST-p55/570,分子量约为47kDa。用透析袋电泳法纯化重组蛋白,经SDS-PAGE确认正确。结论本研究成功构建了pGEX-570原核表达载体,诱导表达并纯化GST-p55/570融合蛋白。为进一步开展肺孢子菌55kDa抗原的研究奠定了基础。     

阴道毛滴虫TPI基因克隆及原核表达

目的构建阴道毛滴虫TPI基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。方法根据阴道毛滴虫TPI基因开放阅读框设计并合成特异性引物,以阴道毛滴虫总cDNA为模板PCR扩增目的片段,与pMD-18-T连接构建克隆载体pMD-TPI,经双酶切回收目的片段,与表达载体pGEX-T连接,构建原核表达载体pGEX-TPI,经IPTG诱导后通过SDS-PAGE及Western blot鉴定表达产物。结果成功构建了阴道毛滴虫TPI基因原核表达载体pGEX-TPI;SDS-PAGE电泳显示,在IPTG诱导下重组质粒转化菌高效表达分子质量单位为27.5ku的蛋白质;Western blot显示表达产物可被抗阴道毛滴虫的多克隆血清识别。结论成功构建了TPI基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,为进一步研究阴道毛滴虫TPI基因功能奠定了基础。     

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF的构建及其表达

目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株总RNA为模板,自行设计引物,采用RT-PCR方法扩增OprF抗原编码基因,经酶切、连接后定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 RT-PCR扩增出1 016 bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切和测序鉴定证实OprF基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析表达产物分子质量单位约为61 ku,与预期结果一致,表达的蛋白质占菌体总蛋白的16%;Western blot鉴定重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别。结论成功构建了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,该质粒在E.coliBL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达及免疫反应性分析

目的构建甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白,并对表达蛋白的免疫反应性进行分析。方法人工合成A/California/05/2009 H1N1流感病毒的HA基因,以合成基因为模板,通过PCR方法扩增出去除信号肽的HA部分基因片段,然后将去除信号肽的HA基因克隆至pET30a(+)原核表达载体中,构建出原核表达质粒,再将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达菌株;重组菌经IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析,Western blot分析表达产物的免疫反应性。结果获得了HA基因的原核表达重组菌,细菌经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约67.4 ku大小的目的蛋白表达条带,Western blot结果显示,表达产物与人甲型H1N1流感患者阳性血清具有反应性。结论成功表达出甲型H1N1流感病毒的HA蛋白,该蛋白具有良好的免疫反应性,为甲型H1N1流感的快速诊断方法的建立提供了生物材料。     

粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达纯化粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白,为粪肠球菌心内膜炎的致病机制研究及临床血清学诊断奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增efaA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-efaA重组质粒。经BamhI、XhoI酶切及测序鉴定,将pET30a-efaA质粒转化入BL21(DE3)。以IPTG诱导BL21(DE3)表达efaA融合蛋白,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。结果PCR体外扩增efaA基因产物约943bp,重组表达质粒pET30a-efaA在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和层析获得纯化重组蛋白。SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为34kd。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化。     

嵌合KGDS基序的蜱抗凝血肽突变体基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 设计含赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸基序（KGDS）的蜱抗凝血肽（TAP）突变体基因序列,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中与硫氧还蛋白（Trx）融合表达,以获得Trx-TAP-KGDS融合蛋白。方法 人工合成目的基因,定向克隆于含Trx基因的高效原核表达载体pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-TAP-KGDS,并转化BL21感受态菌,以PCR及双酶切鉴定阳性克隆;含正确重组质粒的工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果 重组质粒经PCR及双酶切鉴定,均获得约209 bp的基因片段,与预期大小一致;SDS-PAGE分析显示,含重组质粒的工程菌在IPTG的诱导下高效表达分子质量单位约为24 ku的蛋白质,该蛋白以水溶性形式为主。结论 构建了含KGDS基序的TAP突变基因的原核表达载体pET32a（＋）-TAP-KGDS,并成功进行了融合表达,为进一步研究其抗凝血活性打下了基础。     

结核分枝杆菌Mtb8.4-Hspx和Hspx-Mtb8.4重组基因克隆及表达

目的构建结核分枝杆菌去标签重组蛋白Mtb8.4-Hspx(MH)和Hspx-Mtb8.4(HM)原核表达载体,并在大肠埃希菌株BL21(DE3)中表达。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增Mtb8.4、Hspx基因,产物经纯化后与载体PET30a连接、转化及测序鉴定,构建原核重组表达质粒PET30a-Mtb8.4和PET30a-Hspx。抽提重组质粒,产物经纯化后与目的基因Hspx、Mtb8.4连接,转化及测序鉴定,构建重组目的基因质粒PET30a-Mtb8.4-Hspx(PET30a-MH)和PET30a-Hspx-Mtb8.4(PET30a-HM)载体,转化大肠埃希菌BL21,以IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测表达产物。结果 SDS-PAGE蛋白电泳验证去标签MH和HM融合蛋白分子质量单位为28 ku,与预期值相符。结论本研究成功表达去标签结核杆菌重组蛋白MH和HM,为结核亚单位疫苗免疫原性和临床前研究奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫疫苗候选基因在大肠杆菌中的表达

目的构建柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原原核表达载体，并且在大肠杆菌中表达。方法将本室构建的pMD-Mz5-7克隆质粒酶切回收目的片段定向亚克隆到pET-28b( )载体上，构建成原核表达载体pET-28b-Mz5-7，酶切鉴定正确后，在Escherichia coli BL21(DE3)中用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果成功构建了目的抗原基因的原核重组表达质粒pET-28b-Mz5-7，IPTG诱导表达该融合蛋白，SDS-PAGE电泳表明，其能表达一分子质量约为37ku的融合蛋白，与预测分子质量相符，最佳反应条件为1mol／LIPTG诱导4h后表达量最高。薄层扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的18％，Western blotting结果显示，表达产物可被抗柔嫩艾美尔球虫的多克隆抗体识别，说明该融合蛋白具有很好的反应原性。结论在原核细胞融合表达Mz5-7成功，为鸡球虫病重组苗的研究奠定了基础。     

类鼻疽伯克霍尔德菌AraC转录因子基因的原核表达及纯化北大核心CSCD

目的从海南类鼻疽伯克霍尔德菌菌株BPHN001中克隆得到AraC转录因子基因,构建类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)AraC转录因子基因原核表达质粒,对该转录因子基因进行原核表达,并对表达产物进行纯化。方法根据AraC转录因子基因设计特异性扩增引物,将PET-28a(+)质粒和扩增得到的AraC转录因子基因产物同时用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,构建带His标签的重组质粒。经测序验证后,将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),采用最佳浓度IPTG进行诱导,采用SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。通过Ni^(2+)柱纯化目的蛋白,采用Western blot检测纯化蛋白的免疫反应性。结果特异性引物扩增得到的产物大小约为1000 bp,与目的基因片段1032 bp基本一致。将扩增产物与PET-28a(+)载体连接后测序,与预期完全一致。重组载体转化BL21(DE3)后用最适IPTG浓度(0.5 mmol/L)诱导过夜(约16 h),SDS-PAGE检测表达产物分子质量在40~55 ku之间,与预期相符。表达蛋白纯化后进行Western blot,能被相应抗体识别。结论成功克隆得到AraC转录因子基因,,构建的含AraC转录因子基因原核表达载体转化DE3后经IPTG诱导可表达出融合蛋白,经Ni^(2+)柱纯化得到具有免疫反应原性的AraC转录因子蛋白,为AraC转录因子的功能研究奠定了基础。     

弓形虫RH株膜蛋白P30的原核表达与鉴定

目的在E.coli中表达弓形虫RH株膜蛋白P30。方法将P30基因定向克隆到pET28b,构建含目的基因的pET28b-P30重组质粒,转化E.coliBL21(DE3),接种含pET28b-P30的BL21(DE3)单菌落于LB培养基,1∶100稀释后用0.2mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定诱导表达产物。结果1构建了重组质粒pET28b-P30,2在E.coli中表达了一分子量约为30kDa的融合蛋白,经Westernblot鉴定正确。结论在E.coli中高效表达了弓形虫RH株膜蛋白P30,并以包涵体形式存在。     

新孢子虫NcSAG4基因克隆及原核表达

目的构建新孢子虫NcSAG4基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。方法根据新孢子虫NcSAG4基因序列设计特异性引物,以新孢子虫总核酸为模板PCR扩增目的片段,与pMD-18-T连接,构建克隆载体pMD-NcSAG4,经双酶切后回收目的片段,与表达载体pGEX-T连接,构建原核表达载体pGEX-NcSAG4,用IPTG诱导,通过SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果成功构建了新孢子虫NcSAG4基因原核表达载体pGEX-Nc-SAG4;SDS-PAGE电泳显示,在IPTG诱导下阳性菌高效表达了分子质量单位为18.79ku的蛋白质;Western blot显示表达产物可被抗新孢子虫的多克隆血清识别。结论成功构建了NcSAG4基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,为建立经济、实用的诊断新孢子虫病的ELISA方法奠定了基础。     

巨型艾美耳球虫ADF基因的克隆及原核表达

目的克隆巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)的ADF基因,并进行原核表达。方法采用RT-PCR方法扩增ADF基因,并将其与原核表达载体pET-28a连接,构建原核表达载体pET-28a-ADF,转化入大肠埃希菌Rossata(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定结果正确。表达分子质量单位为17ku的融合蛋白。Western blot检测融合蛋白能被抗E.maxima多克隆抗体识别。结论构建的原核表达载体pET-28a-ADF能表达具有反应原性的蛋白,为其免疫原性研究奠定了基础。     

重组人psoriasin蛋白的制备与鉴定

目的制备鉴定人psoriasin重组蛋白,为其作用机制的深入研究奠定基础。方法PCR法扩增人psoriasin基因,克隆至pET28原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达,用Ni2＋-NTA凝胶亲和层析纯化目的蛋白,用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot法对重组蛋白的相对分子质量、纯度和免疫原性进行分析。结果psoriasin编码区基因扩增得到一306 bp特异条带,BLAST分析显示碱基无突变,阅读框架正确;SDS-PAGE显示纯化出相对分子质量为14 kD的重组psoriasin,纯度〉95%;Western blot显示该重组蛋白能与抗人psoriasin单克隆抗体发生特异性反应。结论psor-iasin重组蛋白成功制备,该蛋白具有较好的免疫活性,可用于进一步的研究。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,观察该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST-Sj32融合基因,克隆至大肠埃希菌原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹法对表达产物进行分析和鉴定.结果 基因拼接法扩增出长度约1991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约69×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的25%;Western印迹法鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.

Abstract：

Objective To construct and express the recombinant plasmid pET28α-Sj26GST-Sj32 of Schistosoma japonicum(Sj) in Escherichia coli BL21 (DE3). Methods Total RNA was extracted from Sj adult worms by ultrasound-breaking, Sj26GST and Sj32 antigen gene was respectively amplified by RT-PCR from the total RNA; Sj26GST-Sj32 fusion gene obtained with gene splicing by overlap extension(SOEing) was cloned into prokaryotic expression plasmid pET28α and transformed into Escherichia coli BL2 (DE3) to construct pET28α-Sj26GST-Sj32;BL21 (pET28α-Sj26GST-Sj32) was induced with isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), and the expressed products were analyzed and identified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis (SDS-PAGE)and Western blotting. Results The 1991 bp Sj26GST-Sj32 fusion gene was successfully amplified by gene SOEing and cloned into pET28α by restriction analysis and PCR identification, the recombinant plasmid pET28α-Sj26GST-Sj32 was successfully constructed; the relative molecular mass of the expressed recombinant protein was approximately 69 × 103 by SDS-PAGE, and the amount of the expressed protein was 25% of the total bacterial proteins; the fusion protein could be recognized by sera from rabbits infected with Sj by Western blotting.Conclusions The recombinant plasmid pET28α-Sj26GST-Sj32 is successfully constructed and highly expressed in Escherichia coli in fused form with His-tag, and the expressed fusion protein shows specific antigenicity.     

汉坦病毒Hunan03株S基因克隆、表达及核蛋白免疫原性分析

目的构建汉坦病毒Hunan03株核蛋白基因原核重组表达载体,在大肠杆菌中进行核蛋白表达,研究核蛋白的免疫性及免疫反应性。方法设计特异性扩增汉坦病毒Hunan03株S基因完整开放阅读框(ORF)的引物,RT-PCR扩增,产物克隆到pGM-T载体,转化感受态细胞TOP10,应用蓝白斑筛选、酶切、PCR鉴定,定向克隆到pGEX-6p-2原核表达载体,转化Ecoli.BL21 Star^TM(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot对重组蛋白进行鉴定。应用Glutathione Sepharose 4B纯化柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,建立间接ELISA法对核蛋白的免疫原性与免疫反应性进行评价。结果PCR扩增S基因ORF区域产物大小约1 306 bp,重组载体pGEX-6p-2-S经双酶切、PCR、测序鉴定提示构建成功;在37 ℃,IPTG浓度为0.8 mmol/L诱导5 h的条件下,表达出最高量的相对分子量约74 kDa的GST-NP融合蛋白。建立的间接ELISA法检测GST-NP融合蛋白免疫后的新西兰兔血清,IgM抗体滴度达1∶8 000,IgG抗体滴度达1∶16 000。结论成功构建了高效表达的汉坦病毒S基因重组表达载体,获得了纯度较高具有较好的免疫原性与免疫反应性的核蛋白,为后续汉坦病毒单克隆抗体的制备奠定了基础。     

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体，并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a（＋）载体上，构建原核表达载体pET-28a—Ts43，酶切鉴定正确后，导入菌株Rosetta中，用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a—Ts43，IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白，与预测值相符。以0．9mmol／LIPTG诱导4．5h后表达量最高，薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20％。Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功，为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶重组质粒的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)重组质粒pET32α-Sj26GST,观察该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32α(+),构建pET32α-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot 对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET32α(+)中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为49×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了pET32α-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

4种血清型登革病毒多表位重组抗原的表达及血清学初步评价

目的在原核表达系统中对登革病毒包膜蛋白(E蛋白)和非结构蛋白1(NS1)融合的B细胞抗原表位进行表达、纯化及血清学评价。方法将B细胞抗原表位用形成α螺旋的连接肽(EAAAK)2作为接头,串联合成1条全新的多表位融合重组基因rE,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达融合蛋白,用镍柱对重组蛋白纯化,并用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。以融合蛋白为抗原,用间接ELISA检测登革热病人血清IgM抗体。结果重组表达载体pET28a-rE构建成功,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,用镍柱纯化获得高纯度的目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示蛋白分子量大小与预期结果相符,建立的间接ELISA具有较高的准确性。结论原核表达的登革病毒多表位融合蛋白具有良好的血清学检测价值。